Спосіб кріоконсервування гемопоетичних клітин

Спосіб крюконсервування гемопоетичних клітин шляхом поетапного заморожування до 196°С в розчині консервування, що містить диметилсульфоксид, який відрізняється тим, що розчин консервування додатково включає 10 % поліетиленоксиду молекулярної маси 400, а вміст диметилсульфоксиду складає 2-3 % Винахід відноситься до медицини, зокрема кріобюлопі, і може бути використаний у трансплантологи Відомий спосіб крюконсервування гемопоетичних клітин у розчині консервування, який містить гліцерин [1] Однак гліцерин повільно проникає всередину клітин, у зв'язку з чим необхідна тривала експозиція клітин із крюпротектором, що призводить до їхнього ушкодження Найбільш близьким до заявлюваного є спосіб крюконсервування гемопоетичних клітин із крюпротектором диметилсульфоксидом (ДМСО) [2] Клітини занурюють у розчин, який містить 5-10 % ДМСО, шкубують у ньому протягом 15-20 хв і поетапно заморожують до -196°С спочатку зі швидкістю 1°С/хв до -40°С, витримують 10 хвилин, потім зі швидкістю 10°С/хв до -80°С із наступним зануренням у рідкий азот Недоліком способу є те, що використовувана концентрація ДМСО є токсичною Це призводить до зниження функціональної активності клітин вже на етапі еквілібрацм і, окрім того, потребує відмивання від крюпротектора перед трансфузією В основу винаходу поставлено задачу створити такий спосіб консервування гемопоетичних клітин, в якому шляхом зниження концентрації ДМСО забезпечувалася би можливість підвищити функціональну активність клітин Ця задача вирішується тим, що в способі крюконсервування гемопоетичних клітин шляхом поетапного заморожування до -196°С у розчині консервування, який містить ДМСО, розчин консервування додатково включає 10 % поліетиленоксида мм 400 (ПЕО-400), а вміст ДМСО складає 2-3 % ПЕО-400 є малотоксичною речовиною, дозволеною для внутрішньовенного введення, тому він не виявляє негативного впливу на організм людини Уведення 10 % ПЕО-400 у розчин консервування дає можливість знизити концентрацію ДМСО до 2-3 %, що забезпечує підвищення функціональної активності клітин на 20-25 % Спосіб здійснюють таким чином Гемопоетичні клітини, одержані з ембріональної печінки людини 6-12 тижнів гестацм, дисоціюють на поодинокі клітини і фільтрують через систему для переливання крові Одержані клітини розводять розчином Хенкса і додають розчин крюконсервування, який містить 2-3 % ДМСО і 10 % ПЕО-400 Через 15-20 хв клітини заморожують зі швидкістю 1°С/хв , витримують 10 хвилин на плато кристалізації, а потім заморожують зі швидкістю 10°С/хв до -80°С з наступним зануренням у рідкий азот (-196°С) Відігрівання здійснюють на водяній бані при 37-40°С Гемопоетичні клітини крюконсервували в середовищах, які містять різні концентрації (0-10 %) ДМСО в поєднанні з 10 % ПЕО-400 і без нього Після розморожування здійснювали підрахунок клітин у камері Горяєва, а також експлантацію в метилцелюлозне середовище, яке містило рекомбшантні ростові фактори, 10 нг/мл колонієстимулюючого фактора гранулоцитів і макрофагів, 10 1 00 ю 58997 нг/мл ІЛ-3, 50 нг/мл фактора стовбурових клітин і З од/мл еритропоетину) Результати тонування підраховували на 14-у добу культивування Сумарна КІЛЬКІСТЬ колонієформуючих одиниць (КФО) представлена в таблиці Таблиця КІЛЬКІСТЬ КФО після крюконсервування (п=6) Концентрація ДМСО, % КІЛЬКІСТЬ Без ПЕО-400 0 2 3 5 10 2±1 35±5 48±5 264±30 212±24 КФО 3 ПЕО-400 184±26 325±32 333±30 307±22 256±25 Із наведених у таблиці даних видно, що після крюконсервування клітин без крюпротекторів колони практично не формуються Після крюконсервування в розчині, який містить тільки ДМСО, максимальна КІЛЬКІСТЬ КФО відзначена при концентрації 5 % Подальше збільшення концентрації ДМСО призводило до зниження числа КФО Уведення 10 % ПЕО-400 до складу крюзахисного розчину призводило до істотного збільшення Комп'ютерна верстка М Клюкш КІЛЬКОСТІ КФО навіть у відсутності ДМСО Однак максимальна колонієформуюча активність у присутності 10 % ПЕО-400 відзначалась при концентраціях ДМСО 2-3 % Функціональна активність клітин у цьому випадку була на 23 % вищою, ніж у прототипі (5 % ДМСО) При наступному збільшенні концентрації ДМСО у присутності ПЕО-400 КІЛЬКІСТЬ КФО знижалась унаслідок токсичності ДМСО Таким чином, уведення 2-3 % ПЕО-400 до складу розчину консервування дає можливість знизити концентрацію ДМСО і за рахунок цього підвищити функціональну активність гемопоетичних клітин Окрім цього, після крюконсервування не потрібне відмивання клітин від крюпротектора Джерела інформації 1 Симонов Л И Влияние гемотрансплантаций эмбриональной кроветворной ткани на течение острой лучевой болезни крыс и определение жизнеспособности консервированных клеток// Вопросы трансплантации костного мозга при лучевом поражении - Ленинград, 1965-С 22-23 2 Е М Andersen et al Gestational age and cell viability determine the effect of frozen storage on human fetal HPC preparations // Fetal Diagn & Ther1996-11 -P 427-432 Підписано до друку 05 09 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна