Антитіло, яке зв’язується зі зв’язаним з мембраною карциноембріональним антигеном (сеа)

Реферат: Винахід стосується виділеного антитіла, яке зв'язується зі зв'язаним з мембраною карциноембріональним антигеном (СЕА), виділеного полінуклеотиду, що кодує таке антитіло, вектора, що містить вказаний полінуклеотид, клітини-хазяїна, що містить вектор, композиції, способу індукції лізису пухлинної клітини, способу лікування індивідуума, який страждає на рак, способу подовження тривалості життя індивідуума, який страждає на рак та застосування такого антитіла або композиції для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування раку, при якому відбувається аномальна експресія CEA. UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Посилання на споріднені заявки Дана заявка претендує на пріоритет заявки на європейський патент № 11156665.9, зареєстрованої 2 березня 2011 р., повний опис якої включено в даний опис як посилання. Область техніки, до якої належить винахід Даний винахід належить до антигензв'язуючих молекул (АЗМ). Конкретні варіанти здійснення даного винаходу відносяться до рекомбінантних моноклональних антитіл, включаючи химерні, приматзовані або гуманізовані антитіла, які мають здатність до зв'язування з людським карциноембріональним антигеном (CEA). Передумови створення винаходу Карциноембріональний антиген (CEA) і антитіла до CEA Карциноембріональний антиген (CEA, який позначають також як CEACAM-5 або CD66e) являє собою глікопротеїн з молекулярною масою приблизно 180 кДа. CEA є представником суперсімейства імуноглобулінів і містить сім доменів, які пов'язані з клітинною мембраною за допомогою глікозилфосфатидилінозитольного якоря (GPI) (Thompson J.A., J Clin Lab Anal. 5, 1991, сс. 344–366). Сім доменів являють собою одну N-кінцеву варіабельну ділянку Ig і шість доменів (A1-B1-A2-B2-A3-B3), гомологічних константностей домену Ig (Hefta LJ та ін., Cancer Res. 52, 1992, сс. 5647-5655). Сімейство людських CEA містить 29 генів, з яких 18 точно визначені: 7 належать до підгрупи CEA і 11 до підгрупи специфічних глікопротеїнів вагітності. Кілька представників підгрупи CEA, ймовірно, мають здатність до клітинної адгезії. CEA, ймовірно, бере участь у розвитку вродженого імунітету (Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9(2), 1999, сс. 67-81). У зв'язку з наявністю білків, близькоспоріднених до CEA, може виникати задача отримання антитіл до CEA, специфічних щодо CEA, які мають при цьому мінімальну перехресну реактивність до інших близькоспоріднених білків. CEA раніше був ідентифікований як асоційований з пухлиною антиген (Gold і Freedman, J Exp Med., 121, 1965, сс. 439-462; Berinstein NL, J Clin Oncol., 20, 2002, сс. 2197-2207). Хоча CEA спочатку був класифікований як білок, який експресується тільки в ембріональній тканині, в даний час CEA виявлений в деяких типах здорових тканин дорослих особин. Ці тканини мають в основному епітеліальне походження і включають клітини шлунково-кишкової, респіраторної та сечостатевої систем, а також клітини ободової кишки, шийки матки, потових залоз і передміхурової залози (Nap та ін, Tumour Biol., 9 (2-3), 1988, сс. 145-153; Nap та ін., Cancer Res., 52(8), 1992, сс. 2329-2339). У пухлинах епітеліального походження, а також їх метастазах CEA присутній в якості асоційованого з пухлиною антигену. Хоча присутність CEA саме по собі не свідчить про перетворення в ракову клітину, розподіл CEA є показовим. У здорової тканини CEA, як правило, експресується на апікальній поверхні клітини (Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9(2), 1999, сс. 67-81), роблячи її недоступною для антитіла, присутнього в кровотоці. На відміну від здорової тканини у випадку ракових клітин CEA має тенденцію до експресії по всій їх поверхні (Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9 (2), 1999, сс. 67-81). Вказана зміна схеми експресії робить CEA доступним для зв'язування з антитілом в ракових клітинaх. Крім цього, в ракових клітинах зростає рівень експресії CEA. Крім того, підвищений рівень експресії CEA стимулює підвищену міжклітинну адгезію, що може призводити до метастазів (Marshall J., Semin Oncol., 30 (додаток 8), 2002, сс. 30-36). CEA легко відщеплюється від клітинної поверхні і проникає в кровоток з пухлин або безпосередньо, або через лімфатичні судини. Завдяки цій особливості рівень CEA в сироватці використовували в якості клінічного маркера для діагностики різних видів раку та скринінгу щодо рецидиву різних видів раку, перш за все колоректального раку (Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7, 1992, сс. 183-188; Chau I. та ін, J Clin Oncol., 22, 2004, сс.1420-1429; Flamini та ін., Clin Cancer Res; 12(23), 2006, сс. 6985-6988). Ця особливість визначає також одну з можливостей застосування CEA як мішень, оскільки присутній у сироватці CEA зв'язується з більшістю доступних в даний час антитіл до CEA, перешкоджаючи їх взаємодії з їх мішенями на клітинній поверхні і обмежуючи тим самим потенційні клінічні впливи. Створені численні моноклональні антитіла до CEA, придатні для дослідницьких цілей, в якості діагностичних "інструментів" і для терапевтичних цілей (див., наприклад, Nap та ін, Cancer Res., 52 (8), 1992, сс. 2329-2339; Sheahan та ін., Am. J. Clin. Path. 94, 1990, сс. 157-164; Sakurai та ін., J. Surg. Oncol., 42, 1989, сс. 39-46; Goldenberg D. M., The International Journal of Biological Markers, 7, 1992, сс. 183-188; Ledermann J. A., Br. J. Cancer, 58, 1988, с. 654; Ledermann J. A., Br. J. Cancer, 68, 1993, сс. 69-73; Pedley R. B. та ін, Br. J. Cancer, 68, 1993, сс. 69-73; Boxer G.M. та ін, Br. J. Cancer, 65, 1992, сс. 825-831). Chester з співавторами виділили 1 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одноланцюгове антитіло до CEA з фаговою дисплейною бібліотекою з метою використання для радіоімунодетекціі і радіоімунотерапії (US 5876691), і в подальшому це антитіло було гуманізовано (US 7232888). Антитіла до CEA виділяли також з людських фагових дисплейних бібліотек (US 5872215). Мишаче моноклональне антитіло PR1A3 отримували шляхом злиття клітин мієломи NS1 (P3/NS1/I-Ag-4-1) зі спленоцитами мишей, імунізованих здоровим колоректальним епітелієм (Richman PI і Bodmer WF, Int. J. Cancer, 39, 1987, сс. 317-328). Для PR1A3 характерно сильна взаємодія, як з добре, так і зі слабко диференційованими колоректальними карциномами, і воно має перевагу в порівнянні з іншими антитілами, які дають реакцію з колоректальним епітелієм, оскільки його антиген, ймовірно, фіксований на пухлини і не присутній в лімфатичних судинах або здорових лімфатичних вузлах, дренуючих пухлину (Granowska M. та ін, Eur. J. Nucl. Med., 20, 199, сс. 690-698, 1989). Наприклад, встановлено, що PR1A3 вступав у взаємодію з 59 з 60 колоректальних пухлин (Richman PI і Bodmer WF, Int. J. Cancer, 39, 1987, сс. 317-328), в той час як реактивне у відношення CEA антитіло B72. 3 взаємодіяло тільки з 75 % колоректальних пухлин (Mansi L. та ін., Int J Rad Appl Instrum B., 16(2), 1989, сс. 127-135). Епітопне картування PR1A3 продемонструвало, що мішенню антитіла є B3-домен і GPI-якір молекули CEA (Durbin H. та ін, Proc. Natl. Scad. Sci. USA, 91, 1994, сс. 4313-4317). Таким чином, антитіло PR1A3 зв'язується тільки зі зв'язаним з мембраною CEA, але не з розчинною формою CEA, яка може бути присутньою в кровотоці які страждають на рак пацієнтів. Завдяки зазначеній особливості зв'язування малоймовірно, щоб антитіло PR1A3 секвеструвалося сироватковим CEA; навпаки, його мішенню може бути CEA, експресований на ракових клітинах. Епітоп, з яким зв'язується PR1A3, являє собою конформаційний епітоп, а не лінійний епітоп, що, ймовірно, обумовлює зниження зв'язування PR1A3 з розчинною CEA (Stewart та ін., Cancer Immunol Immunother, 47, 1999, сс. 299-306). Раніше антитіло PR1A3 гуманізували шляхом трансплантації CDR мишачого батьківського антитіла в каркасні ділянки 1-3 важкого ланцюга людського антитіла RF-TS3'CL (у якого зберігали мишачу каркасну ділянку 4 PR1A3) і в каркасні ділянки легкого ланцюга антитіла REI (Stewart та ін, Cancer Immunol Immunother, 47, 1999, сс. 299-306). Зазначена гуманізована версія PR1A3 зберігала специфічність і пов'язувалася з експресованими на поверхні CEA з афінністю, подібною з афінністю мишачого антитіла (Stewart та ін, Cancer Immunol Immunother, 47, 1999, сс. 299-306; US 5965710). Встановлено, що гуманізоване антитіло PR1A3 (hPR1A3) індукувало цілеспрямоване знищення ліній клітин колоректального раку (Conaghhan PJ та ін, Br. J. Cancer, 98 (7), сс. 1217-1225). Однак афінність hPR1A3 до CEA виявилася відносно низькою. Мічені за допомогою радіоактивних ізотопів антитіла до CEA застосовували в клінічних випробуваннях на пацієнтах, що страждають на колоректальний рак. Наприклад, мічене за 123 допомогою I химерне мінітіло T84.66 (cT84.66) застосовували в пілотному клінічному дослідженні на пацієнтах, що страждають на колоректальний рак. Мічене за допомогою радіоактивних ізотопів мінітіло мало здатність направлено впливати на ракові клітини (Wong JY (131) та ін, Clin Cancer Res. 10 (15), 2004, сс. 5014-5021). В іншому прикладі I-лабетузумаб, тобто мічене за допомогою радіоактивного ізотопу антитіло до CEA, оцінювали як засіб допоміжної терапії на пацієнтах, які страждали на колоректальний рак, що дає метастази в печінку, і були отримані обнадійливі результати, що стосуються виживаності (Liersch T. та ін., Ann. Surg. Oncol. 14(9), 2007, сс. 2577-2590). Глікозилювання антитіл Олігосахарідний компонент може мати суттєвий вплив на властивості, що мають відношення до ефективності терапевтичного глікопротеїну, включаючи фізичну стабільність, стійкість до впливу протеаз, взаємодії з імунною системою, фармакокінетичні параметри і специфічну біологічну активність. Зазначені властивості можуть залежати не тільки від присутності або відсутності олігосахаридів, але також від їх специфічних структур. Можна зробити певні узагальнення, що стосуються взаємозв'язку між структурою олігосахариду і функцією глікопротеїну. Наприклад, деякі структури олігосахариду опосередковують швидкий кліренс глікопротеїну з кровотоку в результаті взаємодій зі специфічними зв'язуючими вуглеводи білками, а інші можуть зв'язуватися антитілами, і запускати небажані імунні реакції (Jenkins N. та ін., Nature Biotechnol. 14, 1996, сс. 975-981). Було встановлено, що клітини ссавців є кращими хазяїнами для виробництва терапевтичних глікопротеїнів завдяки їх здатності глікозилювати білки з отриманням найбільш прийнятної для застосування на людині форми (Cumming DA та ін, Glycobiology 1, 1991, сс. 115-130; Jenkins N. та ін., Nature Biotechnol. 14, 1996, сс. 975-981). Бактерії дуже рідко глікозилюють білки, і подібно іншим типам звичайних хазяїнів, таких як клітини дріжджів, нитчастих грибів, комах і рослин, забезпечують схеми глікозилювання, асоційовані з швидким кліренсом з кровотоку, небажаними 2 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імунними взаємодіями і в деяких випадках зниженою біологічною активністю. Серед клітин ссавців клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO) знайшли найбільш широке застосування протягом двох останніх десятиліть. Крім забезпечення прийнятних схем глікозилювання ці клітини дозволяють стійко отримувати генетично стабільні, високопродуктивні клональні клітинні лінії. Їх можна культивувати, досягаючи високої щільності, в простих біореакторах з використанням бессироваткових середовищ, і на їх основі можна розробляти безпечні та відтворювані біопроцеси. Іншими застосовуваними зазвичай клітинами тварин є клітини нирки дитинчати хом'яка (BHK), клітини мишачої мієломи NSО і SP2 / 0. В останні роки вивчали також можливість їх виробництва у трансгенних тваринах (Jenkins N. та ін… Nature Biotechnol. 14, 1996, сс. 975-981). Всі антитіла містять вуглеводні структури в консервативних положеннях в константних ділянках важкого ланцюга, при цьому кожен ізотип характеризується різною організацією Nпов'язаних вуглеводних структур, які надають різну дію на складання, секрецію і функціональну активність білка (Wright A. і Monison S.L., Trends Biotech. 15, 1997, сс. 26-32). Структура приєднаного N-зв'язаного вуглеводу значно варіюється залежно від ступеня процесування і може включати такі, що мають високий вміст манози, безліч розгалужень, а також біантенні складні олігосахариди (Wright A. і Morrison SL, Trends Biotech. 15, 1997, сс. 26-32). Як правило, має місце гетерогенний процесинг корових олігосахаридних структур, приєднаних у конкретному сайті глікозилювання, в результаті чого навіть моноклональні антитіла існують у вигляді декількох глікоформ. Було встановлено також, що основні відмінності в глікозилюванні антитіл мають місце між клітинними лініями, і навіть при вирощуванні даної клітинної лінії в інших умовах культивування виявлені невеликі відмінності (Lifely MR та ін., Glycobiology 5(8), 1995, сс. 813-22). Одним із шляхів досягнення значного підвищення ефективності при збереженні простого процесу одержання і, який, мабуть, може забезпечувати відсутність значних небажаних побічних дій, є посилення що зустрічаються в природних умовах обумовлених клітиною ефекторних функцій моноклональних антитіл шляхом конструювання їх олігосахаридного компонента згідно з методом, описаним у Umana P. та ін., Nature Biotechnol. 17, 1999, сс. 176180; і US 6602684; повний зміст зазначених документів включено в даний опис як посилання. Антитіла IgGl-типу, які найбільш часто застосовують в імунотерапії раку, являють собою глікопротеїни, такі, що мають консервативний N-зв'язаний сайт глікозилювання на Asn297 в кожному CH2-домені. Два складних біантенних олігосахариду, приєднаних до Asn297, розташовуються між CH2-доменами, формуючи великі контакти з поліпептидним каркасом, і їх присутність є важливим для того, щоб антитіло могло здійснювати ефекторні функції, такі як антитіло-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність (ADCC) (Lifely MR та ін., Glycobiology 5, 1995, сс. 813-822; Jefferis R. та ін., Immunol. Rev. 163, 1998, сс. 59-76; Wright A. і Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15, 1997, сс. 26-32). Раніше Umaña з співавторами встановили, що надекспресія β(1,4)-Nацетилглюкозамінілтрансферази III ("GnTIII"), тобто глікозілтрансферази, яка каталізує утворення бісекційних олігосахаридів в клітинах яєчника китайського хом'яка (СНО), значно підвищує in vitro ADCC-активність антінейробластомного химерного моноклонального антитіла (chCE7), продукованого сконструйованими CHO-клітинами (див. Umana P. та ін., Nature Biotechnol. 17, 1999, сс. 176-180; та публікацію міжнародної заявки на патент WO 99/154342, повний зміст яких включено в даний опис як посилання). Антитіло chCE7 належить до великого класу некон'югованих МАт, які мають високий рівень афінності та специфічності відносно пухлин, але мають занадто низьку ефективність для їх клінічного застосування при виробництві в стандартних вживаних в промисловості клітинних лініях, в яких відсутній фермент GnTIII (Umana P. та ін., Nature Biotechnol. 17, 1999, сс. 176-180). У цьому дослідженні вперше було продемонстровано, що значне підвищення ADCC-активності можна досягати шляхом створення продукуючих антитіла клітин, які експресують GnTIII, що призводить також до підвищення відносного вмісту асоційованих з константною ділянкою (Fc) бісекційних олігосахаридів, включаючи бісекційні нефукозільовані олігосахариди, порівняно з рівнями, характерними для таких, що зустрічаються в природних умовах антитіл. Таким чином, зберігається необхідність у поліпшених терапевтичних підходах, заснованих цілеспрямованій дії на CEA, зокрема, на пов'язаний з мембраною CEA, для лікування різних видів раку. Короткий виклад суті винаходу Одним з об'єктів винаходу є варіант антигензв'язуючої молекули (АЗМ), такої як антитіло, який зв'язується зі зв'язаним з мембраною карциноембріональним антигеном (CEA). В одному з варіантів здійснення винаходу АЗМ має підвищену стабільність в порівнянні з її батьківською 3 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекулою. В одному з варіантів здійснення винаходу АЗМ має підвищену стабільність і зберігає або має поліпшену афінність зв'язування зі зв'язаним з мембраною CEA в порівнянні з її батьківською молекулою. В одному з варіантів здійснення винаходу АЗМ є стабільною при температурі, яка щонайменше на 0,5, 1,0, 1,5 або 2,0 °С вище, ніж температура, при якій зберігає стабільність її батьківська молекула. В одному з варіантів здійснення винаходу підвищену стабільність оцінюють за допомогою аналізу динамічного розсіювання світла. В одному з варіантів здійснення винаходу батьківська молекула, з якою проводять порівняння, являє собою антитіло PR1A3 або гуманізовану версію антитіла PR1A3. В одному з варіантів здійснення винаходу батьківська молекула, з якою проводять порівняння, являє собою гуманізовану версію антитіла PR1A3, яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга CH7A (SEQ ID NO: 101) і варіабельну ділянку легкого ланцюга 2F1 (SEQ ID NO: 209). В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули є стабільним при температурі 67 °С або вище при оцінці, наприклад, за допомогою аналізу методом динамічного розсіювання світла. В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язування варіанту антигензв'язуючої молекули зі зв'язаним з мембраною CEA характеризується величиною Kd 100нм-менш. В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язування варіанту антигензв'язуючої молекули зі зв'язаним з мембраною CEA характеризується величиною Kd 10нM- або менше. В одному з варіантів здійснення винаходу АЗМ містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить CDR1 важкого ланцюга, вибраний з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 12, CDR2 важкого ланцюга, вибраний з групи, що складається з SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 24, і CDR3 важкого ланцюга, вибраний з групи, що складається із SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 і SEQ ID NO: 224. В одному з варіантів здійснення винаходу АЗМ містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить CDR1 легкого ланцюга, вибраний з групи, що складається з SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45, і CDR2 легкого ланцюга, вибраний з групи, що складається з SEQ ID NO: 46 і SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 і SEQ ID NO: 55, і CDR3 легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 56. В іншому варіанті здійснення винаходу варіабельна ділянка важкого ланцюга АЗМ містить CDR1 важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 1, CDR2 важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 13, CDR3 важкого ланцюга, вибраний з групи, що складається із SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 і SEQ ID NO: 224; і варіабельна ділянка легкого ланцюга АЗМ містить CDR1 легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 39, CDR2 легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 49, і CDR3 легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 56. У наступному варіанті здійснення винаходу АЗМ містить каркасні ділянки CH1A1A (SEQ ID NO: 261) або CH1A1B (SEQ ID NO: 262). В одному з варіантів здійснення винаходу варіабельна ділянка важкого ланцюга АЗМ містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 % ідентична послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 і SEQ ID NO: 247, і варіабельна ділянка легкого ланцюга АЗМ містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 % ідентична послідовності SEQ ID NO: 209. В одному з варіантів здійснення винаходу варіабельна ділянка важкого ланцюга АЗМ містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 233, SEQID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 і SEQ ID NO: 247, і варіабельна ділянка легкого ланцюга АЗМ містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 209. У деяких варіантах здійснення винаходу АЗМ містить Fc-ділянку, наприклад, Fc-ділянку людського IgG. У деяких варіантах здійснення винаходу АЗМ є або антитіло або його фрагмент, наприклад, повне антитіло, scFvфрагмент, Fv-фрагмент, F (ab ') 2-фрагмент, мінітіла, димерне антитіло (діабоді), тримерне антитіло (тріабоді) або тетрамерне антитіло (тетрабоді). Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло, яке зв'язується зі зв'язаним з мембраною CEA, де антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає CDR1 важкого ланцюга, вибраний з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 12, CDR2 важкого ланцюга, вибраний з групи, що складається із SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, 4 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 24, і CDR3 важкого ланцюга, вибраний з групи, що складається із SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 і SEQ ID NO: 224. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло має більш високу стабільність в порівнянні з його батьківською молекулою. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло є стабільним при температурі, яка щонайменше на 0,5, 1,0, 1,5 або 2,0 °С вища, ніж температура, при якій зберігає стабільність його батьківська молекула. В одному з варіантів здійснення винаходу підвищену стабільність оцінюють за допомогою аналізу динамічного розсіювання світла. В одному з варіантів здійснення винаходу батьківська молекула, з якою проводять порівняння, являє собою антитіло PR1A3 або гуманізовану версію антитіла PR1A3. В одному з варіантів здійснення винаходу батьківська молекула, з якою проводять порівняння, являє собою гуманізовану версію антитіла PR1A3, яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга CH7A (SEQ ID NO: 101) і варіабельну ділянку легкого ланцюга 2F1 (SEQ ID NO: 209). В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло є стабільним при температурі 67ºС або вище при оцінці, наприклад, за допомогою аналізу методом динамічного розсіювання світла. В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язування антитіла зі зв'язаним з мембраною CEA характеризується величиною Kd 100нмабоменш. В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язування антитіла зі зв'язаним з мембраною CEA характеризується величиною Kd 10нM або менше. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло містить також варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка включає CDR1 легкого ланцюга, вибраний з групи, що складається з SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45, і CDR2 легкого ланцюга, вибраний з групи, що складається з SEQ ID NO: 46 і SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 і SEQ ID NO: 55, і CDR3, що має SEQ ID NO: 56. В одному з варіантів здійснення винаходу варіабельна ділянку важкого ланцюга антитіла містить CDR1 важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 1, CDR2 важкого ланцюга, який має f SEQ ID NO: 13, CDR3 важкого ланцюга, вибраний з групи, що складається із SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 і SEQ ID NO: 224; і варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла містить CDR1 легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 39, CDR2 легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 49, і CDR3 легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 56. У наступному варіанті здійснення винаходу антитіло містить каркасні залишки CH1A1A (SEQ ID NO: 261) або CH1A1B (SEQ ID NO: 262). В одному з варіантів здійснення винаходу варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 % ідентична послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 24 і SEQ ID NO: 247, та варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 % ідентична послідовності SEQ ID NO: 209. В одному з варіантів здійснення винаходу варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 і SEQ ID NO: 247, і варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 209. У деяких варіантах здійснення винаходу АЗМ або антитіло з вищевказаних варіантів здійснення винаходу пов'язується з тим же епітопом, що і мишаче моноклональне антитіло PR1A3, або має здатність конкурувати за зв'язування з ним з мишачим моноклональним антитілом PR1A3. В одному з варіантів здійснення винаходу АЗМ або антитіло містить Fc-ділянку, піддану глікоінженерії. В одному з варіантів здійснення винаходу щонайменше від приблизно 20 % до приблизно 100 % N-пов'язаних олігосахаридів в Fc-ділянці створеного за допомогою глікоінженерії антитіла є нефукозильованими. В одному з варіантів здійснення винаходу щонайменше від приблизно 20 % до приблизно 100 % N-пов'язаних олігосахаридів у створеній за допомогою глікоінженерії Fc-ділянці є бісекційними. В одному з варіантів здійснення винаходу щонайменше від приблизно 20 % до приблизно 50 % N-пов'язаних олігосахаридів у створеній за допомогою глікоінженерії Fc-ділянці є бісекційними, нефукозильованими. В одному з варіантів здійснення винаходу створена / створене за допомогою глікоінженерії АЗМ або антитіло має щонайменше одну підвищену ефекторну функцію. Підвищена ефекторна функція являє собою, наприклад, підвищену афінність зв'язування з Fc-рецептором, підвищену антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (ADCC), підвищену здатність зв'язуватися з NK-клітинами, підвищену здатність зв'язуватися з макрофагами, підвищену здатність 5 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язуватися з моноцитами, підвищену здатність зв'язуватися з поліморфноядерними клітинами, контролювання передачі сигналів, які індукують апоптоз, підвищене дозрівання дендритних клітин і підвищене примірування T-клітин. В одному з варіантів здійснення винаходу створена / створене за допомогою глікоінженерії АЗМ або антитіло має ADCC, підвищену від приблизно на 40 % до приблизно на 100 % в порівнянні з не підданою глікоінженерії батьківською антигензв'язуючою молекулою. Іншим об'єктом винаходу є виділений полінуклеотид, який кодує АЗМ або антитіло по одному з описаних вище варіантів здійснення винаходу. Іншим об'єктом винаходу є вектор, що містить полінуклеотид, який кодує АЗМ або антитіло по одному з описаних вище варіантів здійснення винаходу. Іншим об'єктом винаходу є клітина-хазяїн, що містить вказаний вектор. Іншим об'єктом винаходу є композиція, що містить АЗМ або антитіло по одному з описаних вище варіантів здійснення винаходу і фармацевтично прийнятний носій. Іншим об'єктом винаходу є спосіб індукції клітинного лізису пухлинної клітини, що полягає в тому, що приводять у контакт пухлинну клітину з АЗМ або антитілом по одному з описаних вище варіантів здійснення винаходу. В одному з варіантів здійснення винаходу пухлинна клітина являє собою клітину колоректального раку, NSCLC (недрібноклітинний рак легені), клітину раку шлунка, клітину раку підшлункової залози чи клітинку раку молочної залози. В одному з варіантів здійснення винаходу клітинний лізис індукується антитілозалежною клітинною цитотоксичністю АЗМ або антитіла. Іншим об'єктом винаходу є спосіб лікування індивідуума, який страждає на рак, при якому відбувається аномальна експресія CEA, що полягає в тому, що вводять індивідууму в терапевтично ефективній кількості АЗМ або антитіло за одним з описаних вище варіантів здійснення винаходу. Іншим об'єктом винаходу є спосіб подовження часу доживання індивідуума, який страждає на рак, при якому відбувається аномальна експресія CEA, що полягає в тому, що вводять вказаному індивідууму в терапевтично ефективній кількості АЗМ або антитіло за одним з описаних вище варіантів здійснення винаходу. В одному з варіантів здійснення винаходу рак являє собою колоректальний рак, NSCLC (недрібноклітинний рак легені), рак шлунка, рак підшлункової залози або рак молочної залози. У деяких варіантах цих способів АЗМ, антитіло або композицію застосовують у поєднанні з хіміотерапією або променевою терапією. В одному з варіантів здійснення винаходу індивідуум являє собою людину. Іншим об'єктом винаходу є застосування АЗМ або антитіла за одним з описаних вище варіантів здійснення винаходу для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування індивідуума, який страждає на рак, при якому відбувається аномальна експресія CEA. В одному з варіантів здійснення винаходу рак вибирають з групи, що включає колоректальний рак, NSCLC (недрібноклітинний рак легені), рак шлунка, рак підшлункової залози та рак молочної залози. Короткий опис креслень На кресленнях показано: на фіг. 1 - схематична діаграма антигену CEA (CEACAM-5, CD66e). Антитіло PR1A3 зв'язується специфічно з B3-доменом антигену в тому випадку, коли він пов'язаний з клітинною мембраною; на фіг. 2 - дані, що демонструють більш високу ADCC-активність створеного за допомогою глікоінженерії химерного антитіла PR1A3 в порівнянні з не підданим глікоінженерії химерним антитілом PR1A3 при використанні людських PBMC в якості клітин-ефекторів; на фіг. 3 - порівняння антигензв'язуючої активності гуманізованого антитіла PR1A3, яке містить конструкцію варіабельної ділянки важкого ланцюга, а саме CH7A, і конструкцію варіабельної ділянки легкого ланцюга, а саме CL1A, і химерного антитіла PR1A3; на фіг. 4 - сайти рандомізації, призначені для створення бібліотекою антитіл для дозрівання афінності легкого ланцюга гуманізованого антитіла PR1A3. Рандомізовані позиції позначені символом X; на фіг. 5 - сайти рандомізації, призначені для створення бібліотекою антитіл для дозрівання афінності важкого ланцюга гуманізованого антитіла PR1A3. Рандомізовані позиції позначені символом X; на фіг. 6 - дані про активність зв'язування антитіл до CEA з дозрілою афінністю, виведених з гуманізованого антитіла PR1A3, яке містить конструкцію варіабельної ділянки важкого ланцюга CH7ArF9 і конструкцію варіабельної ділянки легкого ланцюга CL1ArH11; на фіг. 7 - результати досліду з оцінки ефективності, проведеного на SCID / bg-мишах, яким вводили всередину селезінки клітини людської колоректальної карциноми лінії LS174T для 6 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 створення ортотопічної моделі пухлини. Лікування антитілом починали через сім днів шляхом ін'єкції антитіла в дозі 25 мг / кг ваги тіла з наступним здійсненням двох додаткових ін'єкцій один раз на тиждень. "CH7A" означає представлене в даному описі гуманізоване антитіло, що містить CDR PR1A3. "SM3E" означає раніше створене антитіло до CEA. "GA201" означає гуманізоване антитіло до EGF, яке застосовували в якості позитивного контролю. "ЗФР" означає забуферений фосфатом фізіологічний розчин, який застосовували в якості негативного контролю. Виживання оцінювали з використанням критеріїв завершення, встановлених швейцарськими регулюючими органами; на фіг. 8 - результати досліду з оцінки ефективності, проведеного на SCID / bg-мишах, яким вводили внутрішньовенно клітини карциноми легені лінії A549, підживлюючи пухлини в легені тварин. Лікування антитілом починали через сім днів шляхом ін'єкції антитіла в дозі 25 мг / кг ваги тіла з наступним здійсненням двох додаткових ін'єкцій один раз на тиждень. "CH7A", "SM3E" і "GA201" мають значення, подані вище на фіг. 7. "CH7ArF9 CL1A rH11" означає варіант антитіла CH7A з важкими і легкими ланцюгами з дозрілою афінністю. Скорочення "ge" означає, що антитіло створено за допомогою глікоінженерії, в результаті у нього знижено кількість фукозільованих олігосахаридів в Fc-ділянці. "Наповнювач" означає негативний контроль. Клітини карциноми легені лінії A549 є виражено позитивними відносно експресії EGFR і слабо позитивними відносно експресії CEA; на фіг. 9 - результати досліду з оцінки ефективності, проведеного на SCID / bg-мишах, яким вводили всередину селезінки клітини шлункової карциноми лінії MKN45, отримуючи метастази пухлин в печінці тварин. "CH7ArF9 CL1A rH11", "SM3E", "ge" і "ЗФР" мають значення, подані на фіг. 7 і 8, вище; на фіг. 10 - результати аналізу кінетичних характеристик клонів з дозрілою афінністю: (a)сенсограмми Fab-фрагментів антитіл до CEA, мають важкий ланцюг з дозрілою афінністю CH7A H4E9 (SEQ ID NO: 199) у поєднанні з легким ланцюгом з недозрілою афінністю CL1A (SEQ ID NO: 105); легкий ланцюг з дозрілою афінністю CL1A pAC18 (SEQ ID NO: 209), об'єднану з важким ланцюгом з недозрілою афінністю CH7A; та їх комбінації, а саме CH7A H4E9 і CL1A pAC18 (SEQ ID NO: 199 і 209); (б) узагальнення результатів аналізу кінетичних характеристик клонів з дозрілою афінністю; на фіг. 11 - схематичне зображення заснованої на ПЛР стратегії (ПЛР-стратегії) рандомізації CDR1 і CDR2 гуманізованого важкого ланцюга CH7A антитіла до CEA; на фіг. 12 - схематичне зображення ПЛР-стратегії рандомізації CDR1 і CDR2 гуманізованого легкого ланцюга CL1A антитіла до CEA; на фіг. 13 - схематичне зображення ПЛР-стратегії рандомізації CDR3 гуманізованого важкого ланцюга CH7A антитіла до CEA; на фіг. 14 - схематичне зображення ПЛР-стратегії рандомізації CDR3 гуманізованого легкого ланцюга CL1A антитіла до CEA; на фіг. 15 - дані про афінність зв'язування антитіл до CEA зі зв'язаним з мембраною CEA на клітинах-мішенях лінії MKN45. Гуманізовані антитіла до CEA мали або легкі ланцюги з дозрілою афінністю (панель A, CH7A, CL1ArH7 або CH7A, CL1ArH11), або і важкі, і легкі ланцюги з дозрілою афінністю (панель Б, CH7A rB9, CL1A rH11 G2 (1)), які при перетворенні на формат IgG відрізнялися поліпшеною здатністю до зв'язування в порівнянні з контрольним антитілом (CH7A, CL1A); на фіг. 16 - порівняння результатів аналізу антитіло-обумовленої клітинозалежної цитотоксичності (ADCC) антитіл з дозрілою афінністю (CH7ArB9, CL1A rH11G2 (1), CH7Arf9, CL1A rH11G2 (1) і CH7A, CL1A rH11 G2 (1)) і контрольних антитіл (CH7A, CL1A G2(R2); на фіг. 17 - порівняння результатів аналізу клітинного зв'язування антитіла до CEA, що має важкий ланцюг CH1A, і мишачого-людського химерного антитіла chPR1A3; на фіг. 18 - результати аналізу клітинного зв'язування антитіл до CEA, які мають важкий ланцюг CH1A1, CH1A2, CH1A3 або CH1A4 і легкий ланцюг 2F1; на фіг. 19 - результати оцінки стабільності антитіл до CEA, які мають важкий ланцюг CH1A1, CH1A2, CH1A3 або CH1A4; на фіг. 20 - результати аналізу методом резонансу поверхневого плазмону (SPR) антитіл до CEA, отриманих з CH1A1; на фіг. 21 - результати аналізу клітинного зв'язування антитіл до CEA, отриманих з CH1A1; на фіг. 22 - дані про афінність, отримані методом резонансу поверхневого плазмону (SPR) (при оцінці в двовалентній формі), стабільно сконструйованих антитіл до CEA в порівнянні з батьківським антитілом з важким ланцюгом 5HFF12; на фіг. 23 і 24 - результати оцінки стабільності антитіла з дозрілою афінністю 5HFF12 в порівнянні з його батьківським антитілом з важким ланцюгом CH7A з вибраними 7 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 індивідуальними інтродукованими точковими мутаціями в 5HFF12; на фіг. 25 - результати аналізу методом резонансу поверхневого плазмону об'єднаних варіантів каркасної ділянки та CDR-H3; на фіг. 26 - дані про ADCC-активності варіантів каркасної ділянки на основі CHA1A; на фіг. 27 - дані про ADCC-активності варіантів каркасної ділянки на основі CHA1A; на фіг. 28 - дані про ADCC-активності об'єднаних варіантів каркасної ділянки CDR-H3; на фіг. 29 - дані про ADCC-активності об'єднаних варіантів каркасної ділянки CDR-H3; на фіг. 30 - дані про ефективність створеного за допомогою глікоінженерії антитіла до CEA CH1A1A (Y98A/D99Y) x 2F1, отримані на моделі колоректальної карциноми, яка створена з використанням ксенотрансплантата на SCID-мишах, трансгенних за людським CD16; на фіг. 31 - дані про ефективність створеного за допомогою глікоінженерії антитіла до CEA CH1A1A (Y98A/D99Y) x 2F1, отримані на моделі карциноми легені A549, яка створена з використанням ксенотрансплантата на SCID-мишах, трансгенних за людським CD16; на фіг. 32 - амінокислотні послідовності CDR різних анти -CEA АЗМ; на фіг. 33 - амінокислотні послідовності конструкцій легких ланцюгів різних анти-CEA АЗМ; на фіг. 34A-В - амінокислотні послідовності CDR важких і легких ланцюгів з дозрілою афінністю і дані про відповідні афінності зв'язування; на фіг. 35 - константи афінності антитіл з дозрілою афінністю з різними послідовностями; на фіг. 36 - амінокислотні послідовності CDR-Н3 різних анти-CEA АЗМ; на фіг. 37A-В - амінокислотні послідовності VH-ділянок різних анти-CEA АЗМ; на фіг. 38 - результати порівняльного аналізу амінокислотних послідовностей VH-ділянок зрілих антитіл до CEA, які мають різну стабільність. Докладний опис винаходу Визначення Поняття, що застосовуються в даному описі, мають значення, загальноприйняті в даній галузі, якщо із контексту не випливає інше. У контексті даного опису поняття "антигензв'язуюча молекула" в найбільш широкому сенсі відноситься до молекули, яка специфічно зв'язується з антигенною детермінантою. Прикладом антигензв'язуючої молекули є (але, не обмежуючись лише ним) антитіло або його фрагмент, який зберігає здатність специфічно зв'язуватися зі специфічним антигеном. Більш конкретно, в контексті даного опису "антигензв'язуюча молекула, яка зв'язується зі зв'язаним з мембраною людським карциноембріональним антигеном (CEA)», являє собою АЗМ, яка специфічно зв'язується з CEA, більш конкретно, з присутнім на клітинній поверхні або пов'язаним з мембраною CEA. Поняття "специфічно зв'язується" означає, що зв'язування є виборчим відносно антигену і його можна відрізняти від небажаних або неспецифічних взаємодій. У контексті даного опису поняття "антитіло" відноситься до повних молекул антитіл, включаючи моноклональні, поліклональні і мультіспеціфічні (наприклад, біспеціфічні) антитіла, а також фрагменти антитіл, які мають Fc-ділянку і зберігають специфічність зв'язування, і до злитих білків, які включають ділянку, еквівалентну Fc-ділянки імуноглобуліну, і які зберігають специфічність зв'язування. Під обсяг винаходу підпадають також фрагменти антитіл, які зберігають специфічність зв'язування, такі як (але, не обмежуючись лише ними) VH-фрагменти, VL-фрагменти, Fab-фрагменти, F (ab ') 2-фрагменти, scFv-фрагменти, Fv-фрагменти, мінітіла, димерні, тримерні і тетрамерні антитіла (див., наприклад, Hudson і Souriau, Nature Med. 9, 2003, сс. 129-134). У контексті даного опису поняття "антигензв'язуючий домен" належить до частини антигензв'язуючої молекули, яка містить ділянку, специфічно зв'язуватися і яка є комплементарною частини антигену або повного антигену. Якщо антиген є великим, то антигензв'язуюча молекула може зв'язуватися тільки з конкретною частиною антигену, яку називають епітопом. Антигензв'язуючий центр може являти собою, наприклад, один або кілька варіабельних доменів антитіла. Переважно антигензв'язуючий центр містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL) антитіла та варіабельну ділянку важкого ланцюга (VH) антитіла. У контексті даного опису поняття "з дозрілою афінністю" щодо антигензв'язуючих молекул (наприклад, антитіл) відноситься до антигензв'язуючої молекули, отриманої з антигензв'язуючої референс-молекули, наприклад, за допомогою мутацій, яка зв'язується з тим же антигеном, переважно пов'язується з тим же епітопом, що і референс-антитіло; і яка має більш високу афінність до антигену в порівнянні з антигензв'язуючою референс-молекулою. Дозрівання афінності, як правило, включає модифікацію одного або декількох амінокислотних залишків в одному або декількох CDR антигензв'язуючої молекули. Як правило, антигензв'язуюча молекула з дозрілою афінністю пов'язується з тим же епітопом, що і початкова антигензв'язуюча референс-молекула. 8 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У контексті даного опису "афінність зв'язування", як правило, описують за допомогою понять констант асоціації або дисоціації (Ka або Kd відповідно), які, в свою чергу, являють собою зворотні відносини величин констант швидкості дисоціації та асоціації (k d і ka відповідно). Таким чином, еквівалентні афінності можуть відповідати різним константам швидкості, якщо співвідношення констант швидкості залишається таким же. У контексті даного опису поняття "Fc-ділянка" відноситься до C-кінцевий ділянки важкого ланцюга IgG. Хоча прилеглі до Fc-ділянки ділянки важкого ланцюга IgG можуть злегка відрізнятися, Fc-ділянка важкого ланцюга людського IgG, як правило, являє собою ділянку ланцюга, що тягнеться від амінокислоти Cys226 до карбоксильного кінця. У контексті даного опису поняття "ділянка, еквівалентна Fc-ділянки імуноглобуліну" відноситься до алельних варіантів що зустрічаються в природних умовах Fc-ділянки імуноглобуліну, а також варіантів, які мають зміни, які отримують в результаті замін, додавань або делецій, але які не знижують в значній мірі здатність імуноглобуліну опосередковувати ефекторні функції (такі як антитіло-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність). Наприклад, одну або кілька амінокислот можна вилучати шляхом делеції з N-кінця або C-кінця Fc-ділянки імуноглобуліну без істотного зниження біологічної функції. Такі варіанти можна відбирати згідно з загальними правилами, які відомі в даній галузі, так, щоб надавати мінімальний вплив на активність (див., наприклад, Bowie J. U. та ін., Science 247, 1990, сс. 1306-1310). У контексті даного опису поняття "пов'язаний з мембраною людський CEA" відноситься до людського карциноембріонального антигену (CEA) », який пов'язаний з що представляє собою мембрану ділянкою клітини або з поверхнею клітини, зокрема, поверхнею пухлинної клітини. Поняття "пов'язаний з мембраною людський CEA" може в певних обставинах відноситися до CEA, який не пов'язаний з мембраною клітини, але який був сконструйований так, щоб оберігати епітоп від зв'язування з антитілом PR1A3. Поняття "розчинна CEA" відноситься до людського карциноембріонального антигену, який не пов'язаний або відщеплений від клітинної мембрани або клітинної поверхні (наприклад, поверхні пухлинної клітини), та / або який, як правило, не оберігає конформаційний епітоп, з яким зв'язується антитіло PR1A3. Розчинна CEA, наприклад, може бути присутньою в кровотоці або лімфатичних судинах індивідуума який страждає на рак. У контексті даного опису поняття "не має істотну перехресну реактивність до розчинного CEA" означає, що молекула (наприклад, антигензв'язуюча молекула) не може розпізнавати або не зв'язується специфічно з розчинною CEA, насамперед порівняно зі зв'язаним з мембраною CEA. Наприклад, антигензв'язуюча молекула може зв'язувати від менше ніж приблизно 10 % до менше ніж приблизно 5 % розчинного CEA, або може зв'язувати розчинний CEA в кількості, вибраній з групи, що включає кількості розчинного CEA, що становлять менш ніж приблизно 10 %, 9 %, 8 % 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 % і 0,1 %, переважно менше ніж приблизно 2 %, 1 % або 0,5 % розчинного CEA, і найбільш переважно менше ніж приблизно 0,2 % або 0,1 % розчинного CEA. У контексті даного опису поняття "злитий" і "химерний" щодо поліпептидів, таких як АЗМ, належить до поліпептидів, які містять амінокислотні послідовності, виведені з двох або більшої кількості гетерологічних поліпептидів, таких як фрагменти антитіл з різних видів. Для химерних АЗМ, наприклад, незвязуючі антиген компоненти можна отримувати з широкого розмаїття видів, включаючи приматів, таких як шимпанзе, і люди. Константна ділянка химерної АЗМ, як правило, є практично ідентичною константній ділянці який зустрічає в природних умовах людського антитіла; варіабельна ділянка химерного антитіла, як правило, містить послідовність, яка виведена з рекомбінантного антитіла до CEA, що має амінокислотну послідовність варіабельної ділянки мишачого антитіла PR1A3. Найбільш кращою формою злитого або химерного антитіла є гуманізовані антитіла. У контексті даного опису поняття "гуманізована" відноситься до антигензв'язуючої молекули, отриманої з антигензв'язуючої молекули з організму крім людини, наприклад, мишачого антитіла, яка зберігає або практично зберігає антигензв'язуючі властивості батьківської молекули, але яка є менш імуногенною для людей. Це можна досягати за допомогою різних методів (позначені в контексті даного опису як методи "гуманізації"), які включають (але, не обмежуючись тільки ними) (а) трансплантацію повних нелюдських варіабельних ділянок в людські константні ділянки з отриманням химерних антитіл, (б) трансплантацію тільки нелюдських (наприклад, з антигензв'язуючої молекули-донора) CDR в людський (наприклад, в антигензв'язуючу молекулу-реципієнта) каркасну ділянку і константні ділянки із збереженням таких, що мають вирішальне значення залишків каркасної ділянки (наприклад, залишків, важливих для збереження гарної афінності до зв'язування антигену або функцій антитіла) або без їх збереження, або (в) трансплантацію повних нелюдських варіабельних ділянок, але з їх "маскуванням" ділянкою, що нагадує людську, шляхом заміни тих, що знаходяться на поверхні 9 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 залишків. Такі методи описані у Jones та ін., Morrison та ін., Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 1984, сс. 6851-6855; Morrison і Oi, Adv. Immunol., 44, 1988, сс. 65-92; Verhoeyen та ін., Science, 239, 1988, сс. 1534-1536; Padlan, Molec. Immun., 28, 1991, сс. 489-498; Padlan, Molec. Immun., 31(3), 1994, сс. 169-217, всі зазначені публікації повністю включені в даний опис як посилання. У кожній з варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюга антитіла, як правило, присутні 3 гіперваріабельних ділянки або CDR (CDR1, CDR2 і CDR3), які фланковані чотирма каркасними підобластями (ділянками) (тобто, FR1, FR2, FR3 і FR4) в кожній з варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюга антитіла: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Обговорення гуманізованих антитіл представлено серед іншого в US 6632927, і в опублікованій заявці на патент США №. 2003/0175269, обидва документи повністю включені в даний опис в якості посилання. Для досягнення гуманізації можна трансплантувати також укорочені CDR, які містять тільки визначають специфічність амінокислотні залишки даного CDR, у вибрану каркасну ділянку. Під "залишками, які визначають специфічність" мають на увазі залишки, які безпосередньо беруть участь в специфічній взаємодії з антигеном і / або які необхідні для специфічного зв'язування антигену. В цілому, у зв'язуванні з антигеном беруть участь тільки приблизно від однієї п'ятої до однієї третини залишків у конкретному CDR. Залишки, які визначають специфічність, в конкретному CDR можна ідентифікувати, наприклад, шляхом розрахунку внутрішньоатомних контактів на основі тривимірних моделей і визначення варіабельності послідовностей в даному положенні залишку згідно методів, описаних у Padlan та ін., FASEB J. 9 (1), 1995, сс. 133-139, зміст публікації повністю включено в даний опис в якості посилання. У деяких випадках залишки каркасної ділянки (FR) людського імуноглобуліну заміняють на відповідні залишки нелюдського імуноглобуліну. Крім того, гуманізовані антигензв'язуючі молекули можуть містити залишки, відсутні в антитілі-реципієнті або антитілі-донорі. Ці модифікації здійснюють з метою додаткового поліпшення характеристик антигензв'язуючих молекул. Як правило, гуманізована антигензв'язуюча молекула може містити практично всю щонайменше одну і, як правило, дві варіабельних ділянки, в яких щонайменше один або практично все, або все гіперваріабельні ділянки відповідають ділянкам нелюдського імуноглобуліну, і все або практично все FR являють собою ділянки, що мають послідовність людського імуноглобуліну. Гуманізована антигензв'язуюча молекула необов'язково може містити також щонайменше частину константної ділянки (Fc) імуноглобуліну, як правило, людського імуноглобуліну (див., наприклад, Jones та ін., Nature 321, 1986, сс. 522-525; Reichmann та ін., Nature 332, 1988, сс. 323-329; і Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 1992, сс. 593596). Аналогічно цьому, в контексті даного опису поняття "приматизована" відноситься до антигензв'язуючої молекули, отриманої з антигензв'язуючої молекули організму крім примату, наприклад, мишачого антитіла, яка зберігає або практично зберігає антигензв'язуючі властивості батьківської молекули, але яка є менш імуногенною для приматів. У контексті даного опису поняття "варіант" (або "аналог") полінуклеотиду або поліпептиду належить до полінуклеотиду або поліпептиду, який відрізняється від конкретного зазначеного полинуклеотиду або поліпептиду, запропонованого у винаході, наявністю інсерцій, делецій і замін, створених наприклад, за допомогою методу рекомбінантної ДНК. Зокрема, рекомбінантні варіанти, що кодують такі ж або подібні поліпептиди, можна синтезувати або відбирати на основі "надмірності" генетичного коду. Різні заміни кодонів, такі як "мовчазні" заміни, які призводять до отримання різних сайтів рестрикції, можна інтродуціювати з метою оптимізації клонування в плазмідному або вірусному векторі або експресії в конкретній прокаріотичній або еукаріотичній системі. Мутації в полінуклеотидній послідовності можуть проявлятися в поліпептиді або доменах інших пептидів, доданих до поліпептиду для модифікації властивостей будь-якого фрагмента поліпептиду з метою зміни характеристик, таких як афінність зв'язування ліганда, міжланцюгова афінність або швидкість розщеплення / оновлення. У контексті даного опису поняття "варіант антигензв'язуючої молекули, мішенню якої є CEA" відноситься до молекули, яка відрізняється за амінокислотною послідовністю від "батьківської" антигензв'язуючої молекули, мішенню якої є CEA, завдяки додаванню, делеції та / або заміні одного або декількох амінокислотного (их) залишку (ів) в послідовності батьківського антитіла. У конкретному варіанті здійснення винаходу варіант містить одну або кілька амінокислотну (их) заміну (н) в одному або декількох гіперваріабельному (их) ділянці (ах) або CDR важкого і / або легкого ланцюга батьківської антигензв'язуючої молекули. Наприклад, варіант може містити щонайменше одну, наприклад, від приблизно однієї до приблизно десяти (тобто приблизно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10) і переважно від приблизно двох до приблизно п'яти замін в одному або декількох гіперваріабельних ділянках або CDR (тобто в 1, 2, 3, 4, 5 або 6 гіперваріабельних ділянках або CDR) батьківської антигензв'язуючої молекули. Варіант антигензв'язуючої 10 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекули, мішенню якої є CEA, може нести одне (одну) або кілька додавань, делецій та / або замін в одному або декількох каркасних ділянках або важкого, або легкого ланцюга. Як правило, варіант повинен мати амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентична амінокислотним послідовностям варіабельних ділянок важкого або легкого ланцюга батьківської антигензв'язуючої молекули, як правило, ідентична щонайменше приблизно на 80 %, 90 %, 95 % або 99 %. Ідентичність послідовностей згідно з цим описом визначають як відсоток амінокислотних залишків у послідовності-кандидаті, які ідентичні залишкам батьківського антитіла після вирівнювання послідовності та інтродукції при необхідності проломів для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей. Ні N-кінцеві, ні C-кінцеві, ні внутрішні подовження, делеції або інсерції в послідовності антитіла не слід розглядати як такі, які роблять вплив на ідентичність або гомологію послідовностей. Варіант антигензв'язуючої молекули зберігає здатність зв'язуватися зі зв'язаним з мембраною людським CEA. В одному з варіантів здійснення винаходу анти-CEA АЗМ пов'язується з тим же епітопом, що і батьківська антигензв'язуюча молекула. В одному з варіантів здійснення винаходу анти-CEA АЗМ конкурує за зв'язування зі зв'язаним з мембраною людським CEA з батьківською антигензв'язуючою молекулою. В одному з варіантів здійснення винаходу анти-CEA АЗМ зв'язується зі зв'язаним з мембраною CEA і не зв'язується з розчинним людським CEA. Анти-CEA АЗМ має властивості, поліпшені порівняно з властивостями батьківської антигензв'язуючої молекули. Наприклад, варіант може характеризуватися більш сильною афінністю зв'язування, підвищеною стабільністю та / або підвищеною здатністю індукувати антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність in vitro і in vivo. В одному з варіантів здійснення винаходу анти-CEA АЗМ має підвищеною стабільністю і зберігає афінність зв'язування або має поліпшену афінністю зв'язування зі зв'язаним з мембраною CEA і зберігає здатність або має підвищену здатність індукувати антитілообумовлену клітинозалежну цитотоксичніть in vitro і in vivo. Для аналізу зазначених властивостей, як правило, потрібно проводити порівняння варіанту антигензв'язуючої молекули і батьківської антигензв'язуючої молекули в одному і тому ж форматі; наприклад, Fab-форму варіанту антигензв'язуючої молекули з Fab-формою батьківської антигензв'язуючої молекули або повнорозмірну форму варіанту антигензв'язуючої молекули з повнорозмірною формою батьківської антигензв'язуючої молекули. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули має підвищену щонайменше приблизно в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 разів біологічну активність в порівнянні з біологічною активністю батьківської антигензв'язуючої молекули. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули являє собою варіант зі сконструйованою стабільністю, що має підвищену стабільність в порівнянні з батьківською антигензв'язуючою молекулою. Стабільність можна оцінювати за допомогою будьякого методу, відомого в даній галузі, і за допомогою методів, представлених в даному описі, зокрема, в прикладах 3-6. У конкретних варіантах здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули має підвищену щонайменше приблизно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 40, 50, 100 раз стабільністю в порівнянні з батьківською антигензв'язуючою молекулою. У деяких варіантах здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули має підвищену стабільність, яку визначають по зміні параметра стабільності в порівнянні з батьківською антигензв'язуючою молекулою. У деяких варіантах здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули має змінений щонайменше приблизно 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 40, 50, 100 раз параметром стабільності в порівнянні з батьківською антигензв'язуючою молекулою. Параметр стабільності являє собою, наприклад, температуру, при якій варіант антигензв'язуючою молекули розгортається (втрачає укладку) або відбувається його денатурація, тиск, при якому варіант антигензв'язуючої молекули втрачає укладку або відбувається його денатурація, або час, необхідний для денатурації або втрати укладання варіанту антигензв'язуючої молекули, в умовах, створених для додання варіанту антигензв'язуючої молекули нестабільності. В одному з варіантів здійснення винаходу підвищення стабільності визначають за допомогою термічного аналізу денатурації, наприклад, диференціальної скануючої калориметрії (ДСК). В одному з варіантів здійснення винаходу підвищення стабільності визначають за допомогою аналізу хімічної денатурації. В одному з варіантів здійснення винаходу підвищення стабільності визначають, використовуючи аналіз при підвищеному тиску. В іншому варіанті здійснення винаходу стабільність варіанту антигензв'язуючої молекули визначають з використанням поляризаційного флуоресцентного аналізу. В одному з варіантів здійснення винаходу стабільність варіанту антигензв'язуючої молекули визначають з використанням аналізу динамічного розсіювання світла (ДРС) (див. 11 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розділ "Приклади" і, наприклад, у Nobbmann U. та ін., Biotech. Genetic Eng. Rev. 24, 2007, сс. 117-128). ДРС дозволяє здійснювати моніторинг цілісності молекули, такої як антитіло, для якої, в цілому, підвищення показника розсіювання світла свідчить про втрату укладання або денатурації білку. За допомогою ДРС можна здійснювати оцінку молекул залежно від температури або хімічних денатуруючих агентів для порівняння відносної стабільності. Ті молекули, які зберігають їх нативну конформацію (невелике підвищення або відсутність підвищення показників ДРС), розглядаються як стабільні в умовах проведення випробувань. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули був стабільним при температурі, яка щонайменше на 0,25, 0,5, 1,0, 1.5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4, 0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 або 10,0 °С була вище, ніж для батьківської АЗМ чи іншої придатної референс-молекули, при аналізі з використанням динамічного розсіювання світла. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули був стабільним при температурі 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 °С або вище. Термічну стабільність можна оцінювати, наприклад, за допомогою ДРС, ДСК або поляризаційної флуоресценції. В одному з варіантів здійснення винаходу термічну стабільність варіанту антигензв'язуючої молекули оцінюють за допомогою ДРС. В одному з варіантів здійснення винаходу ДРС-аналіз здійснюють, використовуючи 1 мг / мл АЗМ або варіанта АЗМ в буфері, що містить 20мм гістидин і 140мм NaCl, при pH 6,0. ДРС-аналіз здійснюють, починаючи з 25 °С, збільшуючи температуру зі швидкістю 0,05°С / хв. Поняття "батьківська" антигензв'язуюча молекула належить до АЗМ, яку застосовують в якості вихідної або основи для отримання варіанту. У конкретному варіанті здійснення винаходу батьківська антигензв'язуюча молекула має людську каркасну ділянку і, якщо присутня (і), людську (і) константну (і) ділянка (и) антитіла. Наприклад, батьківське антитіло може представляти собою гуманізоване або людське антитіло. Амінокислотні "заміни" можуть бути результатом заміни однієї амінокислоти іншою амінокислотою, яка має подібні структурні та / або хімічні властивості, тобто можуть являти собою консервативні амінокислотні заміни. "Консервативні" амінокислотні заміни можна створювати на основі подібності в полярності, заряді, розчинності, гідрофобності, гідрофільності і / або амфіпатичної природи використовуваних для цієї мети залишків. Наприклад, до неполярних (гідрофобних) амінокислот відносяться аланін, лейцин, ізолейцин, валін, пролін, фенілаланін, триптофан і метіонін; до полярних нейтральних амінокислот відносяться гліцин, серин, треонін, цистеїн, тирозин, аспарагін і глутамін; до позитивно заряджених (оснóвних) амінокислот відносяться аргінін, лізин та гістидин; і до негативно заряджених (кислотних) амінокислот відносяться аспарагінова кислота і глутамінова кислота. "Інсерції »або« делеції »бажано зачіпають приблизно 1-20 амінокислот, більш краще 1-10 амінокислот і ще більш краще від приблизно 2 до приблизно 5 амінокислот. Неконсервативні заміни передбачають заміну представника одного з цих класів на представника іншого класу. Наприклад, амінокислотні заміни можуть бути також результатом заміни однієї амінокислоти на іншу амінокислоту, яка має інші структурні / або хімічні властивості, наприклад заміни амінокислоти з однієї групи (наприклад, полярної) на іншу амінокислоту з відмінної від першої групи (наприклад, оснóвної). Прийнятну варіацію можна визначати експериментально, систематично створюючи інсерції, делеції або заміни амінокислот у поліпептидній молекули за допомогою методів рекомбінантної ДНК і аналізуючи активність одержаних рекомбінантних варіантів. У контексті даного опису поняття "одноланцюговий Fv" або "scFv" відноситься до фрагмента антитіла, який містить VH-домен і VL-домен у вигляді одного поліпептидного ланцюга. Як правило, VH-і VL-домени з'єднані лінкерною послідовністю (див., наприклад, Pluckthun, в: Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, під ред. Rosenburg і Moore, вид-во SpringerVerlag, New York, 1994, сс. 269-315). У контексті даного опису поняття "мінітіло" відноситься до двовалентного гомодимерного похідному scFv, яке містить константну ділянка, як правило, CH3-домен імуноглобуліну, переважно IgG-типу, більш краще IgG1, в якості області димеризації. Як правило, константна ділянка пов'язана з scFv через шарнірну ділянку і / або лінкерну ділянку. Приклади білків мінітіл представлені у Hu та ін., Cancer Res. 56, 1996, сс. 3055-3061. У контексті даного опису поняття "димерне антитіло, (діабоді)» відноситься до невеликих фрагментів антитіл, які містять два антигензв'язуючих центри, вказані фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), зчеплений з варіабельний доменом легкого ланцюга (VL), у одному й тому ж поліпептидному ланцюзі (VH-VL). Завдяки застосуванню лінкера, який є занадто коротким, щоб могло відбуватися спарювання двох доменів на одного ланцюга, домени повинні злучатися з комплементарними доменами іншого ланцюга і в результаті відбувається утворення двох антигензв'язуючих центрів. Димерні антитіла описані більш детально, 12 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 наприклад, в EP 404097; WO 93/11161 і у Hollinger та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 6444-6448. Тримерне антитіло (тріабоді) утворюється в результаті формування тривалентного тримера, що складається з трьох scFv, що призводить до отримання трьох сайтів зв'язування, а тетрамерне антитіло (тетрабоді) являє собою чотирьохвалентний тетрамер, що складається з чотирьох scFv, що призводить до отримання чотирьох сайтів зв'язування. У тому випадку, коли в даній галузі застосовують і / або вживають два або більшу кількість визначень конкретного поняття, то в контексті даного опису мається на увазі, що застосовується визначення зазначеного поняття включає всі такі значення, якщо спеціально не вказано інше. Конкретним прикладом є застосування поняття "ділянка, що визначає компліментарність" ("CDR") для опису антигензв'язуючих центрів, які не доторкаються (які позначають також як антигензв'язуючі ділянки), присутніх у поліпептидах варіабельної ділянки як важкого, так і легкого ланцюга. CDR Позначають також як "гіперваріабельні ділянки", і зазначене поняття в контексті даного опису застосовують взаємозаміно з поняттям "CDR" щодо ділянок варіабельної галузі, які утворюють антигензв'язуючі центри. Ця конкретна ділянка, описана у Kabat та ін., "Sequences Proteins of Immunological Interest", вид-во U.S. Dept. of Health and Human Services, (1983); і у Chothia та ін., J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917, зазначені публікації включені в даний опис в якості посилання, причому ці визначення відносяться до амінокислотних залишків перекриваються або піднаборам амінокислотних залишків при їх порівнянні один з одним. Проте в контексті даного опису мається на увазі можливість застосування будь-якого визначення CDR антитіла або його варіантів. Відповідні амінокислотні залишки, з яких складаються CDR, як вони визначені у кожному з процитованих вище посилань, представлені в порівнянні нижче в таблиці 1. Точні номера залишків, які утворюють конкретний CDR, повинні варіюватися залежно від послідовності та розміру CDR. Фахівці в даній галузі легко можуть визначити, які залишки входять в конкретний CDR, на основі даних про амінокислотну послідовність варіабельної галузі антитіла. Таблиця 1 Визначення CDR VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 Кебот 31-35 50-65 95-102 24-34 50-56 89-97 1 Хотіа 26-32 52-58 95-102 26-32 50-52 91-96 2 АbМ 26-35 50-58 95-102 24-32 50-56 89-97 1 Нумерація всіх вхідних в CDR залишків у таблиці 1 дана відповідно до нумерації, запропонованої Кеботом та ін (див. нижче). 2 Позначення "АЗМ" з великої буквою "b", використане в таблиці 1, належить до CDR, як вони визначені програмою для моделювання антитіл Oxford Molecular's "АЗМ". 30 35 40 Кебот із співавторами запропонували також систему нумерації (номенклатуру) послідовностей варіабельних ділянок, яку можна застосовувати для будь-якого антитіла. Звичайний фахівець у даній галузі може однозначно застосовувати цю систему "нумерації за Кеботом" до будь-якої послідовності варіабельної галузі, не маючи ніяких експериментальних даних, крім відомостей про саму послідовність. У контексті даного опису поняття "нумерація за Кеботом" відноситься до системи нумерації, описаної у Kabat та ін., "Sequence of Proteins of Immunological Interest", вид-во US Dept. of Health and Human Services, 1983. Якщо не вказано інше, то посилання на нумерацію положень конкретних амінокислотних залишків у антигензв'язуючлому фрагменті подані у відповідності з системою нумерації за Кеботом. Нумерація в поліпептидних послідовностях, представлених у переліку послідовностей (тобто SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 216), не відповідає системі нумерації за Кеботом. Однак звичайний фахівець у даній галузі легко може перетворити нумерацію послідовностей, представлених у переліку послідовностей, в систему нумерації за Кеботом. Під нуклеїновою кислотою або полінуклеотидом, які мають нуклеотидну послідовність, щонайменше, наприклад, на 95 % "ідентичну" нуклеотидній послідовності, пропонованій в даному винаході, з якою проводять порівняння (референс-послідовність), мається на увазі, що нуклеотидна послідовність полінуклеотиду ідентична референс-послідовності за винятком того, 13 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що полінуклеотидна послідовність може включати до п'яти точкових мутацій на кожні 100 нуклеотидів нуклеотидної референс-послідовності. Іншими словами, для отримання полінуклеотиду, що має нуклеотидну послідовність, ідентичну щонайменше на 95 % нуклеотидній референс-послідовності, можна вилучати шляхом делеції або замінювати іншими нуклеотидами аж до 5 % нуклеотидів референс-послідовності або аж до 5 % від загальної кількості нуклеотидів в референс-послідовності можна вбудовувати в референс-послідовність. З практичної точки зору визначати чи є будь-яка конкретна молекула нуклеїнової кислоти або поліпептид щонайменше на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичною / ідентичним нуклеотидній послідовності або поліпептидній послідовності, пропонованій в даному винаході, можна за допомогою відомих широко використовуваних комп'ютерних програм. В якості одного з методів визначення найкращого загального збігу "запитуваної" (референс) послідовності (послідовність, пропонована в даному винаході) і аналізованої послідовності, який називають також методом глобального порівняльного аналізу послідовностей, можна використовувати комп'ютерну програму FASTDB, засновану на алгоритмі Brutlag та ін., Comp. App. Biosci. 6, 1990, сс. 237-245. При порівняльному аналізі послідовностей як референспослідовність, так і аналізована послідовності обидві представляють собою послідовності ДНК. Послідовності РНК можна порівнювати шляхом заміни залишків U на T. Результатом зазначеного глобального порівняльного аналізу послідовностей є відсоток ідентичності. Кращими параметрами для розрахунку відсотка ідентичності, використовуваними в програмі FASTDB порівняльного аналізу послідовностей ДНК, є: матриця = унітарна, k запис у базі даних = 4, штраф за розбіжність = 1, штраф за приєднання = 30, довжина рандомізованої групи = 0, бал за зрізання = 1, штраф за пролом = 5, штраф за розмір проломи = 0,05, розмір вікна = 500 або він дорівнює довжині аналізованої послідовності в залежності від того, що коротше. Якщо аналізована послідовність коротше референс-послідовності внаслідок наявності делецій на 5'-або 3'-кінці, але не внаслідок внутрішніх делецій, то результати можна скорегувати вручну. Це обумовлено тим, що програма FASTDB не враховує укорочення на 5'-і 3'-кінці аналізованої послідовності при розрахунку відсотка ідентичності. Для аналізованих послідовностей, укорочених на 5'-або 3'-кінцях по відношенню до референс-послідовності, відсоток ідентичності коригують шляхом обчислення кількості основ референс-послідовності, розташованих за 5'-і 3'-кінцями аналізованої послідовності, які не співпали/не вирівняні, у вигляді відсотка від загальної кількості основ в референс-послідовності. Чи збігаються / чи вирівняні нуклеотиди, визначається результатами порівняльного аналізу послідовностей за допомогою програми FASTDB. Потім цей відсоток віднімають з відсотка ідентичності, розрахованого за допомогою зазначеної вище програми FASTDB, з використанням зазначених заданих параметрів, в результаті чого отримують остаточну оцінку відсотка ідентичності. Цю скориговану оцінку використовують для цілей цього винаходу. Для цілей ручної корекції оцінки відсотка ідентичності при розрахунку враховують тільки основи, розташовані за 5'-і 3'-кінцями аналізованої послідовності, виявлені з допомогою порівняльного аналізу з використанням програми FASTDB, які не збігалися / не вирівняні щодо референс-послідовності. Наприклад, для визначення відсотка ідентичності аналізовану послідовність довжиною 90 основ порівнюють з референс-послідовністю довжиною 100 основ. На 5'-кінці аналізованої послідовності є делеції, і тому порівняльний аналіз за допомогою FASTDB не дозволяє встановлювати збіги / вирівнювати 10 перших основ на 5'-кінці. 10 неспарених основ являють собою 10 % послідовності (кількість неспівпавших основ на 5'-і 3'-кінцях / загальна кількість основ в референс-послідовності), таким чином, 10 % віднімають з оцінки відсотка ідентичності, розрахованого за допомогою програми FASTDB. Якщо решта 90 основ ідеально збігаються, то остаточний відсоток ідентичності становить 90 %. В іншому прикладі аналізовану послідовність довжиною 90 основ порівнюють з референс-послідовністю довжиною 100 основ. У даному випадку делеції являють собою внутрішні делеції, так що на 5'-або 3'-кінці аналізованої послідовності немає основ, які не збігалися / не вирівняні із референс-послідовністю. У цьому випадку відсоток ідентичності, розрахований за допомогою програми FASTDB, не коригують вручну. Ще раз варто підкреслити, що вручну здійснюють корекцію тільки для основ, які не співпали / не вирівняні на 5'-і 3'-кінцях аналізованої послідовності. Для цілей цього винаходу не проводять ніяких інших корекцій вручну. Під поліпептидом, амінокислотна послідовність якого, наприклад, по менше мірі на 95 % "ідентична" "запитуваній" амінокислотній послідовності (референс-послідовності), запропонованій в даному винаході, мається на увазі, що амінокислотна послідовність аналізованого поліпептиду ідентична референс-послідовності за винятком того, аналізована поліпептидна послідовність може включати аж до п'яти амінокислотних замін на кожні 100 амінокислот у амінокислотній референс-послідовності. Іншими словами, для отримання 14 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептиду, що має амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 95 % амінокислотній референс-послідовності, можна вбудовувати, вилучати шляхом делеції або замінювати іншими амінокислотами аж до 5 % амінокислотних залишків аналізованої послідовності. Ці зміни референс-послідовності можуть мати місце в аміно-або карбоксикінцевих положеннях амінокислотної референс-послідовності або в інших сайтах між цими кінцевими положеннями, вони або розподілені індивідуально між залишками в референспослідовності, або присутні у вигляді однієї або декількох груп суміжних змін до референс послідовності. З практичної точки зору визначати чи є будь-який конкретний поліпептид щонайменше на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичним референс-поліпептиду, можна за допомогою відомих широко використовуваних комп'ютерних програм. В якості одного з методів визначення найкращого загального збігу референс-послідовності (послідовність, запропонована в даному винаході) і аналізованої послідовності, який називають також методом глобального порівняльного аналізу послідовностей, можна використовувати комп'ютерну програму FASTDB, засновану на алгоритмі, описаному у Brutlag та ін., Comp. App. Biosci. 6, 1990, сс. 237245. При порівняльному аналізі послідовностей як референс-послідовність, так і аналізована послідовність обидві являють собою або нуклеотидні послідовності, або амінокислотні послідовності. Результатом зазначеного глобального порівняльного аналізу послідовностей є відсоток ідентичності. Кращими параметрами для розрахунку відсотка ідентичності, використовуваними в програмі FASTDB для порівняльного аналізу амінокислотних послідовностей, є: матриця = PAM 0, k-запис у базі даних = 2, штраф за розбіжність = 1, штраф за приєднання = 20, довжина рандомізованої групи = 0, бал за "зрізання" = 1, розмір вікна = довжина послідовності, штраф за пролом = 5, штраф за розмір проломи = 0,05, розмір вікна = 500 або він дорівнює довжині аналізованої амінокислотної послідовності в залежності від того, що коротше. Якщо аналізована послідовність коротше референс-послідовності внаслідок наявності делецій на N-або C-кінці, але не внаслідок внутрішніх делецій, то результати слід скорегувати вручну. Це обумовлено тим, що програма FASTDB не враховує укорочення на N-і C-кінці аналізованої послідовності при розрахунку глобального відсотка ідентичності. Для аналізованих послідовностей, укорочених на N-і C-кінцях по відношенню до референс-послідовності, відсоток ідентичності коригують шляхом обчислення кількості залишків референс-послідовності, розташованих за N-і C-кінцями аналізованої послідовності, які не співпали / не вирівняні щодо відповідного залишку аналізованої послідовності, у вигляді відсотка від загальної кількості основ референс-послідовності. Чи співпадає / чи вирівняний залишок, визначається результатами порівняльного аналізу послідовностей за допомогою програми FASTDB. Потім цей відсоток віднімають з відсотка ідентичності, розрахованого за допомогою зазначеної вище програми FASTDB, з використанням зазначених заданих параметрів, в результаті чого отримують остаточну оцінку відсотка ідентичності. Цю кінцеву оцінку відсотка ідентичності використовують для цілей цього винаходу. Для цілей ручної корекції оцінки відсотка ідентичності при розрахунку враховують тільки залишки, розташовані за N-і C-кінцями аналізованої послідовності, виявлені за допомогою порівняльного аналізу з використанням програми FASTDB, які не співпадали / не вирівняні щодо референс-послідовності. Таким чином, враховують тільки залишки референспослідовності, що знаходяться в положеннях, які розташовані поза найбільш віддалених N-і Cкінцевих залишків аналізованої послідовності. Наприклад, для визначення відсотка ідентичності аналізовану амінокислотну послідовність, яка містить 90 залишків, порівнюють з референс-послідовністю, що містить 100 залишків. На Nкінці аналізованої послідовності є делеції, і тому порівняльний аналіз за допомогою FASTDB не дозволяє встановлювати збіги при порівняльному аналізі для 10 перших залишків на N-кінці. 10 неспівпадаючих залишків являють собою 10 % послідовності (кількість неспівпадаючих залишків на N-і C-кінцях / загальна кількість залишків у референс-послідовності), таким чином, 10 % віднімають з оцінки відсотка ідентичності, розрахованого за допомогою програми FASTDB. Якщо решта 90 залишків ідеально збігаються, то остаточний відсоток ідентичності становить 90 %. В іншому прикладі аналізовану послідовність, що містить 90 залишків, порівнюють з референс-послідовністю, що містить 100 залишків. У даному випадку делеції являють собою внутрішні делеції, в результаті на N-або C-кінці аналізованої послідовності немає залишків, які не збігаються при порівняльному аналізі із референс-послідовністю. У цьому випадку відсоток ідентичності, розрахований за допомогою програми FASTDB, не коригують вручну. Ще раз варто підкреслити, що при порівняльному аналізі, здійснюваному за допомогою програми FASTDB, вручну здійснюють корекцію тільки для неспівпадаючих / не вирівняних залишків, які розташовані поза N-і C-кінців аналізованої послідовності. Для цілей цього винаходу не 15 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проводять ніяких інших корекцій вручну. Відсоток ідентичності полінуклеотидів і / або поліпептидів можна визначати також, використовуючи програми BLAST, які можна отримувати з національногоцентру біотехнологічної інформації (National Center for Biotechnology Information, NCBI), використовуючи задані за замовчанням параметри, зазначені в програмах. У контексті даного опису поняття "нуклеїнова кислота, яка« гібридизується в строгих умовах »із нуклеотидною послідовністю, запропонованою у винаході, належить до полінуклеотиду, який гібридизується в певних умовах, наприклад, при інкубації протягом ночі при 42  C в розчині, що містить 50 % формамід, 5×SSC (750мМ NaCl, 75мМ цитрат натрію), 50мМ фосфат натрію (pH 7,6), 5× розчин Денхардта, 10 % сульфату декстрану і 20 мкг / мл денатурованої, гідродинамічно фрагментованої ДНК із сперми лосося, з подальшим відмиванням фільтрів в 0,1 × SSC приблизно при 65C. У контексті даного опису поняття "поліпептид, у якого є GnTIII-активність" відноситься до поліпептидів, які мають здатність каталізувати додавання залишку N-ацетилглюкозаміну (GlcNAc) в β-1-4- зв'язку до β-пов'язаному маннозіду тріманнозільного ядра N-пов'язаних олігосахаридів. Поняття відноситься до злитих поліпептидів, які мають ферментативну активність, подібну, але не обов'язково ідентичну, активності β(1,4)-Nацетилглюкозаминилтрансферази III, також відомої під назвоюβ-1,4-маннозил-глікопротеін-4бета-N-ацетилглюкозамінілтрансфераза (КФ 2.4.1.144) згідно з номенклатурою Комітету Міжнародного союзу з біохімії та молекулярної біології (Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)), при оцінці за допомогою конкретного біологічного аналізу як у випадку залежності від дози, так і без залежності від дози. У разі, коли існує залежність від дози, фермент не повинен бути обов'язково ідентичний GnTIII, а скоріше він повинен бути практично подібний їй відносно залежності даної активності від дози в порівнянні з GnTIII (тобто поліпептид-«кандидат" повинен мати більш високу активність або не більше ніж приблизно в 25 разів знижену активність, переважно не більше ніж приблизно в 10 разів знижену активність, і ще більш краще не більше ніж приблизно в 3 рази знижену активність в порівнянні з GnTIII.). У контексті даного опису поняття "домен локалізації в комплексі Гольджі" відноситься до амінокислотної послідовності розташованого в комплексі Гольджі поліпептиду, який відповідальний за "заякорівання" поліпептиду в ділянці, що знаходиться всередині комплексу Гольджі. Як правило, домени локалізації містять амінокінцеві "хвости" ферменту. У контексті даного опису поняття "ефекторна функція" відноситься до видів біологічної активності, властивим Fc-галузі (нативна послідовність Fc-галузі або амінокислотна послідовність варіанту Fc-ділянки) антитіла. Прикладами ефекторних функцій антитіла є (але, не обмежуючись ними) афінність зв'язування з Fc-рецептором, антитіло-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність (ADCC), антитіло-обумовлений клітинозалежний фагоцитоз (ADCP), секреція цитокінів, опосередковане імунним комплексом поглинання антигену антигенпрезентуючими клітинами, понижуюча регуляція рецепторів клітинної поверхні і т.д. У контексті даного опису поняття "інженерія" (створення), "створений за допомогою інженерії", "процес створення за допомогою інженерії", перш за все з приставкою "гліко", а також "інженерія глікозилювання (глікоінженерія)» (конструювання схеми глікозилювання), відносяться до будь-якої маніпуляції, якій піддають схему глікозилювання такого, який зустрічається в природних умовах або рекомбінантного поліпептиду або його фрагмента. Конструювання схеми глікозилювання включає метаболічне конструювання механізму глікозилювання клітини, в тому числі генетичні маніпуляції, що стосуються шляхів олігосахаридного синтезу, з метою отримання зміненого глікозилювання глікопротеїнів, які експресуються в клітинах. Крім того, конструювання схеми глікозилювання включає впливи мутацій і клітинного оточення на глікозилювання. В одному з варіантів здійснення винаходу інженерію глікозилювання здійснюють з метою зміни глікозілтрансферазної активності. У конкретному варіанті здійснення винаходу інженерія дозволяє змінювати активність глюкозамінілтрансферази та / або активність фукозілтрансферази. У контексті даного опису поняття "клітина-хазяїн" відноситься до будь-якої клітинної системи, яку можна сконструювати для виробництва поліпептидів і антигензв'язуючих молекул, запропонованих в даному винаході. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу клітину-хазяїна конструюють так, щоб з її допомогою одержувати антигензв'язуючу молекулу з модифікованими глікоформами. У кращому варіанті здійснення винаходу антигензв'язуюча молекула являє собою антитіло, фрагмент антитіла або злитий білок. У конкретних варіантах здійснення винаходу клітини-хазяїни піддавали додатковим маніпуляціям для підвищення рівнів експресії одного або декількох поліпептидів, які мають GnTIII-активність. Клітини-хазяїни 16 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 являють собою культивовані клітини, наприклад, культивовані клітини ссавців, такі як CHOклітини, BHK-клітини, NS0-клітини, SP2/0-клеткі, клітини мієломи лінії YO, клітини мишачої мієломи лінії P3X63, PER-клітини, PER. C6-клітини або клітини гібридоми, клітини дріжджів, клітини комах і рослинні клітини, а також клітини, що знаходяться в організмі трансгенної тварини, трансгенної рослини або культивованої рослинній або тваринної тканини. У контексті даного опису поняття "Fc-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність" відноситься до антитіло-обумовленої клітинозалежної цитотоксичності (ADCC) і клітинної цитотоксичності, опосередкованої розчинним злитим з Fc білком, який містить людську Fcділянку. Це являє собою механізм імунітету, приводить до лізису "мічених антитілом клітин" "людськими імунокомпетентними ефекторними клітинами". Поняття «« людські імунокомпетентні ефекторні клітини »означає популяцію лейкоцитів, які несуть на поверхні Fc-рецептори, за допомогою яких вони зв'язуються з Fc-ділянкою антигензв'язуючих молекул або злитими з Fc білками і здійснюють ефекторні функції. Така популяція може включати (але, не обмежуючись ними) мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) та / або природні клітини-кілери (NK). У контексті даного опису поняття "мічені антитілом клітини" відноситься до клітин, з якими специфічно зв'язуються антигензв'язуючі молекули, що містять Fc-ділянку (наприклад, антитіла або їх фрагменти, які містять Fc-ділянку), або злиті з Fc білки. Антигензв'язуючі молекули або злиті з Fc білки зв'язуються з клітинами-мішенями за допомогою N-кінцевого стосовно Fc-галузі білкового фрагмента. У контексті даного опису поняття "підвищена Fc-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність" відноситься до будь-якого збільшення кількості "мічених антитілом клітин", підданих лізису в даний момент часу при даній концентрації антигензв'язуючої молекули або злитого з Fc білку, в середовищі, яке оточує клітини-мішені, із допомогою вказаного вище механізму Fc-опосередкованої клітинозалежної цитотоксичності та / або зниження концентрації антитіла або злитого з Fc білка в середовищі, яке оточує клітини-мішені, необхідного для лізису даної кількості "мічених антитілом клітин" в даний момент часу за допомогою механізму Fcобумовленої клітинозалежної цитотоксичності. Підвищення рівня Fc-обумовленої клітинозалежної цитотоксичності оцінюють щодо клітинозалежної цитотоксичності, опосередкованої тією ж антигензв'язуючою молекулою або тим же злитим з Fc білком, яка / який продукується в такому ж типі клітин-хазяїнів, з використанням одних і тих же стандартних методів отримання, очищення, приготування композицій і зберігання (які добре відомі фахівцям у даній галузі), але яка / який не продукували / продукувався клітиною-хазяїном, сконструйованою так, щоб вона мала змінену схему глікозилювання (наприклад, так, щоб у ній відбувалася експресія глікозілтрансферази GnTIII, або інших глікозилтрансфераз), за допомогою методів, представлених в даному описі. Під "антигензв'язуючою молекулою, яка має підвищену антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (ADCC)» мається на увазі антигензв'язуюча молекула, як вона визначена вище, яка має ADCC при визначенні за допомогою будь-якого прийнятного методу, відомого звичайним фахівцям в даній галузі. Один із прийнятних методів аналізу in vitro ADCC полягає в тому, що: 1) для аналізу застосовують клітини-мішені, для яких відомо, що вони експресують антигенмішень, який розпізнається антигензв'язуючим центром антитіла; 2) для аналізу в якості ефекторних клітин використовують людські мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC), виділені з крові довільно вибраних здорових донорів; 3) аналіз здійснюють за допомогою наступного протоколу: I) PBMC виділяють за допомогою стандартних методів центрифугування в градієнті щільності і суспендується 5 × 106 клітин / мл в RPMI-середовищі для культури клітин; II) вирощують клітини-мішені за допомогою стандартних методів культивування тканин, збирають на експоненційній фазі росту, коли життєздатність складає більше 90 %, промивають 51 у RPMI-середовищі для культури клітин, міченої 100 мкКи Cr, двічі промивають за допомогою середовища для культури клітин і ресуспендують в середовищі для культури клітин з щільністю 510 клітин/мл; III) переносять по 100 мкл зазначеної вище кінцевої суспензії клітин-мішеней в кожну лунку 96-лункового титраційного мікропланшету; IV) готують серійні розведення з концентрацією антитіл від 4000 до 0,04 нг / мл в середовищі для культури клітин і додають 50 мкл утворених розчинів антитіл до клітин-мішеней в 96лунковому тітраційному мікропланшеті, оцінюючи в трьох повторностях різні концентрації антитіл, що охоплюють весь зазначений вище діапазон концентрацій; V) для створення контролів з максимальним вивільненням (MR) використовують 3 додаткові 17 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лунки в планшеті, які містять мічені клітини-мішені, з додаванням 50 мкл 2 об. % водного розчину неіоногенного детергента (Nonidet, фірма Sigma, Сент-Луїс), замість розчину антитіла (зазначеного в п. IV, вище); VI) для створення контролів зі спонтанним вивільненням (SR), використовують 3 додаткові лунки в планшеті, які містять мічені клітини-мішені, з додаванням 50 мкл RPMI-середовища для культури клітин замість розчину антитіла (зазначеного в п. IV, вище); VII) потім 96-лунковий титраційний мікропланшет центрифугують при 50 × g протягом 1 хв і інкубують протягом 1 год. при 4 °С; VIII) додають в кожну лунку по 50 мкл суспензії PBMC (зазначеної в п. I, вище), отримуючи співвідношення ефекторні клітини: клітини-мішені 25:1, і планшети поміщають в інкубатор в атмосферу, що містить 5 % CO2, і витримують при 37 °С протягом 4 год.; IX) збирають безклітковий супернатант з кожної лунки і кількісно оцінюють виділену в процесі експерименту радіоактивність (ER) за допомогою лічильника гамма-променів; X) розраховують відсоток специфічного лізису для кожної концентрації антитіла згідно з формулою (ER-MR) / (MR-SR) × 100, де ER означає середню радіоактивність, розраховану (див. п. IX, вище) для зазначеної концентрації антитіла, MR означає середню радіоактивність, розраховану (див. п. IX, вище) для MR-контролів (див. п. V, вище), а SR означає середню радіоактивність, розраховану (див. п. IX, вище) для SR-контролів (див. п. VI. вище); 4) "Підвищену ADCC" визначають або як збільшення максимального відсотка специфічного лізису, виявленого для зазначеного вище діапазону концентрацій антитіла, та / або як зниження концентрації антитіла, необхідної для досягнення половини від максимального відсотка специфічного лізису, виявленого для зазначеного вище діапазону концентрацій антитіла. Підвищення ADCC оцінюють щодо ADCC, опосередкованої таким же антитілом, продукувати в тому ж типі клітин-хазяїнів, з використанням одних і тих же стандартних методів отримання, очищення, приготування композицій і зберігання, які добре відомі фахівцям у даній галузі, але яке не продукувалося клітиною - хазяїном, сконструйованою для надекспресії GnTIII. Антигензв'язуючі молекули, поліпептиди і полінуклеотиди, мішенню яких є CEA CEA протягом багатьох років використовувався як маркер раку в діагностичних цілях. Для нього характерна аномальна експресія (наприклад, надекспресія та / або аномальне розподілення у різних структурах в клітині) в різних пухлинних тканинах у порівнянні з непухлинними тканинами, що складаються з клітин такого ж типу. Оскільки CEA, як правило, відщеплюється від поверхні пухлинної клітини, і найбільш відомі антитіла до CEA зв'язуються також і з розчинною CEA, то некон'юговані антитіла до CEA, як правило, не використовуються в терапевтичних цілях. Наприклад, антитіла до CEA, які в даний час вивчаються в пілотних дослідженнях, застосовують у вигляді радіокон'югатів (Wong та ін., 2004; Liersch та ін., 2007). Терапевтична ефективність антитіл до CEA визначається декількома механізмами, включаючи антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (ADCC) і комплементзалежну цитотоксинність (CDC). Підвищений рівень експресії CEA стимулює підвищену міжклітинну адгезію, що може призводити до метастазів ракових клітин (Marshall J., Semin Oncol., 30 (додаток 8), 2002, сс. 30-36). Таким чином, антигензв'язуючі молекули, мішенню яких є CEA, можуть грати також роль в інгібуванні опосередковуваної CEA клітинної адгезії і метастазах ракових клітин. Одним з об'єктів винаходу є варіант антигензв'язуючої молекули (наприклад, антитіло або його фрагмент), який містить один або кілька (наприклад, один, два, три, чотири, п'ять або шість) CDR мишачого антитіла PR1A3, в якому щонайменше в одному з CDR замінений щонайменше один амінокислотний залишок в порівнянні з відповідним CDR PR1A3, і де варіант антигензв'язуючої молекули має підвищену афінність до CEA, бажано пов'язаному з мембраною CEA, в порівнянні з батьківською антигензв'язуючою молекулою PR1A3. У міжнародній заявці на патент WO 2011/023787 описані антигензв'язуючі молекули, мішенню яких є CEA, з підвищеною афінністю до CEA порівняно з батьківською антигензв'язуючою молекулою PR1A3. Іншим об'єктом винаходу є варіант антигензв'язуючої молекули, який містить один або кілька (наприклад, один, два, три, чотири, п'ять або шість) CDR мишачого антитіла PR1A3, в якому щонайменше в одному з CDR замінений щонайменше один амінокислотний залишок у порівнянні з відповідним CDR PR1A3, і де варіант антигензв'язуючої молекули має підвищену стабільність в порівнянні з батьківською антигензв'язуючою молекулою PR1A3. В одному з варіантів здійснення батьківська антигензв'язуюча молекула PR1A3 являє собою гуманізовану антигензв'язуючу молекулу PR1A3. В одному з варіантів здійснення батьківська антигензв'язуюча молекула PR1A3 містить варіабельну ділянку важкого ланцюга CH7A (SEQ ID NO: 101). В одному з варіантів здійснення батьківська антигензв'язуюча молекула PR1A3 містить варіабельні галузі важкого ланцюга CH7A (SEQ ID NO: 101) і варіабельну ділянку 18 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 легкого ланцюга 2F1 (SEQ ID NO: 209). Зазначений (і) один або кілька CDR можуть являти собою укорочені CDR і повинні містити, як мінімум, що визначають специфічність залишки (SDR), як вони визначені в даному описі, для даного CDR. В одному з варіантів здійснення винаходу антигензв'язуюча молекула містить щонайменше один (наприклад, один, два, три, чотири, п'ять або шість) CDR, вибраних з SEQ ID NO: 1-3, 5-10, 12-56 і 217-224 (фіг. 32 і фіг. 36), включаючи залишки CDR, які повинні зберігати здатність до специфічного зв'язування. В іншому варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули містить щонайменше один (наприклад, один, два, три, чотири, п'ять або шість) CDR, вибраних з SEQ ID NO: 1-3, 5-10, 1256 і 217-224, або варіант або його вкорочену форму, що містить щонайменше визначають специфічність залишки зазначеного CDR, і містити послідовність, виведену з гетерологічного поліпептиду. У конкретному варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули містить варіант CDR1 важкого ланцюга PR1A3, а, саме: у HCDR1 заміну глутамат валіну в положенні 31 за Кеботом. У конкретному варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули містить варіант CDR3 важкого ланцюга PR1A3, а, саме: у HCDR3 заміну аланіном тирозину 98 за Кеботом або заміну тирозином аспартату в положенні 99 по Кеботом. У конкретному варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули містить варіант CDR3 важкого ланцюга PR1A3, а, саме: у HCDR3 тирозин замінений на аланін в положенні 98 за Кеботом і аспартат замінений на тирозин в положенні 99 за Кеботом. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули містить один CDR3 важкого ланцюга, вибраний з SEQ ID NO: 217-224 (фіг. 36) і два CDR важкого ланцюга (наприклад, HCDR1 і HCDR2), які вибрані з SEQ ID NO: 1-3, 5-10 і 12-24, та / або три CDR легкого ланцюга (наприклад, LCDR1, LCDR2 і LCDR3), які вибрані з SEQ ID NO: 36-56, або їх варіанти або укорочені форми, що містять щонайменше залишки які визначають специфічність кожного з CDR. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули містить один CDR3 важкого ланцюга, вибраний з SEQ ID NO: 217-224, і два CDR (наприклад, HCDR1 і HCDR2), які вибрані з SEQ ID NO: 1-3, 5-10 і 12-24, і три CDR легкого ланцюга (наприклад, LCDR1, LCDR2 і LCDR3), які вибрані з SEQ ID NO: 36-56. В іншому варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули містить варіабельну (і) ділянку (і) легкого і / або важкого ланцюга антитіла, переважно варіабельну ділянку і важкого, і легкого ланцюга. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу варіабельну ділянку важкого ланцюга і / або легкого ланцюга вибирають з варіабельних ділянок важкого і / або легкого ланцюга, які вибрані з SEQ ID NO: 99-108, SEQ ID NO: 188-216 і SEQ ID NO: 225-248 (фіг. 33 і фіг. 37A-В) або їх комбінації, де варіабельна ділянка важкого і легкого ланцюга не представляє собою комбінацію SEQ ID NO: 99 і SEQ ID NO: 103 або SEQ ID NO: 100 і SEQ ID NO: 104. У деяких варіантах здійснення винаходу важкий ланцюг містить каркасні ділянки CH1A1A (SEQ ID NO: 261) або CH1A1B (SEQ ID NO: 262) (фіг. 37В). В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 або SEQ ID NO: 247. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули являє собою химерне антитіло, більш конкретно гуманізоване антитіло. В іншому варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули містить Fc-ділянку. В іншому варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули являє собою варіант з дозрілою афінністю. В іншому варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули має підвищену ADCC в порівнянні з антитілом PR1A3. В одному з варіантів здійснення винаходу підвищена ADCC варіанту антигензв'язуючої молекули є наслідком підвищення афінності варіанту антигензв'язуючої молекули до пов'язаного з мембраною CEA, наприклад, в результаті дозрівання афінності або застосування інших методів підвищення афінності (див. Tang та ін., J. Immunol., 179, 2007, сс. 2815-2823, повний зміст публікації включено в даний опис як посилання). В іншому варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули містить Fc-ділянку, піддану глікоінженерії. Іншим об'єктом винаходу є також способи створення зазначених варіантів антигензв'язуючих молекул та їх застосування для лікування захворювання, насамперед пов'язаних з проліферацією клітин порушень, при яких відбувається експресія CEA, насамперед аномальна експресія CEA (наприклад, надекспресія та / або аномальне розподілення у різних структурах в клітині) порівняно зі здоровою тканиною, що складається з клітин цього ж типу. Зазначені порушення включають (але, не обмежуючись лише ними) колоректальний рак, NSCLC (недрібноклітинний рак легені), рак шлунка, рак підшлункової залози та рак молочної залози. Рівні експресії CEA можна визначати методами, відомими в даній галузі і представленими в даному описі (наприклад, за допомогою імуногістохімічного аналізу, імунофлуоресцентного аналізу, імуноферментного аналізу, ELISA, проточної 19 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цитометрії, радіоімуноаналізу, Вестерн-блотингу, по зв'язуванню ліганду, за кіназною активністю і т.