Спосіб кріоконсервування гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини

Винахід належить до галузі кріобіології і може бути використаний для приготування клітинних препаратів. Відомий спосіб кріоконсервування гемопоетичних клітин кісткового мозку, що включає заморожування в розчині Хенкса з 20% ембріональної телячої сироватки і 10% диметилсульфоксиду (ДМСО), відігрів на водяній бані при 37°С і відмивання клітин розчином Хенкса [1]. Недоліком такого способу є присутність сироватки в розчині для заморожування, що є імуногеною і неприпустимою для клітинних препаратів. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб кріоконсервування гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини (ГКЕПЛ), відповідно до якого клітинну суспензію заморожують у розчині Хенкса з кріопротектором ДМСО, разморожують на водяній бані при 37°С і відмивають клітини від кріопротектора розчином Хенкса [2]. Недоліком цього методу є втрата значної частини (40-45%) життєздатних клітин. Задачею винаходу є створення способу кріоконсервування гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини, який би дозволив підвищити вихід життєздатних клітин. Ця задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини, який включає заморожування клітинної суспензії в розчині кріоконсервування з кріопротектором ДМСО, відігрів і відмивання клітин від кріопротектора, відповідно до винаходу, для заморожування і відмивання клітин використовують збалансований ізотонічний сахарозо-сольовий розчин. Збалансований ізотонічний сахарозо-сольовий розчин відрізняється від розчину Хенкса тим, що основним компонентом, що забезпечує фізіологічні показники осмотичного тиску, є сахароза, а не натрію хлорид. Використання збалансованого ізотонічного сахарозо-солевого розчину для заморожування і відмивання від кріопротектора ГКЕПЛ дозволяє знизити втрату життєздатних клітин на 17%. Сахароза є речовиною, розчини якої дозволено для внутрішньовенного введення, тому її внесення в організм людини в складі клітинної суспензії, кріоконсервованої на основі сбалансованого ізотонічного сахарозо-сольового розчину, не може викликати негативних наслідків. Спосіб пояснюється наступним прикладом. Приклад. Гемопоетичні клітини одержували з ембріональної печінки людини 6-12-тижнів гестації. Печінку дисоцюювали на одиночні клітини, фільтрували через систему для переливання крові. Отримані клітини розводили стерильним сахарозо-сольовим розчином, що містить 280 мМ сахарози і мікродобавки солей (5мМ КСl, 1мМ СаСl2, 0,8мМ Mg SO4*7Н2О, 5мМ Nа2НРO4*Н2О і 1,5мМ КН2РO4, рН=7,2) і додавали кріопротектор ДМСО до кінцевої концентрації 5%. Через 15-20хв клітини заморожували на програмному заморожувачі. Заморожування здійснювали до температури кристалізації зі швидкістю 1°/хв до - 40°С, витримуючи 10хв на плато кристалізації, потім - зі швидкістю 10°/хв до -80°С з наступним зануренням у рідкий азот. Розморожування виконували на водяній бані при 37°С протягом 1-1,5хв. Кріопротектор видаляли шляхом повільного розведення клітинної суспензії новою порцією стерильного ізотонічного сахарозо-сольового розчину (рН=7,2), що містить 280 мМ сахарози і мікродобавки солей (5мМ КСl, 1мМ СаСl2, 0,8мМ Mg SO4*7H2O, 5мМ Na2HPO4*H2O і 1,5мМ КН2РO4) з кінцевим розведенням суспензії клітин у 10 разів. Після центрифугування (200g), протягом 10 хвилин супернатант видаляли, а осад переводили в 1 мл розчину відмивання. Стійкість клітин ембріональної печінки людини до і після кріоконсервування оцінювали за вітальним фарбуванням трипановим синім і бромістим етидієм. Кількість клітин підраховували в камері Горяєва. Життєздатність визначали як відношення кількості життєздатних клітин до загальної кількості клітин і виражали у відсотках. Утрату клітин у ході процесу кріоконсервування оцінювали за виходом життєздатних клітин (ВЖК). ВЖК визначали як відношення кількості життєздатних клітин після відігрівання і відмивання від кріопротектора до загальної кількості клітин до кріоконсервування, виражали у відсотках. Результати наведені в табл. 1 і 2 у порівнянні з прототипом. Як видно з наведених даних, життєздатність ГКЕПЛ не відрізняється в зразках після кріоконсервування заявлюваним способом і відповідно до прототипу. Але при цьому вихід життєздатних клітин вище в середньому на 17% у випадку кріоконсервування ГКЕПЛ способом, що заявляється. Таблиця 1 Вміст життєздатних ГКЕПЛ до кріоконсервування (n=6) Розчин кріоконсервування Розчин Хенкса Сахарозо-сольовий розчин Життєздатність,% 90,2±3,1 89,5±2,4 Таблиця 2 Вміст життєздатних ГКЕПЛ після кріоконсервування (n=6) Спосіб Вихід Життєзда кріоконсерву життєздатних тність,% вання клітин,% За прототипом 62,5±8,0 42,5±7,7 Заявлюваний 63,7±8,5 59,7±7,2* *- різниця достовірна відносно до прототипу, р