Твердий пристрій для проведення мультианалітних аналізів, спосіб його формування і система, що включає такий пристрій

1 Твердий пристрій для проведення мультианалітних аналізів, який включає субстрат і множину дискретних реакційних сайтів, кожний з яких має ліганд, ковалентно зв'язаний з поверхнею субстрату, який відрізняється тим, що ділянки поверхні субстрату, які знаходяться між реакційними сайтами, є інертними по відношенню до аналіту, при цьому вказаний пристрій отриманий за допомогою процесу, що включає активування всієї вказаної поверхні субстрату, надання гідрофобності вказаним ділянкам між реакційними сайтами, і нанесення ряду лігандів на вказані дискретні ділянки поверхні у воді таким чином, що вказані ліганди не наносяться на вказані гідрофобні ділянки між реакційними сайтами 2 Пристрій по п 1, який відрізняється тим, що поверхня субстрату є нерівномірною 3 Пристрій по п 2, який відрізняється тим, що вказаний субстрат включає в себе ряд реакційних жолобків, виступів, стовпчиків, плям, камер, поглиблень, западин або виїмок 4 Пристрій по будь-якому з пп 1-3, який відрізняється тим, що субстрат складається з керамічного матеріалу, скла, кварцу або кремнію 5 Пристрій по будь-якому з пп 1-4, який відрізняється тим, що його площа складає менше за 1 см 2 6 Пристрій по будь-якому з пп 1-5, який відрізняється тим, що площа кожного реакційного сайта складає менше за 1 мм2 7 Пристрій по п 1, який відрізняється тим, що отриманий за допомогою процесу, що включає активування всієї вказаної поверхні субстрату, надання гідрофобності вказаним ділянкам між реакційними сайтами і нанесення ряду лігандів на вказані дискретні ділянки поверхні у воді таким чином, що вказані ліганди не наносяться на вказані гідрофобні ділянки між реакційними сайтами 8 Пристрій по п 7, який відрізняється тим, що він містить ліганди, нанесені на поверхню, активовану органосиланом 9 Пристрій по п 8, який відрізняється тим, що органосилан має формулу (RO)sSi - (СЬІ2)п - X, де кожний R являє собою пдрокарбильну групу, п ціле число, а X є функціональною групою 10 Пристрій по п 8 або 9, який відрізняється тим, що він містить біфункцюнально зшиваючий агент для полегшення ковалентного приєднання біологічних лігандів до органосилану 11 Пристрій по будь-якому з пп 8-10, який відрізняється тим, що як біфункцюнальний зшиваючий агент він містить фотолабільний зшиваючий агент, який використовують для реакції з органосиланом 12 Пристрій по п 1, який відрізняється тим, що він містить ліганди, іммобілізовані на поверхні, дериватизованій макромолекулами 13 Пристрій по будь-якому з пп 1-12, який відрізняється тим, що додатково включає ліганди, зв'язуючі матеріали, присутність яких заважає аналізу аналіту 14 Пристрій по п 1, який відрізняється тим, що для виявлення аналіту воно містить хемолюмінесцентну систему визначення з використанням пристрою із зарядовим зв'язком із заднім освітленням, придатну для виявлення світла, що випромінюється хемолюмінесцентною світловою реакцією, при якій довжина хвилі світла, що виявляється, складає менше за 450 нм 15 Пристрій по п 1, який відрізняється тим, що як аналіти воно містить антибіотики, гормони, маркери серцевих порушень, маркери інфекційних захворювань, маркери алергії, лікарські засоби ферментів, що зловживаються, віруси, нуклеотиди і пептиди 16 Пристрій по п 1, який відрізняється тим, що він містить аналіти, які вводять в зразки суцільної крові, сироватки, плазми, сечі, калу, жовчі, тканини або їжі 17 Система для мультианалітного аналізу, який О о о ю 54400 відрізняється тим, що включає пристрій по будьякому з пп 1-13, трансляційну платформу, систему для обробки зразка, систему для подачі рідкого реагенту, темну коробку з температурою, що контролюється, камеру пристрою із зарядовим зв'язком і прилад для обробки зображень 18 Пристрій по п 1, який відрізняється тим, що субстрат є керамічним 19 Пристрій по п 12, який відрізняється тим, що вказані макромолекули вибрані з групи, що складається з полістиролових латексних частинок, дендримерів і поліетиленгліколю, що містить ХІМІЧНІ групи, що полегшують ковалентне приєднання лігандів 20 Спосіб проведення мультианалітного аналізу, що полягає в тому, що вводять зразок, що піддається мультианалітному аналізу, в контакт з пристроєм по п 1 і визначають реакційні сайти, в яких аналіт зв'язаний і/або незв'язаний 21 Спосіб формування твердого пристрою для проведення мультианалітних аналізів, який включає субстрат і множину дискретних реакційних сайтів, кожний з яких має ліганд, ковалентно зв'язаний з поверхнею субстрату, причому ділянки поверхні субстрату, які знаходяться між реакційними сайтами, є інертними по відношенню до аналіту, який полягає в тому, що активують всю вказану поверхню субстрату, надають гідрофобність вказаним ділянкам між реакційними сайтами і наносять ряд лігандів на вказані дискретні ділянки поверхні у воді таким чином, що вказані ліганди не наносяться на вказані гідрофобні ділянки між реакційними сайтами 22 Спосіб формування твердого пристрою для проведення мультианалітних аналізів, що включає субстрат і множину дискретних реакційних сайтів, кожну з яких має ліганд, ковалентно зв'язаний з поверхнею субстрату, причому ділянки поверхні субстрату, які знаходяться між реакційними сайтами, є інертними по відношенню до аналіту, що полягає в тому, що активують всю вказану поверхню субстрату, блокують вказані ділянки між реакційними сайтами і наносять ряд лігандів на вказані дискретні ділянки поверхні у воді таким чином, що вказані ліганди не наносяться на вказані блоковані ділянки між реакційними сайтами 23 Твердий пристрій для проведення мультианалітних аналізів, який включає субстрат, що має щонайменше одну активовану поверхню і безліч дискретних реакційних сайтів, кожний з яких має ліганд, ковалентно зв'язаний з поверхнею субстрату, який відрізняється тим, що ділянки поверхні субстрату, які знаходяться між реакційними сайтами, є інертними по відношенню до аналіту 24 Твердий пристрій по п 23, який відрізняється тим, що вказані ділянки поверхні субстрату, які знаходяться між реакційними сайтами, є гідрофобними 25 Твердий пристрій по п 23, який відрізняється тим, що вказаний субстрат є керамічним Галузь винаходу Цей винахід відноситься до пристрою і приладу для одночасного визначення декількох речовин, що аналізуються (аналітів) Передумови винаходу Звичайно різні щодо складу аналіти аналізуються за допомогою спеціальних способів, наприклад, ферментного імуноаналізу, рідинної хроматографії з високою дозволяючою здатністю, газової хроматографії, ферментних та колориметричних способів БІЛЬШІСТЬ З ЦИХ способів призначена для аналізу одного аналіту під час одного тесту Автоматизація аналітичних способів в цілому зосереджена на серійних аналізаторах і аналізаторах для перевірки довільних проб, де багаторазові аналізи окремих зразків проводяться з використанням окремих послідовних способів аналізу Це вимагає використання численних індивідуальних наборів для аналізу Крім того, аналіз вимагає використання декількох видів обладнання , наприклад, аналізаторів для КЛІНІЧНОГО ХІМІЧНОГО аналізу, рідинних хроматографіє з високою дозволяючою здатністю, мас-спектроскопів з використанням газової хроматографії, автоматичних приладів для імуноаналізу або приладів з використанням атомного поглинання патентують, але звичайно обидва ці критерії не витримуються Типовий субстрат мульти-аналітної системи має у своєму складі велику КІЛЬКІСТЬ різноманітних зв'язуючих лігандів Зразок, що випробовується, вносять у кожну реакційну зону і після цього для ідентифікації присутнього аналіту використовують численні методи виявлення Важливо, щоб спосіб виявлення, що використовується, визначав КІЛЬКІСТЬ кожного окремого аналіту Найбільш загальним способом одержання мульти-аналітних рядів просторово-різних ділянок біологічно-активних лігандів на субстраті є фотолітографічний метод Субстрат покривають фотолабільним зшивальним агентом Теоретично цей зшивальний агент стає реактивним по відношенню до зв'язувального ліганду тільки після світлового опромінення з ВІДПОВІДНОЮ довжиною хвилі Просторова дозволяюча здатність досягається шляхом нанесенням на субстрат фізичного покриття (яке звичайно виготовляють із хрому) Конфігурація отворів у покритті визначає конфігурацію сполучних ділянок на субстраті Для кожного біологічного ліганду, що іммобілізується, загальна схема така опромінення перших сайтів, інкубування опроміненого субстрату з першим лігандом, що іммобілізується, промивання з метою видалення погано зв'язаних лігандів, блокування сайтів, активованих на стадії опромінення, які не прореагували, і опромінення ділянок, де повинен бути іммобілізований другий біологічний ліганд, після чого повторюють Мульти-аналітна система повинна мати у своєму складі засоби для забезпечення одночасного аналізу декількох аналітів у зразку, що випробовується Спосіб мульти-аналітного аналізу часто 54400 ся ті ж стадії, що і для першого ліганду Просторова дозволяюча здатність регулюється шляхом контролю ділянки опромінення або за допомогою когерентного УФ лазерного джерела світла, або КІЛЬКІСТЮ фізичних покриттів і за допомогою некогерентного джерела світла Це перетворює завдання іммобілізації множини біологічних лігандів у тривалий процес Другим недоліком фотолітографічного методу є використання дорогах фізичних покриттів або лазерного джерела світла Далі, рівень неспецифічного зв'язування є високим Наприклад, використання арилазидів, фторарилазидів і бензофенонів призводить до високого ступеня неспецифічного зв'язування Високий рівень неспецифічного зв'язування на високому фоні аналізу значно знижує динамічний діапазон кожного мульти-аналітного аналізу Неспецифічне зв'язування має місце в основному із-за пасивної адсорбції молекул неактивованою поверхнею фотолабільного зшивального агента через ІОННІ взаємодії, сили Ван-дер-Ваальса і т д WO-A-9516204 описує фотолітографічний ПІДХІД до зменшення проблеми, пов'язаної з високим неспецифічним зв'язуванням Згідно з цим підходом поверхнево-зшивальною молекулою є авідин, а фотолабільною молекулою є фотобютин або його похідне Незважаючи на те, що заявлено зменшення неспецифічного зв'язування, цей метод потребує вищезгаданої довготривалої ПОСЛІДОВНОСТІ ДІЙ Іммобілізація 20 окремих біологічних лігандів потребує в цілому 80 етапів при виконанні основних вимог до опромінення, зв'язування, блокування та промивання для кожного окремого ліганду, що іммобілізується Просторову дозволяючу здатність також можна досягти пасивною адсорбцією Наприклад, заявка США-А-5432099 описує зв'язування ліганду з поверхнею субстрату шляхом сполучення іонної взаємодії, гідрофобної взаємодії і сил Ван-дерВаальса Пасивна адсорбція залежить від змін рН, температури, іонної концентрації і від типу субстрату, що використовується, утруднюючи контроль над процесом зв'язування Основним недоліком цього підходу є чутливість пропорції слабо іммобілізованого ліганду, що підлягає десорбції, під час стадій промивання або інкубування біологічного аналізу, що призводить до поганої штра-та штерточності аналізу Поперечно-зшивальним агентом, який описується в багатьох публікаціях, є глютаральдепд Цей зшивальний агент призводить до багатьох недоліків, у тому числі до тенденції білків до поперечного зшивання що, можливо, змінює функції білку Наступним недоліком є те, що процедура з'єднання повинна мати стадію відновлення, яка є довготривалою і потенційно дуже небезпечною, наприклад, якщо у ролі відновника використовують ціаноборопдрид натрію Використовують гетеробіфункцюнальні зшивальні агенти, проте в багатьох випадках це потребує зв'язування вільних сульфідрильних груп з білком Це викликає необхідність модифікації білку перед іммобілізацією При проведенні мульти-аналітного аналізу бажано одержувати як ЯКІСНІ, так і КІЛЬКІСНІ результати Наприклад, мульти-аналітні аналізи можна проводити з антибіотиками У великій мірі вони основані на аналізах з використанням мікробного інгібування, в яких антибіотик, присутній у зразку, подавляє ріст бактерій і створює очищену зону, пропорційну концентрації антибіотика, присутнього у зразку Проте цей спосіб не може забезпечити ідентифікацію антибіотика або точне визначення його концентрації Способи мікробного інгібування також дуже ПОВІЛЬНІ, весь процес продовжується декілька днів Методи ХІМІЧНОГО скринінгу, такі як рідинна хроматографія з високою дозволяючою здатністю або мас-спектроскопія з використанням газової / рідинної хроматографії суперничають у визначенні крайніх членів пропорції структурна різноманітність/полярність кожної антибіотичної групи, наприклад, пеніциліни, сульфаміди, аміноглікозиди, тетрацикліни і т д Крім того, хроматографічні методи потребують більшої роботи по виготовленню зразку з метою забезпечення такого співвідношення сигналу до шуму, при якому можуть бути досягнуті межі виявлення ВІДОМІ мульти-аналітні пристрої включають Triage (дивись Clinical Chemistry 38(9) 16781684(1992) і Advisor (див Clinical Chemistry 39(9) 1899-1903(1993)) Ці пристрої придатні тільки для КІЛЬКІСНОГО аналізу Пристрій Triage призначений для одночасного виявлення набору із семи лікарських засобів, якими зловживають, у сечі людини Кожний пристрій може аналізувати тільки один зразок сечі В КІНЦІ процедури оператор візуально оглядає кожну досліджувану специфічну для ЛІКІВ зону на наявність червоної смуги Всі стадії процедури аналізу повинні виконуватись оператором вручну Також відсутня роздруківка результатів тесту Використання пристрою Advisor подібне до використання пристрою Triage Пристрій Advisor перевіряє п'ять різних класів лікарських засобів, якими зловживають Пристрій діє на основі принципів аглютинаційного аналізу, при цьому кожному лікарському засобу призначений окремий канал Всі стадії процедури аналізу виконуються оператором Негативні зразки мають склеєні частинки, в той час як позитивні зразки лікарського засобу показують роздільне розташування частинок В основному в бюсенсорах / мікровиготовлених пристроях для біологічного використання у ролі субстрату застосовують кремній Іноді субстратом є скло або кварц Кремній має кристалографічну структуру з чітко визначеними кристалічними площинами, що легко контролюються Рівномірність кремнієвого субстрату ідеально підходить для використання в мульти-аналітному випробувальному пристрої Проте темні субстрати, такі як кремній, дають так званий ефект чорного тіла При використанні для виявлення флуоресценції, під час якої фторофор збуджують, використовуючи світло з визначеною довжиною хвилі, темний субстрат може поглинати випадково збуджену світлову енергію, таким чином зменшуючи випромшення світла фторофором Суть винаходу У ВІДПОВІДНОСТІ з даним винаходом пристрій для проведення мульти-аналітних аналізів має у своєму складі субстрат і множину дискретних pea 54400 кціиних саитів, кожен з яких має ліганд, ковалентно зв'язаний з субстратом, І в якому поверхня субстрату між реакційними сайтами є інертною по відношенню до аналіту Таким чином, даний винахід забезпечує твердий мульти-аналітний пристрій, який не здатний або майже не здатний до неспецифічного зв'язування Заявлений пристрій може бути одержаний активуванням поверхні підходящого субстрату і нанесенням ряду лігандів на дискретні сайти цієї поверхні При бажанні ІНШІ активні ділянки можуть бути заблоковані Ліганди можуть бути нанесені у водній системі, при цьому переважаючим є надання іншим ділянкам гідрофобних властивостей Ліганди можуть бути зв'язані з субстратом за допомогою зшивального агента Зокрема, бажано, щоб активована поверхня переважно реагувала послідовно з органосиланом, біфункцюнальним зшивальним агентом і лігандом Даний винахід також передбачає забезпечення за допомогою біфункцюнальних поперечнозшивальних агентів, що використовуються, високоефективного ХІМІЧНОГО сполучення між органосиланами, ковалентне іммобілізованими на мікровиготовлених кремнієвих або керамічних субстратах БІОЛОГІЧНІ ліганди можуть бути таким чином іммобілізовані в мульти-аналітні ряди Даний винахід виключає необхідність використання великої КІЛЬКОСТІ індивідуальних наборів для реактивного аналізу, а також декількох видів приладів, тим самим полегшуючи одночасне проведення множинних аналізів одного зразка Даний винахід забезпечує єдиний загальний аналізатор, придатний для одночасного виявлення широкого спектру ХІМІЧНИХ речовин Крім того, можна підібрати реактиви для тестування визначеного набору аналітів Даний винахід також передбачає іммобілізацію великої КІЛЬКОСТІ біологічних лігандів у просторововизначений малюнок, що складається із крапок і ЛІНІЙ, шляхом мікро-рідинного розподілення ліганду по хімічно-активованому субстрату БІОЛОГІЧНИЙ ліганд ковалентне приєднаний до субстрату Ефективність приєднання біологічного ліганду може бути такою, що хімічна реакція завершується протягом декількох хвилин Процедура іммобілізації забезпечує збереження біологічної активності біологічного ліганду на протязі як короткого, так і тривалого часу Даний винахід також забезпечує єдиний аналізатор для одночасного виявлення великої КІЛЬКОСТІ аналітів в мульти-аналітній системі Цей аналізатор передбачає максимальну зручність для кінцевого споживача, ідентифікуючи мульти-аналіт і даючи кількісне визначення кожного зразка, що випробовується Система для аналізу, якій слід віддати перевагу, містить трансляційну платформу Х-У, апарат для обробки зразка, засіб для контролю рідинної обробки /течи, темну коробку, що контролюється за допомогою температури, камеру пристрою з зарядовим зв'язком, а також математичне забезпечення для обробки зображення Платформа може бути зв'язана з ВІДПОВІДНИМ мотором для досягнення заданої точності, наприклад, 10 |JM, для розміщення пристрою (пристроїв) на кожній стадії аналітичної процедури 8 Опис креслень На поданих кресленнях фіг 1 показує утворення нерівномірної поверхні субстрату, фіг 2 показує хімічну активацію груп на поверхні субстрату, фіг 3, 5 і 6 показують ковалентну іммобілізацію ліганду на поверхні субстрату, фіг 4 показує використання латексних часток на поверхні субстрату, фіг 7 - 11 ілюструють пристрої для введення субстратів, які здійснюють винахід, фіг 12 - 14 - схематичні вигляди системи, яка призначена для аналізу, пристрою згідно з даним винаходом, фіг 15 показує калібровочні криві для аналітів, що досліджуються за допомогою даного винаходу Опис винаходу Субстрат, який використовується у пристрої згідно з даним винаходом, може, наприклад, містити кремній, кварц, скло або керамічний матеріал Керамічні субстрати (оксид алюмінію) є хорошою альтернативою кремнієвим субстратам, оскільки дозволяють успішно застосовувати як флуоресцентні, так і хемілюмінесцентні методи виявлення Це відкриття було несподіваним, тому що кристалографія керамічних матеріалів не передбачає їх найближчого вибору як субстрату Керамічний субстрат можна виготовити таким чином, щоб забезпечити інтервал розміру гранул від 1 до 30|JM Переважаючий розмір часток керамічного субстрату, що використовується в цьому винаході, становить менше, ніж 20цм, переважно менше Юрм Зменшений розмір часток сприяє значному покращенню рівномірності поверхні, що, в свою чергу, покращує проведення біологічних аналізів Іншими важливими якостями керамічних субстратів є допуск топографії поверхні, пористість, вакуумна герметичність і нульове поглинання води Керамічний матеріал, якому слід надати перевагу, складається із 94% оксиду алюмінію (АЬОз) з розміром частинок в межах 4-8цм Матеріал є вакуумно герметичним і після подрібнення має топографію поверхні 0,6 - 0,8|JM Рівномірність поверхні може бути покращена за допомогою процесу шліфування, завдяки якому одержують поверхню з відхиленням 0,4 - 0,5|JM Подальше покращення досягається поліруванням і шліфовкою, одержуючи поверхню з відхиленням 0,05 -0,1 рм Було встановлено, що характеристика деяких керамічних субстратів залежить від характеристик розміру гранул Було встановлено, що найкращі результати аналізу досягаються при розмірі гранул керамічних матеріалів до 8цм, наприклад, 4 - 8цм Було встановлено, що результати для матеріалів з великим розміром гранул незадовільні Перевірка керамічних субстратів з розміром гранул приблизно 1|JM не призвела до покращення результатів порівняно з результатами, одержаними для субстрату з розміром гранул 4 - 8цм Це є перевагою, оскільки вартість керамічного матеріалу з дуже малим розміром часток значно вище (приблизно в 5 раз) ПІДХОДЯЩІ кремнієві субстрати виготовляють з плівкою оксиду, що має точну товщину, наприклад, 54400 допуск + 2нм для плівки оксиду товщиною ЮОнм Плівка оксиду може мати товщину 50 - 500нм, переважно менше 200нм, більш переважно коло ЮОнм Субстрат можна одержати як частину твердого мікровиготовленого і мікрообробленого пристрою, розробленого для широкого кола панель-тестів для проведення ветеринарних та КЛІНІЧНИХ діагнозів Кожен твердий пристрій для тестів має ряд реакційних ділянок Кожна реакційна ділянка є специфічною для окремого аналіту Реакційна ділянка може мати вигляд плями, жолоба, заглиблення, виїмки, западини або камери Реакційні ділянки утворюються за допомогою іммобілізуючих біологічних молекул на субстраті Звичайно пристрій згідно з цим винаходом має площу до 1см2 Площа кожного реакційного сайту звичайно менше, ніж 1 мм2 Тверді субстрати виготовляють переважно таким чином, щоб забезпечити складну сітку отворів, камер, жолобків, западин, заглиблень і т д Переважаючим є також створення стовпчиків усередині жолобків або западин Такі нерівності можуть допомогти у досягненні максимальної взаємодії ділянок поверхні між зв'язаними біологічними лігандами та реактивами аналізу, що в знаній мірі зменшує інкубаційний період для схожих порівняльних імуноаналізів і шаруватих імуноаналізів Як альтернатива або крім, наприклад, заглиблень або жолобків на кремнієвому або керамічному субстраті, поверхня може бути також мікровиготовлена таким чином, щоб на ній були камери / резервуари / жолобки для змішування об'ємом від нанолітра до мікролітра Наприклад, кремнієву поверхню спочатку окислюють для утворення шару оксиду Потім наносять шар фоторезиста, на якому утворюють бажаний малюнок Після утворення малюнка на шарі оксиду фоторезист видаляють Потім кремній протравлюють, наприклад, за допомогою HF, а потім плівку оксиду видаляють Нарешті, плівку оксиду рівномірно вирощують на всій поверхні кремнієвої пластинки Ілюстрація процесу наводиться на фіг 1 На стадії (і) кремнієву пластинку 1 окислюють з метою одержання шару оксиду 2, на стадії (її) наносять фоторезистентний шар 3, на стадії (їм) за допомогою світла наносять малюнок, на стадії (iv) фоторезист видаляють, на стадії (v) пластинку 1 протравлюють, на стадії (vi) видаляють плівку оксиду і на стадії (vn) знову утворюється постійна плівка оксиду 2а, Переважаючою є ковалентна іммобілізація біологічних лігандів Можна використовувати пасивну адсорбцію, але на таку взаємодію впливають зміни рН, температури і концентрації ІОНІВ, вона може також у деяких випадках призвести до вивільнення слабо зв'язаних лігандів під час стадій інкубування і промивання, таким чином погіршуючи відтворюваність аналізу Бажано, звичайно, щоб після процедури іммобілізації біологічний ліганд зберігав максимальну активність Перед будь-яким ХІМІЧНИМ активуванням поверхня субстратів повинна бути старанно очищена Перша стадія переважно містить очищення поверхні ультразвуком у лужному детергенті з наступним виснажуючим промиванням ДВІЧІ деюнізова 10 ною водою Потім субстрати оброблюють кислотним розчином хрому Цей розчин продовжує очистку поверхні і відкриває поверхневі епоксидні групи, як показано на фіг 2 Епоксидні групи можуть бути також відкриті іншими способами, наприклад, дією ультразвуку на протязі 1 години Утворені таким чином поверхневі гідроксильні групи готові для дериватизацм Наприклад, як показано на фіг, 3, ПОСЛІДОВНІСТЬ реакцій має у своєму складі використання органосилану, потім біфункцюнального поперечно-зшивального агента Z-RY для утворення високореактивної проміжної сполуки і, нарешті, функцюналізованого ліганду для досягнення ковалентної іммобілізації Більш детально в органосиланах формули (RO)3 Si-(CH2)n-X кожен R є алкільною або іншою пдрокарбільною групою, такою як СНз або СН2СН3, n є цілим числом, наприклад, від 1 до 18, а X є функціональна група, така як епоксициклогексил, NH2, СНО, ОН, SH, р - хлорбензил, m хлорбензил, Вг, СІ, -NH-CH2-CH2-NH2, 2,3 - епоксипропокси, -N=C=O, -N=C=S або рхлорсульфонілфеніл Ці органосилани можуть бути вибрані з метою одержання або реактивної термінальної групи, яка здатна утворювати ковалентний зв'язок з біологічною молекулою, або менш реактивного залишку, такого як NH2, де необхідне подальше активування за допомогою біфункцюнального агента з- метою одержання відповідної кінцевої групи Органосилани, що мають термінальні електрофільні функціональні групи, не потребують активування за допомогою біфункцюнального поперечно-зшивального агента, оскільки біологічні ліганди можуть бути іммобілізовані ковалентне через нуклеофільні групи на біологічному ліганді Утому випадку, коли органосилани мають нуклеофільні групи, будь-який з численних бюфункцюнальних поперечно-зшивальних агентів може бути використаний з метою одержання у вищій мірі реактивної хімічної групи, через яку біологічна молекула або ліганд можуть бути приєднані ковалентне Цей винахід має у своєму складі використання біфункцюнальних зшивальних агентів, які можуть бути використані для масового виробництва ХІМІЧНО активованих субстратів, будучи достатньо стійкими для тривалого зберігання до ковалентного зв'язку біологічної молекули або зв'язуючого ліганду Переважаючи зшивальні агенти є інертними у звичайних атмосферних умовах, тим не менш вони також достатньо реактивні для того, щоб утворювати ковалентна зв'язки з функціональними групами біологічного ліганду, що іммобілізується, впродовж дуже короткого проміжку часу (звичайно < 10 хвилин) Біфункцюнальним зшивальним агентом може бути, наприклад, фосген, тюфосген, N, Nдісукцинімідил карбонат, ксилілендіамін, 1,6діамшогексан, 1,12-діамшододексан, 1,6дмзоціанатогексан, 1-,12-дизоціанатододекан, 1,4фенілендітюїзоціанат, ціанурхлорид, терефтальдепд, р-нітробензоілхлорид, сульфанілова кислота, 2-фторометилпіридин, р-толуолсульфонат, 3амінофенілборонова кислота, рбромфенілборонова кислота, діетилпірокарбонат, етил хлорформат, р-бромоаланш, р-бромфеніл 12 11 54400 гідразид, р-бромбензальдепд, 1,2-етиленгліколь репоксифункцію органосилану Тому поверхня суббромбензальдепда, N, N-карбонілдммідазол, тестрату не повинна мати полімеризованого органорефталоїл хлорид, епіхлорпдрин, 1,4силану дмодобензол, 1,4-дібромбензол або похідне NХІМІЯ поверхонь забезпечує засіб для досягпдроксисукциніміду, наприклад, р-амінобензойної нення просторової дозволяючої здатності завдяки кислоти, р-бромбензойної кислоти, ршвидкій кінетиці утворення ковалентних зв'язків бромфенілоцтової кислоти, р-брометилбензойної МІЖ ХІМІЧНОЮ функціональною групою поверхні і кислоти, р-бромметилбензойної кислоти, рпідходящою ХІМІЧНОЮ групою, що знаходиться у формілбензойної кислоти,рстерично ВИГІДНІЙ позиції на біологічній молекулі, яка іммобілізується Біологічну молекулу переважпдроксиметилбензойної кислоти, 1,2- етиленгліно наносять на поверхню субстрату за допомогою коль р-формілбензойної кислоти, рмікрорідинної піпетки у вигляді окремої краплі або бромфенілпропюнова кислота або рряду крапель, які утворюють ЛІНІЮ Об'єм рідини, пдроксифенілпропюнова кислота Для реакції з що наноситься, становить від 1 до ЮОнл, переваорганосиланом, що має нуклеофільну або електжно менше, ніж 50нл, наприклад, ближче до Юнл рофільну термінальну групу, можна використовуШвидкість утворення ковалентних зв'язків така, що вати фотолабільний перехресно-зшивальний ковалентна іммобілізація досягається на протязі агент Таким агентом є, наприклад, Nдекількох хвилин, до того, як нанесена крапелька пдросукцинімід р-азідобензойної кислоти або рабо ЛІНІЯ випарується з поверхні Позиційна точамінобензофенон ність, з якою наноситься крапелька або ЛІНІЯ рідиЗамість або окрім використання біфункцюнани, повинна мати допуск _+ 20цм льних зшивальних агентів можна також переважно ковалентне іммобілізувати шар латексних часток Діаметр латексних часток переважно менше, ніж 500нм, а більш переважно менше, ніж 150нм Латексні частки можуть мати ряд функціональних груп, наприклад, - СН2СІ2, - СНО, р - хлорфеніл, р хлорстірил, -N=NH, -NH-NH2 або -NH2 Латексичні частки можна шкубувати при концентрації приблизно 0,5 - 1% мас /об , при цьому субстрати модифікують підходящим органосиланом у присутності або відсутності гетеробіфункцюнального зшивального агента, як описано вище Фіг 4 показує дві реакційні схеми іммобілізації латекса За кожної з них може йти активація латекса другим зшивальним агентом і іммобілізація біологічної молекули, або пряма ковалентна іммобілізація, наприклад, антитіла Альтернативою використання полістирилових латексних часток є ковалентна іммобілізація біологічних ліпндів до похідних етиленглікогелю, який уже зв'язаний з силанізованим субстратом Наприклад, ПОХІДНІ поліетиленгліколю з двома електрофільними групами, такими як епокси або карбонілімідазол, вступають в реакцію з силаном, який має термінальну групу -ІЧНг, таким як APTES, на вибраному субстраті Переважаючою може також стати ковалентна іммобілізація біологічного ліганду прямо до силанового шару, таким чином видаляючи необхідність активування силану полімерними матеріалами або біфункцюнальними зшивальними агентами Органосилани повинні бути чутливими до нуклеофільноі атаки ХІМІЧНОЮ групою (наприклад, NH2, SH, ОН або NH=NH2) на біологічному ліганді Органосилани, придатні для прямого приєднання біологічного ліганду, можуть мати галидні, елокси-, ізоціанато, - альдегідні або тозилатні функціональні групи Така реакція показана на фіг 6, де Е є електрофільна група на органосилані Прикладами Е є Вг, СІ, - О-СН2-СН=СН2, - NCO, - СНО і р - хлорсульфонілфеніл Органосилани, які мають електрофільні групи, наприклад, гліцидокси, також мають ту перевагу, що вони менш чутливі до полімерізацм під час процедури силанізування