Штам вірусу кліщового енцефаліту flavivirus encephlitidem ixodicum № 2288 для виготовлення специфічних імунобіологічних препаратів

Винахід відноситься до медичної вірусології, а саме до лабораторної діагностики і профілактики захворювань, що викликаються вірусом кліщового енцефаліту. На сьогодні відомі кілька штамів вірусу кліщового енцефаліту, які використовуються для виготовлення діагностичних та лікувально-профілактичних препаратів, серед яких найбільш широко вживаними для цих цілей в країнах колишнього Радянського Союзу є штами "Соф'їн", "Абсеттаров", "Пан", N205 та інші [1]. В Україні в природних вогнищах кліщового енцефаліту циркулюють відмінні від вищезгаданих штамів збудники цієї інфекції, що спричиняють спорадичні та масові спалахи захворювання серед населення [2, 3]. Однак, промислове виготовлення специфічних імунобіологічних препаратів із місцевих штамів до цього часу не налагоджено. Недоліком згаданих "сибірських" штамів арбовірусів є нижча їх авідність та специфічність у порівнянні із місцевими штамами, що негативно відображується на антигенній активності та профілактичній ефективності виготовлених із них препаратів при застосуванні їх в Україні. Завданням винаходу є новий оригінальний штам вірусу кліщового енцефаліту, що є етіологічним чинником захворювань людей в Україні і потенційним кандидатом для виготовлення імунобіологічних препаратів для діагностики та профілактики даної інфекції. Вирішити це завдання можливо шляхом використання штаму N 2288 вірусу кліщового енцефаліту, ізольованого у Львівському НДІ епідеміології та гігієни від кліщів Ixodes ricinus, зібраних в активному природному вогнищі цього вірусу у Великоберезнівському районі Закарпатської області в 1977 році [2]. Даний штам, депонований у всесоюзну колекцію вірусів Інституту вір усології ім. Д.Й. Івановського АМН СССР (м. Москва), (депозит ГКВ № 726 від 24.10.1985 р.), зберігається в колекції вірусів лабораторії трансмісивних вірусни х інфекцій Львівського НДІ епідеміології та гігієни, яка згідно Постанови Кабінету Міністрів України №1709 від 19.12.2001 р. віднесена до наукових об'єктів, що становлять національне надбання України. Серологічне обстеження хворих на кліщовий енцефаліт та осіб, що перехворіли на дану інфекцію, на прикладі захворювань в період з 1995 до 1999pp. у Волинській області показало, що в 84% випадках виявлено антитіла до штаму 2288, в той час як до прототипних штамів Соф'їн та Абсеттаров ці показники становили відповідно 68% і 72%. Високим виявився зареєстровано і рівень напруженості імунітету до штаму 2288 порівняно із вказаними прототипами. Середньоарифметичні титри антитіл до штаму 2288 складали 1:48,7, тоді як до штамів Соф'їн та Абсеттаров вони коливались від 1:23,8 до 1:34,2. Ці дані свідчать про більшу спорідненість до циркулюючих в Україні збудників кліщового енцефаліту штаму 2288, ніж його "сибірських" різновидностей, домінуючу його етіологічну роль у виникненні та розповсюдженні цієї інфекції в Україні та порівняно вищу його імуногенність і специфічність в серологічних реакціях, зв'язку з чим виготовлення діагностикумів та вакцин на основі пропонованого штаму є актуальною та необхідною умовою ліквідації даного захворювання. Штам 2288 відноситься до родини Flaviviridae, роду Flavi virus, західного підтипу комплексу кліщового енцефаліту і характеризується наступними ознаками. Він високопатогенний для лінійних і безпородних дорослих та новонароджених білих мишей. При зараженні викликає типову картину експериментального енцефаліту з інкубаційним періодом при внутрішньомозковому шляху зараження 3-5 днів (максимальний титр 8,52 lg LD50/0,02мл), при внутрішньоочеревинному шляху зараження - 4-7 днів, (максимальний титр 7,7 lg LD50/0,05мл). Індекс інвазивності - 0,82. Порівнюючи ці дані із аналогічними показниками штамів Соф'їн та Пан, наведеними в таблиці 1, можна зробити висновок, що штам 2288 відносится до високовірулентних штамів даної групи вірусів. Таблиця 1 Характеристика штамів вірусу кліщового енцефаліту за ступенем вірулентності для сисунків білих мишей Штами Сприйнятливість в% Інкубаційний період в Нейровірулентність lg LD50/0,02мл Індекс Інвазивності днях MNic mNsc 2288 100 3-5 8,52 7,7 0,82 Соф'їн 100 3-4 8,5 7,5 1,0 Пан 100 3-5 8,0 7,1 0,9 Примітки: 1. mNic - внутрішньомозкове інфікування. 