завдяки відсутності нуклеофільних груп, здатних атакувати метокси - або Особливо, якщо ліганди наносять у воді, також бажано зробити поверхню гідрофобною з метою запобігання бокової дифузії нанесеної крапельки або лінії Ця властивість забезпечує якість плями і відтворюваність, а також забезпечує ковалентну іммобілізацію великої КІЛЬКОСТІ ПЛЯМ біологічних молекул на одиницю площі поверхні Цей винахід запобігає проблеми, пов'язані з звичайною фотолітографією, забезпечуючи можливість утворення просторово різноманітних плям біологічних лігандів без необхідності використання УФ світла фізичних покриттів Як зазначено вище, просторову дозволяючу здатність можна досягнути за допомогою мікронанесення Важливим фактором є швидка кінетика реакції ковалентної сполуки, яка необхідна для високоефективного з'єднання біологічного ліганду на просторово ВІДМІННІЙ ДІЛЯНЦІ, і яка видаляє бокову дигресію іммобілізованого біологічного ліганду Потім ХІМІЧНІ залишки на субстраті, що не прореагували, можуть бути заблоковані, наприклад, за допомогою блокуючих молекул, відомих спеціалістам у даній галузі Такими підходящими молекулами є білки, такі як казеїн, бичачий сировоточний альбумін, лактальбумін і т д або блокатори з малою молекулярною вагою, такі як гліцин, глютамін і т д Можуть бути використані також фотолабільні зшивальні агенти Наприклад, органосилан на поверхні субстрату в темноті вступає в реакцію з фотолабільним зшивальним агентом (наприклад, бензофеноном, арилазидами і т д ) Потім, за бажанням, на поверхню наносять біологічні ліганди у вигляді плям, і після короткого періоду опромінення УФ світлом, або більш тривалого періоду опромінення видимим світлом здійснюють ковалентне приєднання Ділянки поверхні субстрату, що залишились, блокують, використовуючи блокатори, подібні молекулам, описаним вище, у присутності УФ або видимого світла Іммобілізовані біологічні молекули на субстраті можна стабілізувати, наприклад, інкубуванням в цукровому розчині (наприклад, трегалозі) на протязі короткого проміжку часу (1 година), а потім висушуванням при 37°С на протязі 16 годин Потім 14 13 54400 стабілізовані субстрати можуть бути для зберіганкислоти або тропонін Т, ня запаковані в пакети з фольги з осушувачем - маркери інфекційних захворювань, Іммобілізовані біологічні молекули зберігають ста- маркери алергій, більність на протязі 6 - 1 2 МІСЯЦІВ і більше, напри- лікарські засоби, якими зловживають, клад, до більш ніж 2 років при зберіганні при тем- ферменти пературі від +2 до +8°С - віруси, Пристрої можуть бути розміщені у різноманітні - нуклеотиди і носи, які забезпечують здатність контролювати - пептиди ефективність зшивання реактивів тесту Плинність Наприклад, один набір призначений для вирідинних реактивів можна контролювати капілярзначення сульфамідних антибіотиків Цей винахід ним тяжінням, відцентровою силою, вакуумною забезпечує спосіб одночасного КІЛЬКІСНОГО визнасилою або електроосмотичною течією Викорисчення до 20 окремих сульфамідів Прикладами тання такої течи може запобігти необхідність викоінших наборів є панелі для визначення серцевих ристання клапанів, таким чином відпадає необхідпорушень, фертильності та інфекційних захворюність використання механічних частин вань Зв'язування скляної пластинки з мікровиготовЦей винахід забезпечує можливість одночасленою поверхнею забезпечує утворення закритих ного визначення приблизно 20 аналітів, які можуть каналів До зв'язування скляної пластинки біологіне мати структурної схожості Матриці зразків, що чні молекули ковалентне зв'язуються на поверхні тестуються, можуть мати у своєму складі сироватБагато процедур зв'язування, наприклад, анодне ку, плазму, сечу, жовч, фекали, тканину, воду і їжу зв'язування, потребують високих температур і моОб'єм необхідного зразка дуже невеликий, звижуть зруйнувати біологічну молекулу Тому методи чайно < 1,5цм аналіт Тест-реагенти, наприклад, зв'язування повинні бути натурованими відносно мічені ферментом антитіла і гаптени, мічені флуоіммобілізованих біологічних молекул Одним з підресцеїном антитіла і гаптени, можуть міститися в ходящих методів є непряме зв'язування, напризагальному резервуарі для реагентів, значно зниклад, подібно до того, як вафлю зв'язують з скляжуючи вимоги по зберіганню рідин ною пластинкою за допомогою підходящого клею, В шаруватих аналізах, наприклад, лютеїнізуюнаприклад, епоксидного клею чого гормону, фолікулостимулюючого гормону, Потім пристрої можуть бути розміщені в ПІДХОпролактину, тіреостимулюючого гормону І т д , ДЯЩІ носи Різноманітні носи такого роду показані зразок добавляють разом з буфером і шкубують на фіг 7 і 8 Як приклад, розміри пристрою, показавпродовж короткого проміжку часу, звичайно менного на фіг 8, складають 48,62мм х 48,62мм, вклюше, ніж ЗО хвилин, переважно менше 10 хвилин чаючи западини, які мають внутрішній діаметр Після стадії промивання добавляють суміш міче10мм і ЗОВНІШНІЙ діаметр 12,82мм Відстань запаних визначаючих антитіл і шкубують далі на протядин від центру до центру складає 15,36мм зі визначеного проміжку часу Цей проміжок теж звичайно становить менше ЗО хвилин, переважно Пристрої можуть мати у своєму складі деталі менше 10 хвилин Потім пристрій промивають з для поліпшення змішування реагентів тесту, зразметою видалення незв'язаних позначок і визначаків і т д Це показано на фіг 9, де пристрій має у ють КІЛЬКІСТЬ сигналу своєму складі сайт для введення реагенту 11, жолобки для реагенту 12 і сайти для тест-реагентів Для деяких аналізів переважальним може ста13 ти впровадження в мікровиготовлений пристрій На фіг 10 пристрій має у своєму складі резерзасобу для видалення потенційних штерферентів, вуари для реагентів 21, колектор для розподілення таких як інтерференція ревматоїдного фактору 22, канальні тест-сайти для розподілення реагенВидалення ревматоїдного фактору може бути тів 23 і резервуар для ВІДХОДІВ 24 Фіг 11 показує здійснене шляхом контакту зразка, який тестуєтьчотирьохканальну структуру для тесту із схожими ся, з ділянкою іммобілізованого імуноглобуліну, частинами наприклад, контакт зразка, який досліджується, з ділянкою для реакції Цей винахід забезпечує повністю інтегровану систему для одночасного КІЛЬКІСНОГО визначення Наступним прикладом є інтерференція НАМА аналітів, які мають різні молекулярні маси, струк(людських антимишачих антитіл), Ці антитіла мотури і полярність Набори аналітів можуть бути жуть викликати серйозні проблеми при проведенні використані для проведення клінічної / ветеринараналізів з використанням моноклональних мишаної діагностики або скринінгу лікарських засобів чих антитіл Звичайно ця проблема вирішується шляхом включення в тест-реагенти дорогих доміВ залежності від аналітів ВІДПОВІДНО вибирашок Перевагою цього винаходу є запобігання інють зв'язуючі ліганди Це залежить від вміння і терференції НАМА за допомогою контакту зразка з досвіду спеціалістів Підходящими аналітами є ділянками на мікровиготовленому пристрої з метакі тою видалення цих антитіл до того, як зразок буде - антибіотики, наприклад, тетрацикліни, сульрозміщений на реакційну ділянку фаміди, юнофори, аміноглікозиди, пеніциліни або фторхшолони, В цілому, ліганди можуть бути нанесені на ча- гормони, наприклад, лютеїнізуючий гормон, стину пристрою, яка зв'язує домішки Це особливо пролактин, фолікулостимулюючий гормон або тіважливо, коли на поверхню пристрою, тобто, в реостимулюючий гормон, жолобки, припустимо нанесення визначеної речовини Можливість видалення штерферентних ком- маркери серцевих порушень, наприклад, міопонентів