2. mNsc - підшкірне інфікування. При ініфікуванні курячих ембріонів в жовточний мішок 10-кратними розведеннями штаму N 2288 ембріони гинули на 3-4 день, при цьому титр вірусу сягав понад 8 lg LD50 в 0,1мл. Штам N 2288 добре розмножується в перещеплюваній культурі клітин СНЕВ, викликаючи чітку деструкцію клітин на 3-4 добу. Пік накопичення інфекційної і гемаглютинуючої активності спостерігається на 4 добу. Титр вірусу в культуральній рідині при цьому становить 8,0 lg LD50 в 0,02мл. Титр по тканинній цитотоксичній дозі (ТЦД) корелює із показником інтрацеребральної активності і становить максимально 9,2 lg ТЦД50 в 0,1мл. Гемаглютинуюча активність пропонованого штаму при репродукції в мозку мишей становить 1:320 -1:1280 в зонах рН 6,2-6,6. Оптимальне значення рН-6,5. В реакції біологічної нейтралізації штам N 2288 нейтралізується гомологічною сироваткою і сироватками до інших штамів вірусу кліщового енцефаліту. Індекс нейтралізації із гомологічною сироваткою - 3,9 lg. Із сироваткою до штаму Со ф'їн він складає 2,4 lg, до штамів Абсеттаров, Пан, Скаліца - 2,6-2,9 lg. Антигенні властивості штаму N 2288 вивчені і в реакціях зв'язування комплементу (РЗК), гальмування гемаглютинації (РГГА) та непрямої імунофлюоресценції (РНІФ). Встановлено, що штам N 2288 володіє значно вищою антигенною активністю порівняно із штамами Соф'їн та Абсеттаров і щонайменше в 2 рази перевищує за титрами комерційний антиген кліщового енцефаліту виробництва Томского НПО "Віріон" (С.81, К.1751). Так, в перехресній РЗК при дослідженні гіперімунних сироваток та імунних асцитичних рідин безпородних білих мишей до вказаних серотипів вірусу кліщового енцефаліту з'ясовано, що середньогеометрична величина титрів антитіл в цих матеріалах при використанні штаму 2288 становить 1:57,3, штаму Соф'їн - 1:28,8, штаму Абсеттаров - 1:37,7. Ці результати свідчать про чітку відмінність антигенної структури місцевого штаму вірусу від "східного" та "західного" його прототипів. Виражені відмінності штаму 2288 від штаму Соф'їн виявлені і при вивченні їх фізико-хімічних властивостей . Як видно із даних таблиці 2 індекси інактивації (різниця між контрольним титром і титром після обробки) місцевого штаму ефіром (2,8), дезоксихолатом натрію (2,0), ацетоном (3,0), підвищеною до +50°С температурою (1,8) виразно відрізнялися від аналогічних показників "сибірського" штаму і вказують при цьому на більшу стійкість першого варіанту до дії фізико-хімічних факторів. Таблиця 2 Результати вивчення фізико-хімічних властивостей штамів вірусів кліщового енцефаліту в культурі клітин СНЕВ Штами 2288 Соф'їн Контрольний титр* 9,2 8,7 Після обробки ефіром** 6,4 /2,8 5,2 /3,5 Після обробки ДХNa** 7,2 /2,0 5,2 /3,5 Після обробки ацетоном** 6,2 /3,0 5,0 /3,7 Після термоінактивації** 7,4/1,8 6,1/2,6 Примітки: 1. * - lg ТЦД50 0,1мл. 2. ** - в чисельнику титр після обробки, в знаменнику індекс інактивації. Накопичення біомаси штаму N 2288 вірусу кліщового енцефаліту здійснюється класичним способом шляхом пасажування вірусвмісного матеріалу в живих чутливи х системах, в тому числі в організмі лабораторних мишей, що можна проілюструвати наступним прикладом. Безпородних білих мишей вагою 6-8 грамів заражають у мозок по 0,03мл вірусною суспензією штаму N 2288. При появі виражених паралічів на 4-5 добу мишей забивають за правилами евтаназії, добувають асептичне мозок і готують 10% завісину мозкової тканини шляхом розтирання мозку у фар форовій ступці із додаванням фізіологічного розчину. Отриману завісину мозкової тканини центрифугують при 1000-1500об/хв протягом 10хв. Рідину, що утворилась над осадом, використовують для зараження наступної партії мишей, інфікований мозок котрих використовується для приготування діагностикуму, вакцини чи інших цілей. Таким чином, штам N 2288 вірусу кліщового енцефаліту, спричиняючи захворювання людей в Україні, проявляючи максимальну спорідненість з іншими циркулюючими в Україні такого ж роду збудниками, має суттєві відмінності по ряду біологічних та фізико-хімічних показників від існуючих "промислово-комерційних" прототипів, проявляючи при цьому високу специфічність, антигенну, імуногенну та репродуктивну активність і відповідає регламентованим параметрам відбору штамів-кандидатів для виробництва імунобіологічних препаратів. Використання цього штаму для виготовлення специфічного діагностикуму та культуральної вакцини дозволить суттєво підвищити відповідно достовірність діагностики та ефективність профілактики захворювань кліщовим енцефалітом в Україні. Джерела інформації 1. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я./УАрбовирусы и арбовирусные инфекции. - М.: Медицина, 1989. - 335с. 2. Виноград И.А. Арбовирусы в Украинской ССР и их медико-биологическое значение: Дис. ... д-ра мед. наук. - Львов, 1983." 505с. 3. Лозинський І.М., Виноград І.А. Арбовіруси та арбовірусні інфекції у лісостеповій зоні України// Мікробіол.журнал. - 1998. - т. 60, № 2. - С.49-60.