збільшує точність одержуваних результаглобін, карбонова анпдраза, тропонін 1, глікогентів фосфорилаза ВВ, СК- MB, зв'язуючий білок жирної 16 15 54400 Визначальні позначки можуть бути також імВикористання систем для визначення, основамобілізовані на поверхні дендримерних молекул ні на флуоресценції, з підходящими оптичними Дендримерні молекули є полімерні по своїй прифільтрами для мічених фторофорів дає прямі рероді, вони синтезовані сполученням, що повторюзультати ється, невеликих будівельних молекул Такі молеПідходящим хемілюмінесцентним реактивом є кули з різною молекулярною масою люмінол, який можна аналізувати при довжині виготовляються промислово фірмою Aldnch хвилі 433 - 445нм Можна також спостерігати хеміChemicals (з різноманітним набором термінальних люмінесценцію, виходячи із визначення лужних, функціональних груп, наприклад, Nbb або СООН) мічених фосфатазою біологічних молекул, і викоУ ВІДПОВІДНОСТІ з звичайними методами сполученристовуючи 1,2-дюксетан ня для виготовлення визначаючих мічених коньюЗ метою полегшення визначення аналітів цей гатів можуть бути використані гетеробіфункцюнавинахід переважно застосовує хемілюмінесцентну льні зшивальні агенти При використанні систему визначення з використанням пристрою з невеликих гаптенових молекул, наприклад, [3 зарядовим зв'язком Перевага віддається чорній агоністів, анаболічних стероїдів або антибіотиків, освітленій камері для поліпшення ефективності слід віддати перевагу сполученню невеликих дензахвату при довжині хвилі світла, яке випромінює дримерів (переважно, не більше 16 поверхневих хемілюмінесцентна світлова реакція (приблизно груп) з великими дендримерами (звичайно більше 433 - 445нм у випадку з люміналом) 64 поверхневих груп) Гаптен з малою молекулярВся система може контролюватися за допомоною масою (менше 1000 дальтон) сполучають з гою персонального комп'ютера, де спеціально ХІМІЧНИМИ групами невеликого дендримеру з наскладена програма контролює таблицю Х-У, розступним ковалентним приєднанням визначальної подільчий пристрій, обробку зразка, спостереженпозначки Коньюгат дендримеру може бути очиня за температурою, час інкубування і камеру з щений за допомогою діалізу і гель-проникаючої зарядно-з'єднуючим пристроєм Фіг 12 - 14 покахроматографії зують організацію такої системи Тест-реагенти мають багато складових (наФіг 12 схематично показує взаємодію персоприклад, мічені ферментами антитіла, мічені флунального комп'ютера, який має два контрольних оресцеїном антитіла, іммобілізовані латексом анвузла 31 і 32 Вузол 31 зв'язаний з системою зотитіла, дендримерні антитіло - фторофорні браження зарядно-з'єднуючого пристрою, який кон'югати, дендримерні антитіло - ферментні кон'позначається як 33 Вузол 32 зв'язаний з розподіюгати, мічені ферментами гаптени, мічені флуорельчим вузлом і трансляційною картою Х-У, при сцеїном гаптени і т д ), необхідних для конкретних цьому планшет для зразка позначений як 34 і 35, наборів тестів Набори можливих тестів дуже різВІДПОВІДНО номанітні і їх можна вибирати, виходячи з КЛІНІЧНОФіг 13 є схематичним зображенням трансляГО діагнозу (або ветеринарного аналізу), в міру ційної карти Х-У Це креслення показує платформу необхідності Наприклад, необхідний набір для для зразка 41, встановлену на ЛІНІЙНИЙ виконуювизначення інфекційних захворювань (таких як чий механізм 42 Трансляція Х-У знаходиться під гепатит, ВІЛ, сифіліс і т д ) Інші набори мають у контролем перехідних моторів 43 і 44, з'єднаних з своєму складі гормони фертильності, серцеві марВІДПОВІДНИМИ приводами 45 і 46 Трансляція обмекери, білки алергії і т д Так же, як і КЛІНІЧНІ паражується "вихідним положенням" датчиків 47 і 48 метри, можна визначити широкий набір залишків Чутливість мічених біологічних молекул і делікарських засобів яких немічених біологічних молекул до світла може викликати необхідність проведення аналізів Цей винахід дає можливість ідентифікувати при відсутності світла Відсутність світла досягаокремі сполуки, такі як антибіотики Наприклад, на ється за допомогою світлонепроникної коробки пристрої, який має площу поверхні 1см , одночасТемпература світлонепроникного простору також но, звичайно на протязі декількох хвилин, можна переважно контролюється, наприклад, в діапазоні одержати КІЛЬКІСНИЙ результат відносно 20 антибі+0.2С , або, переважально, + 0,1 °С, з метою заотиків, з чутливістю, яка перевищує чутливість безпечення задовільної точності аналізу методів рідинної хроматографії з високою дозволяючою спроможністю і мас-спектроскопм з викоФіг 14 показує прилад у перспективі частину ристанням газової хроматографії, і и можна порівплану і зрізані вигляди збоку Зокрема, фіг 14А няти з чутливістю звичайних ферментних показує контейнер 51 для зберігання реагентів, імуноаналізів з одним параметром Цей ПІДХІД мосвітлонепроникливі двері 52 і корпус камери 53 із жна легко застосувати до анаболічних стероїдів, з'ємною кришкою 54 Основна частина камери мобета-агоністів, бета-блокаторів, пестицидів, тераже знаходитись поза кожухом Лінзи камери розпевтичних лікарських засобів і т д міщені у отворі в кожусі При проведенні аналізів може бути використаФіг 14В показує окреслення зразків на пластина хемілюмінесценція бюлюмінесценція або флунці для зразка 55, ділянки для ВІДХОДІВ 56, а також оресценція Система для визначення переважно ділянку для зображення 57 Камера 53 встановлеявляє собою камеру з зарядно-з'єднуючим прина над цими ділянками Фіг 14С показує, окрім констроєм з обладнанням для вимірювання як флуотейнера 51, камеру 53, карту Х-У 41, перехідний ресцентного, так і хемілюмінесцентного світла мотор 43 і розподільний насос 58 Коротко кажучи, указана камера приймає світлоКонструкція системи, показаної на фіг 14, бавий сигнал, який виходить із ділянок на мікровигозується на утримувачах 3 x 3 штативу для зразків, товленому пристрої, які випробовуються, і переякі можуть одночасно мати у своєму складі 20 зратворює його у ВІДНОСНІ СВІТЛОВІ одиниці зків Це означає, що коли на кожному 1см2 мікро 18 17 54400 виготовленого пристрою знаходяться 20 окремих Потім мульти-сульфонамідні пристрої промиреакційних ділянок, то на одному зразку можна вають фосфатно-буферним соляним розчином і одночасно проводити 3600 аналізів Альтернативлоліетиленгліколевим буфером для видалення но, одночасно можна проводити аналіз 180 зразків надлишку реагентів І на кожен пристрій наносять на 20 різноманітних параметрів тесту по 300 цл хемілюмінесцентного субстрату [люминол (1,4мМ)/перекис водню сечовини (9,6мМ)] Як вказано вище, аналіт можна позначити ЛіПристрої відображують, використовуючи камеру ганд також можна позначити, забезпечуючи пропристрою з зарядовим зв'язком з витримкою до 4 ведення аналізів при частковій зайнятості хвилин Для кожного із 12 окремих сульфонамідів Наступні приклади Ілюструють винахід одержують стандартні криві Калібровочні криві Приклад 1 Аналіз сульфонаміду для кожного із 12 окремих сульфонамідів показані У цьому прикладі 12 окремих антитіл (при графічно на фіг 15 Процентна величина В/Во, відцьому кожне антитіло специфічне для одного сукладена на осі У, показує в % інгібування величини льфонаміду) іммобілізують шляхом ковалентного нульового стандарту відносної світлової одиниці, приєднання за допомогою контактної взаємодії до викликаного кожним окремим сульфонамідним дискретних ділянок плоского керамічного {оксид стандартом (відкладеним на осі X як Іод-ю) алюмінію) субстрату, що має ХІМІЧНО модифіковану поверхню Використовуючи порівняльний імуноПриклад 2 Аналіз гормону аналіз, проводять мульти-аналітний аналіз У цьому прикладі проводять мульти-аналітний аналіз трьох гормонів з високою молекулярною Більш детально, керамічні субстрати (1см х масою, а саме пролактину, фолікулостимулюючого 1см) очищають за допомогою ультразвуку, викогормону і лютеїнізуючого гормону Цей приклад ристовуючи лужний детергент (RBS35, 5% об/об) ілюструє мульти-аналітний аналіз багатошарового потім ДВІЧІ деюнізовану воду, а потім розміщують в імуноаналізу В процесі визначення трьох гормонів 6 М НСІ на 16 годин Потім субстрати розміщують на одній і тій же панелі значних перехресних реакв хромову кислоту на 1 годину в ультразвуковій цій не спостерігається бані Субстрати як можна більш ретельно промиПроцедури попередньої хімічної обробки і сивають подвійно деюнізованою водою і ацетоном, а ланизування проводять так само, як описано в потім висушують в печі при 120°С впродовж 2 гоПрикладі 1 Моноклональні антитіла пролактину, дин Після такої попередньої обробки субстрати фолікулостимулюючого гормону або лютеїнізуючосиланізують, використовуючи органосилан уго гормону (відмірюють приблизно 20нл антитіла) глицидоксипропіл триметоксисилан (10% об /об ) у іммобілізують на дискретних ділянках ХІМІЧНО мобезводному толуолі, 4 - диметиламшопіридині дифікованого субстрату Мультианалітні аналізи (1,25г/л) і триетиламші (1% об/об) Суміш піддапроводять як на кремнієвих, так і на керамічних ють дефлегмації впродовж 4 годин, а потім відсубстратах, при цьому епоксидна поверхня така ж, стоюють впродовж ночі при кімнатній температурі як описано у Прикладі 1 Перед твердінням впродовж 4 годин при 120°С 150ші складного стандарту на основі сироватсубстрати промивають толуолом і ацетоном ки трьох вищезазначених гормонів і 150цл буферного розбавлюючого розчину додають до приПісля твердіння субстрати розміщують в констрою і інкубують на протязі 15 хвилин при тейнери і зберігають при кімнатній температурі до кімнатній температурі Після стадії промивання тих пір, поки сульфамідні антитіла не будуть нанедодають ЗООцл загальної суміші кон'югатів пероксені у вигляді плям, Сульфамідні антитіла наносидази із хріну лютеїнізуючого гормону, пролактисять у вигляді плям, використовуючи дозуючий ну і фолікулостимулюючого гормону, і інкубують на пристрій BIODOT ХУ3000 Аналізу піддають 12 протязі 15 хвилин Потім пристрій промивають з сульфамідів сульфадоксин, сульфаметюзол, суметою видалення надлишку реагентів і наносять льфахлорпіридазин, сульфаметоксіпіридазин, сухемілюмінесцентний реагент [люмінол (1,4мМ) / льфамеразин, сульфапіридин, сульфасоксазол, перекис водню сечовини (9,6мМ)] Пристрій відосульфатіазол, сульфаметазин, сульфахшоксалін, бражають в камері пристрою з зарядовим зв'язком сульфадіметоксин і сульфадіазин з витримкою до 4 хвилин Після обробки зобраДля кожного сульфонамідного антитіла відміжень відкладають стандартні криві для кожного рюваний об'єм складає приблизно 20нл 12 сульгормону фонамідних антитіл, що створюють 12 дискретних ділянок на субстраті площею 1см2, шкубують на протязі 2 годин при 37°С Субстрати промивають фосфатно-буферним соляним розчином (рН 7,2), який має у своєму складі 2% казеїну (мас /об), а потім блокують в цьому ж буферному розчині впродовж ночі при +2 - 8°С Після промивання вказаним розчином, який має у своєму складі PEG 300 (0,05% об /об ), пристрій розміщують в носій Мульти-сульфонамідні стандарти (200цл) і суміш сульфонамідних кон'югатів пероксидази хріну (ЮОрл) розміщують в реакційні виїмки, які має пристрій, в установленому порядку, і шкубують впродовж 15 хвилин при кімнатній температурі Стандарти містять 5, 10, 50 і 100 нг/мл для кожного з 12 сульфамідів Приклад 3 Аналіз сульфаміду На відміну від Прикладу 1, мультисульфамідний аналіз також проводять, використовуючи мікрожолобки Пристрій показаний на фіг 11 У цьому прикладі резервуари 21 для додавання реагентів мають розміри 2мм х 2мм і глибину 300|JM (об'єм 1,2|лі), канали 23 мають довжину 5мм, ширину 200|JM і глибину ЮОцм (об'єм ЮОнл), а резервуар 24 має розмір 1,9мм х 8,6цм І глибину 300|JM (об'єм 4,9цл) Хімічне модифікування поверхні здійснюють так, як описано у Прикладі 1 У кожен із жолобків вносять по одному антитілу і інкубують на протязі 2 годин при 37°С Потім субстрати блокують і промивають, як у Прикладі 1 19 54400 Змішують мульти-сульфамідний стандарт (200цл) і кон'югати сульфамідної пероксидази із хріну (ЮОрл) По 1цл реагента, що утворюється, добавляють за допомогою піпетки у кожний резервуар, забезпечуючи таким чином жолобок, покритий антитілом, для кожного сульфаміду Стандарти, як і належить бути, мають 10 або 100нг/мл всіх сульфамідів Реагент тече завдяки капілярній дії Після ш 20 кубування на протязі 2 хвилин пристрій промивають 5 разів фосфатно-буферним соляним розчином / поліетиленгліколем, потім добавляють хемілюмінесцентний реагент [люминол (1,4мМ) / перекис водню сечовини (9,6мМ)] Пристрій відображують в камері пристрою з зарядовим зв'язком з витримкою до 4 хвилин Процентні величини В/Во для чотирьох сульфамідних кривих наведені в Таблиці 1 Таблиця 1 Сульфамід Сульфаметазин Сульфаметоксипіридазин Сульфахіноксалін Сульфамеразин %В/Во 10 нг/мл 14 28 56 40 0 нг/мл 100 100 100 100 Користь цього винаходу у порівнянні з фотолітографією показана за допомогою ступеню неспецифічної адсорбції біологічних молекул на фото 100 нг/мл 7 15 24 22 лабільному (обробленому бензофеноном) субстраті Результати наведені в Таблиці 2 Таблиця 2 Мишачий IgG V V Опромінення УФ лампою (1 Охв ) V X Мишачий IgG визначають, використовуючи кон'югат антимишачої пероксидази із хріну з застосуванням хемілюмінесцентного виявлення за допомогою камери пристрою з зарядовим зв'язком Кремнієві або керамічні субстрати, які мають іммобілізований бензофеноновий фотолабільний зшивальний агент, не повинен зв'язувати мишачий IgG під час реакції при відсутності світла Однак відбувається неспецифічне зв'язування, оскільки приблизно 80% середньої відносної світлової одиниці, яку одержують при проведенні зв'язування мишачого IgG при УФ СВІТЛІ, виникає завдяки пасивним взаємодіям зв'язування Ряд біологічних молекул, які іммобілізуються через ковалентну Середнє (відносна світлова одиниця) 22368 24022 17586 20531 взаємодію, згідно з цим винаходом явно більш чітко визначений Очевидність ковалентного приєднання наведена в прикладах, описаних нижче У першому випадку керамічні субстрати силанізують APTES, а потім піддають реакції з біотиH-LC-сульфо NHS Контрольний керамічний субстрат не силанізують APTES, тому відсутні термінальні нуклеофільні МЬІ2- групи для реакції з сукцинімідиловим ефіром похідного біотину Ці субстрати потім піддають реакції з кон'югатом авідину і флуорецинізоціаноту, а флюоресценцію визначають за допомогою камери пристрою з зарядовим зв'язком Результати наведені в Таблиці З Таблиця З [Бютин-LC-NHS] 0 100 цг/мл 500 цг/мл Відносна світлова одиниця субстрату APTES (витримка 1сек) 2,448 8,881 7,922 Це ясно показує специфічну іммобілізацію бютину-LC-NHS Максимальна концентрація іммобілізованого біотину - LC-NHS становить приблизно 100мг/мл, оскільки показник відносної світлової одиниці для 500цг/мл субстрату не змінився В наступному прикладі керамічні субстрати, силанізовані APTES, піддають реакції з дипдразидним зшивальним агентом Сульфамідні антитіла обробляють перюдатом натрію з метою надання їм реактивності по відношенню до пдразидного зшивального агента Контрольні сульфамідні антитіла піддають простому діалізу проти буферного розчину ацетату натрію, який має рН 5,5 Значення Відновна світлова і одиниця контрольного субстрату (витримка 1сек) Флуоресцентного сигналу не виявлено -"-" відносної світлової одиниці наведені в Таблиці 4 (необроблені) і Таблиці 5 (оброблені перюдатним способом) Результати чітко показують, що пдразидний зшивальний агент успішно зв'язується з керамічною поверхнею Контрольні антитіла (без перюдатного активування) дали дуже погані стандартні криві у порівнянні з ковалентна іммобілізованими сульфамідними антитілами Процентні величини зв'язування завдяки ковалентним або пасивним взаємодіям порівнюються в Таблицях 6 і 7 На ковалентну взаємодію у середньому припадає 81,8% всього зв'язування, що чітко вказує на ковалентне зв'язування сульфамідних 22 54400 21 антитіл Таблиця 4 Сульфамід Сульфадоксин Сульфаметизол Сульфакпорпіразидин Сульсфаметоксипіридазин Сульфамеразин Сульфасоксазол Сульфатіазол Сульфаметазин Сульфахшоксалин Сульфадиметоксин Онг/мл 2825 3531 6476 1099 2177 4879 2932 Не виявлено 1041 804 10нг/мл 1456 1257 1585 928 1137 1108 814 Не виявлено 828 Не виявлено % В/Во 51 36 24 84 52 23 28 79 100нг/мл Не виявлено -"-"-" 1224 Не виявлено -"-"968 781 % В/Во 56 93 97 Таблиця 5 Сульфамід Сульфадоксин Сульфаметизол Сульфахлорпіридазин Сульфаметоксипіридазин Сульфамеразин Сульфасоксазол Сульфатіазол Сульфаметазин Сульфахшоксалин Сульфадиметоксин 0нг/мл 10520 17141 24944 14082 12594 24419 14279 3644 10575 5526 10нг/мл 3240 5689 7565 10509 5521 6686 4602 2810 6112 2554 % В/Во 31 33 ЗО 74 43 27 32 77 58 46 100нг/мл 2135 4882 2096 5687 3240 2270 2353 2213 5588 1983 % В/Во 20 28 8 40 26 9 16 61 53 36 Таблиця 6 Сульфамід Сульфадоксин Сульфаметизол Сульфахлорпіридазин Сульфаметоксипіридазин Сульфамеразин Сульфасоксазол Сульфатіазол Сульфаметазин Сульфахшоксалин Сульфадиметоксин Середнє Процент зв'язування сульфамідного антитіла Пасивні взаємодії Ковалентні взаємодії 26,9 73,1 20,6 79,4 26,0 74,0 7,8 92,2 17,3 82,7 20,0 80,0 20,6 79,4 90,2 85,4 81,8 9,8 14,6 18,2 Таблиця 7 Сульфамід Сульфадоксин Сульфаметизол Сульфахлорпіридазин Сульфаметоксипіридазин Сульфамеразин Сульфасоксазол Сульфатіазол Сульфаметазин Відносна світлова одиниця Пасивна Ковалентна 0 10нг/мл 0 10нг/мл 1950 904 32756 11131 2782 1359 39020 11132 4410 1051 39632 8434 1793 770 29489 13408 2011 988 28455 11077 4083 1031 38486 5774 2010 675 28837 8087 802 574 11331 7535 Продовження таблиці 7 23 Сульфамід Сульфахшоксалин Сульфадиметоксин 24 Відносна світлова одиниця Ковалентна Пасивна 13838 8716 951 13062 5832 910 54400 Ковалентна іммобілізація Пряме нанесення плям на глицидоксисиланову поверхню Пасивна іммобілізація Пряме нанесення плям на поверхню, оброблену дихлордиметилсиланом Очевидно, що ковалентний метод дає більш високі результати у порівнянні з пасивним методом Результати пасивного методу можна збільшити приблизно в 2 рази шляхом попередньої кислотної обробки сульфамідних антитіл, але вони все ж таки нижчі, ніж результати ковалентного ме 548 581 тоду Також проводиться підтверджуючий аналіз ХІМІЧНО модифікованого кремнію і керамічних субстратів з використанням рентгенофотонної спектроскопи Були записані оглядові спектри двох довільних ділянок кожного зразка субстратів, які призначені для визначення ХІМІЧНОГО складу їх поверхонь Результати наведені в Таблиці 8 (в атомних процентах) Таблиця 8 Зразок Кремнієвий субстрат (необроблений) Ділянка 1 2 Кремнієвий субстрат, 1 2 силанізований APTES 1 2 Кремнієвий субстрат APTES обробле1 ний ФІТЦ 2 Керамічний субстрат (необроблений) 1 2 Керамічний субстрат, 1 силанізований APTES 2 Керамічний субстрат APTES, обробле1 ний ФІТЦ 2 С 21,9 23,0 55,5 55,6 51,3 52,5 58,7 0 52,7 51,0 23,3 22,5 25,6 25,0 25,0 Si 25,4 26,0 10,5 10,9 13,0 12,3 9,6 Аі 58,8 27,2 27,1 47,0 45,9 52,0 24,7 46,3 46,6 31,6 31,7 29,3 51,0 30,6 Аналіз атомного складу показує дуже хорошу конверсію батьківського силікону і керамічних субстратів за допомогою органосилану APTES з хорошою відтворюванютю складу поверхні двох досліджуваних ділянок для кожного зразка Субстрати, мічені ФІТЦ, показують 70% і 77% маркування кремнію і керамічного матеріалу ВІДПОВІДНО КІЛЬКІСНІ методи флуоресцентного вимірювання на темному кремнієвому субстраті порівнюють з N 10,2 10,5 7,2 7,5 6,1 СІ 0,5 0,5 2,9 2,7 0,5 Са 9,8 11,3 9,6 13,4 13,7 11,3 13,3 14,8 2,6 3,3 2,4 6,0 5,4 5,3 5,0 0,8 1,4 1,1 0,5 0,7 11,7 2,3 4,5 результатами, одержаними на білому керамічному (оксид алюмінію) субстраті Результати по ВІДНОСНІЙ СВІТЛОВІЙ одиниці, одержані за допомогою пристрою з зарядовим зв'язком для флуоресцентних молекул (ФІТЦ), ковалентне зв'язаних з кожним субстратом, порівнюють з КІЛЬКІСНИМ методом після видалення ФІТЦ -молекул, використовуючи метод Hook та ІНШІ (Langmuir 1991, том 7, 142 151) Таблиця 9 Субстрат Керамічний Кремнієвий Час витримки зарядноз'єднувального пристрою (сек) 0,1 10 Середнє Сторона 1 Сторона 2 7483 7063 753 612 КІЛЬКІСНИЙ аналіз флуоресцентної позначки, одержаної в результаті видалення ФІТЦ - маркування від субстрату і вимірювання сигналу за допомогою камери пристрою з зарядовим зв'язком показують, що, незважаючи на 1000-кратне збільшення сигналу керамічного матеріалу порівняно з кремнієм, дійсно спостерігається значно більша КІЛЬКІСТЬ ФІТЦ - молекул на кремнієвому субстраті Це явище далі ілюструється прикладами, наведеними в Таблиці 10, одержаними в результаті КІЛЬКІСТЬ видолених ФІТЦ - молекул/субстрат 4,548 x 1 0 I D 1,412x10'° аналізу, який проводиться на кремнієвих і керамічних субстратах з використанням флуоресцентних латексних часток, пов'язаних з пролактиновим антитілом, яке використовується як визначальна система Наводиться також величина відносних світлових одиниць (витримка 20сек) 25 54400 26 Таблиця 10 Відносна світлова одиниця Кремнієвий субстрат Керамічний субстрат 814 8594 799 16735 /Пролактин/ Стандарт 550 MIU/мл 2200 MIU/мл Властивості керамічного матеріалу забезпечують вищі результати по-кремнію при використанні цього методу флуоресцентного визначення В подальшому проблеми дії темного тіла на кремній при використанні флуоресценції можна вирішити шляхом використання хемілюмінесценції як методу виявлення При порівнянні ідентичних аналізів фолікулостимулюючого гормону, які проводяться на кремнії і керамічному матеріалі з використанням хемілюмінесцентного визначення, останній потребував в два рази більшого часу ви \ \ \ \ \ тримки, ніж керамічний матеріал, для одержання такої ж величини відносної світлової одиниці В описі використані такі скорочення APTES - амшопропілтриетоксисилан, СК - MB - субодиниця, що створює фермент MB (кіназа), HRPO - піроксидаза хріну, LC - сульфо - NHS -сульфо - N - пдроксисукЦИНІМІД з довгим ланцюгом, FITC - ізотюкарбамат флуоресцеїну \ J(vi) J(iii) J(iv) Фіг. 1 О — он он Si Si Si—Si A! OH O H I I Al Al О — Al Фіг. 2 27 54400 28 -ОН -ОН Si (OR)3-Si-(CH2)n-X ОН (CH2)n-X Z-R-Y hO _O—-Si (CH2)n-X-'Z'-R-Y О H2NI hO, O — Si (CH2)n-X-Z-R-Y-NHФіг. З " O \ / \ - O—SKCH2)n-CH-CH2+ h O4 \ - O—Si-(CH2)n-NH2+ -O NH2 \ OH - О -Si-(CH2)rrCH-CH2-Nн / Cl I CH2 I -O H \ -O—Si-(CH2)n-N-CH2 Фіг. 4 -Ov О О \ /\ /\ -О—Si'(CH2)n-NH2+H2C-CH-CH2-O*PEG-O-CH2-CH-CH2 г\/ -оч I он о О—Si-(CH2)n-N-CH2-CH-CH2*O-PEG-O-CH2-CH-CH2 \jn I \ H2NOH і І O—SKCH2)n-N-CH2-CH-CH2-O-PEG-O-CH2-CH-CH2-N Фіг. 5 29 54400 -о \ - О—Si-(CH2)n-E+N-LIGAND Фіг. 6 Фіг. 7 Фіг. 8 ЗО -о \ - О — Si-(CH2)n-N-[LlGAND] 31 54400 32 ФІГ. 9 22 ГІГ" І О 23 24Фіг. 10 1 г 33 54400 34 -24 23 С27 • 1 Фіг. 11 33 Фіг. 12 35 54400 42 Фіг. 13 54 52 Фіг. 14А 37 54400 56 38 57 53 Г--1 ! 55 Фіг. 14В •43 Фіг. 14С 54400 39 40 120 100 1000 Фіг. 15 Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24