д.). Наступним об'єктом винаходу є також виділений полінуклеотид, що містить послідовність, яка кодує поліпептид, який містить один або кілька (наприклад, один, два, три, чотири, п'ять або шість) гіперваріабельних ділянок мишачого антитіла PR1A3, або його варіанти або укорочені форми, які містять щонайменше такі, які визначають специфічність залишки зазначених гіперваріабельних ділянок. Як правило, зазначені виділені полінуклеотиди кодують один або кілька злитих поліпептидів, які утворюють антигензв'язуючу молекулу. В одному з варіантів здійснення винаходу полінуклеотид містить послідовність, що кодує один або кілька (наприклад, один, два, три, чотири, п'ять або шість) CDR, вибраних з SEQ ID NO: 1-3, 5-10, 12-56 і 217-224, які містять залишки, що зберігають здатність до специфічного зв'язування. В одному з варіантів здійснення винаходу полінуклеотид містить послідовність, що кодує щонайменше три CDR важкого ланцюга (наприклад, HCDR1, HCDR2 і HCDR3) та / або три CDR легкого ланцюга (наприклад, LCDR1, LCDR2 і LCDR3), які вибрані з SEQ ID NO: 1-3, 5-10, 12-56 і 217-224, або їх варіанти або укорочені форми, містять щонайменше такі, які визначають специфічність залишки (SDR) кожного з зазначених трьох гіперваріабельних ділянок. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид кодує поліпептид, що містить один CDR3 важкий ланцюга, вибраний з SEQ ID NO: 217-224, і два CDR важкого ланцюга (наприклад, HCDR1 і HCDR2), які вибрані з SEQ ID NO: 1-3, 5-10 і 12-24, і три CDR легкого ланцюга (наприклад, LCDR1, LCDR2 і LCDR3), які вибрані з SEQ ID NO: 36-56. В іншому варіанті здійснення винаходу полінуклеотид кодує поліпептид, що містить варіабельну (і) ділянку (і) легкого і / або важкого ланцюга антитіла. Полінуклеотиди, що кодують поліпептиди варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюга, можна експресувати в одному або декількох експресійний векторах. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, який кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга і / або легкого ланцюга, вибрану з SEQ ID NO: 99-108, SEQ ID NO: 188-216 і SEQ ID NO: 225-248, вибирають з групи полінуклеотидів, які мають SEQ ID NO: 159-187 і SEQ ID NO: 249-256, або їх комбінації, де варіабельні галузі важкого і легкого ланцюга не кодуються комбінацією SEQ ID NO:11 і SEQ ID NO:115 або SEQ ID NO: 112 і SEQ ID NO: 116. В одному з варіантів здійснення винаходу поліпептиди варіабельної галузі важкого і легкого ланцюга, які кодуються полінуклеотидами, об'єднують з отриманням химерного антитіла, більш конкретно гуманізованого антитіла. У конкретному варіанті здійснення винаходу, в якому полінуклеотид містить послідовність, яка кодує CDR1 важкого ланцюга PR1A3 або його варіант, зазначений полінуклеотид кодує заміну валіну на глутамат в положенні 31 за Кеботом. У конкретному варіанті здійснення винаходу, в якому полінуклеотид містить послідовність, яка кодує CDR3 важкого ланцюга PR1A3 або його варіант, зазначений полінуклеотид кодує заміну тирозину на аланін в положенні 98 за Кеботом або заміну аспартату на тирозин в положенні 99 за Кеботом. У конкретному варіанті здійснення винаходу, в якому полінуклеотид містить послідовність, яка кодує CDR3 важкого ланцюга PR1A3 або його варіант, зазначений полінуклеотид кодує заміну тирозину на аланін в положенні 98 за Кеботом і заміну аспартату на тирозин в положенні 99 за Кеботом. В одному з варіантів здійснення винаходу полінуклеотид кодує заміну тирозину на аланін в положенні 98 за Кеботом або заміну аспартату на тирозин в положенні 99 за Кеботом в каркасній ділянці CH1A1A (SEQ ID NO: 261) або CH1A1B (SEQ ID NO: 262). В одному з варіантів здійснення винаходу полінуклеотид містить послідовність, яка кодує важкий ланцюг, яка має SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 або SEQ ID NO: 247. В іншому варіанті здійснення винаходу полінуклеотид містить послідовність, що кодує Fc-ділянку. Винахід належить також до поліпептидів, які кодуються зазначеними полінуклеотидами. Одним з об'єктів даного винаходу є антигензв'язуючі молекули або варіанти антигензв'язуючих молекул (наприклад, антитіла або їх фрагменти) і поліпептиди, які мають таку ж специфічність зв'язування, що і у мишачого антитіла PR1A3 (наприклад, зв'язуються з тим же епітопом пов'язаного з мембраною CEA), і з порівнянною або поліпшеною біологічною активністю (наприклад, поліпшеною афінністю до пов'язаного з мембраною CEA, підвищену стабільність та / або підвищену ADCC). В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули пов'язується з тим же епітопом, що батьківська антигензв'язуюча молекула. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули конкурує за зв'язування зі зв'язаним з мембраною CEA з батьківською антигензв'язуючою молекулою. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули зв'язується зі зв'язаним з мембраною людським CEA і не зв'язується з розчинним людським CEA. Одним з об'єктів даного винаходу є антигензв'язуючі молекули або варіанти антигензв'язуючих молекул і поліпептиди, які мають підвищену стабільність в порівнянні з 20 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мишачим антитілом PR1A3 або його гуманізованим варіантом. Одним з варіантів даного винаходу є антигензв'язуючі молекули або варіанти антигензв'язуючих молекул (наприклад, антитіла або їх фрагменти) і поліпептиди, які зв'язуються зі зв'язаним з мембраною CEA й мають підвищену стабільність порівняно з гуманізованим антитілом PR1A3, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга CH7A (SEQ ID NO: 101). Одним з варіантів даного винаходу є антигензв'язуючі молекули або варіанти антигензв'язуючих молекул (наприклад, які антитіла або їх фрагменти) і поліпептиди, які зв'язуються зі зв'язаним з мембраною CEA й мають підвищену стабільність порівняно з гуманізованим антитілом PR1A3, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга CH7A (SEQ ID NO: 101) і варіабельну ділянку легкого ланцюга 2F1 (SEQ ID NO: 209). В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули або поліпептид містить щонайменше один (наприклад, один, два, три, чотири, п'ять або шість) CDR, вибраних з SEQ ID NO: 1-3, 5-10, 12-56 і 217-224 (фіг. 32 і фіг. 36). В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули або поліпептид містить: (a) послідовність CDR1 важкого ланцюга, вибрану із групи, яка складається із: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 12; (б) послідовність CDR2 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 24: і (в) послідовність CDR3 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 і SEQ ID NO: 224. В іншому варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули або поліпептид містить: (a) послідовність CDR1 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45; (б) послідовність CDR2 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO: 46 і SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 і SEQ ID NO: 55; і (в) CDR3 легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 56. У деяких варіантах здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули або поліпептид, що містить CDR, містить також каркасні залишки CH1A1A (SEQ ID NO: 261) або CH1A1B (SEQ ID NO: 262). Одним з об'єктів винаходу є варіант антигензв'язуючої молекули або поліпептид, який зв'язується зі зв'язаним з мембраною людським CEA, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга і / або варіабельну ділянку легкого ланцюга. В одному з варіантів здійснення винаходу варіабельну ділянку важкого ланцюга і / або варіабельну ділянку легкого ланцюга вибирають з варіабельної галузі важкого і / або легкого ланцюга, вибраній з SEQ ID NO: 99-108, SEQ ID NO: 188-216 і SEQ ID NO: 225-248 (фіг. 33 і фіг. 37A-37В). В одному з варіантів здійснення винаходу варіабельна ділянка важкого ланцюга містить поліпептид, що має будь-яку одну з послідовностей SEQ ID NO: 225-248. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу варіабельна ділянку важкого ланцюга містить поліпептид, послідовність якого щонайменше приблизно на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентична будь-якій одній з послідовностей SEQ ID NO: 225-248. В одному з варіантів здійснення винаходу варіабельна ділянка важкого ланцюга містить поліпептид, що має послідовність SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 і SEQ ID NO: 247. В іншому варіанті здійснення винаходу варіабельна ділянка важкого ланцюга містить поліпептид, послідовність якого щонайменше приблизно на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентична SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 і SEQ ID NO: 247. В одному з варіантів здійснення винаходу варіабельна ділянка легкого ланцюга містить поліпептид, що має послідовність SEQ ID NO: 209. В іншому варіанті здійснення винаходу варіабельна ділянка легкого ланцюга містить поліпептид, послідовність якого щонайменше приблизно на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентична SEQ ID NO: 209. В одному з варіантів здійснення винаходу антигензв'язуюча молекула, варіант антигензв'язуючої молекули або поліпептид, яка / який зв'язується зі зв'язаним з мембраною CEA, містить варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга. У конкретному варіанті здійснення винаходу варіабельна ділянка важкого ланцюга містить поліпептид, що має представлену нижче SEQ ID NO: 4: 1 2 3 4 5 6 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEX X MX WVRQAPGQGLEWMGX INTKX GEAX 7 8X9 10 11 12 13 14 YX EEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDX X YX X X X DYWGQGTTVTV 21 UA 115030 C2 SS, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1 2 3 4 5 в якій X означає Y або F; X означає S або G; X означає N або S; X означає W або Y; X 6 7 8 9 означає N, T або S; X означає T або N; X означає V або I; X означає F або A; X означає Y, A, 10 11 12 13 V, F або S; X означає D, H, W, E або Y; X означає V, L або F; X означає E, K або Q; X 14 означає A або T; і X означає M або L. У конкретному варіанті здійснення винаходу варіабельна ділянка легкого ланцюга містить поліпептид, що має представлену нижче SEQ ID NO: 11: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASX15X16X17X18X19X20VAWYQQKPGKAPKX21LIYX22AS X23X24X25X26GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK, в якій X15 означає Q, A, K або H; X16 означає N, A, Y, I, K, T або F; X17 означає V, A, G або M; X18 означає G, S, T або L; X19 означає T, N, P або A; X20 означає N або Y; X21 означає P або L; X22 означає S, L або W; X23 означає Y, N або H; X24 означає R, L, P або H; X25 означає Y, S, Q, K, E, F або P; і X26 означає S, G, I або R. Іншим об'єктом винаходу є також виділені полінуклеотиди, що кодують антигензв'язуючі молекули, варіанти антигензв'язуючих молекул або поліпептиди, які зв'язуються зі зв'язаним з мембраною CEA. В одному з варіантів здійснення винаходу полінуклеотид містить послідовність, яка кодує щонайменше три CDR важкого ланцюга (наприклад, HCDR1, HCDR2 і HCDR3) та / або три CDR легкого ланцюга (наприклад, LCDR1, LCDR2 і LCDR3), вибрані з SEQ ID NO: 1-3, 5-10, 12-56 і 217-224, або їх варіанти або укорочені форми, що містять щонайменше такі, які визначають специфічність залишки (SDR) кожного із зазначених трьох гіперваріабельних ділянок. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид кодує поліпептид, що містить один CDR3 важкого ланцюга, вибраний з SEQ ID NO: 217-224, і два CDR важкого ланцюга (наприклад, HCDR1 і HCDR2), які вибрані з SEQ ID NO: 1-3, 5-10 і 1224, і три CDR легкого ланцюга (наприклад, LCDR1, LCDR2 і LCDR3), які вибрані з SEQ ID NO: 36-56. В іншому варіанті здійснення винаходу полінуклеотид кодує поліпептид, що містить варіабельну (і) ділянку (і) легкого і / або важкого ланцюга антитіла. Полінуклеотиди, що кодують поліпептиди варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюга, можна експресувати в одному або декількох експресійних векторах. У більш конкретному варіанті здійснення полінуклеотид, який кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга і / або легкого ланцюга, яка вибрана з SEQ ID NO: 99-108, SEQ ID NO: 188-216 і SEQ ID NO: 225-248, вибирають з групи, полінуклеотидів, які мають послідовності SEQ ID NO: 159-187 і SEQ ID NO: 249-256, чи комбінацію, при цьому варіабельні галузі важкого і легкого ланцюгів не кодуються комбінацією SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 115 або SEQ ID NO: 112 і SEQ ID NO: 116. В одному з варіантів здійснення винаходу поліпептиди варіабельної галузі важкого і легкого ланцюга, які кодуються полінуклеотидами, об'єднують з отриманням химерного антитіла, більш конкретно гуманізованого антитіла. В одному з варіантів здійснення винаходу антигензв'язуюча молекула, варіант антигензв'язуючої молекули або поліпептид, що зв'язується зі зв'язаним з мембраною CEA, містить Fc-ділянку. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу антигензв'язуючу молекулу, варіант антигензв'язуючої молекули або поліпептид створюють за допомогою глікоінженерії так, щоб вони мали змінену схему глікозилювання в Fc-ділянці. У конкретному варіанті здійснення винаходу афінність до пов'язаного з мембраною CEA варіанту антигензв'язуючої молекули або поліпептиду підвищується в порівнянні з батьківським антитілом PR1A3. В іншому варіанті здійснення винаходу стабільність варіанту антигензв'язуючої молекули або поліпептиду підвищується в порівнянні з батьківським антитілом PR1A3. В іншому варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули або поліпептид має підвищену ADCC-активність. В одному з варіантів здійснення винаходу підвищена ADCC варіанту антигензв'язуючої молекули або поліпептиду є наслідком підвищення афінності поліпептиду до пов'язаного з мембраною CEA, наприклад, досягнутої за допомогою дозрівання афінності або за допомогою інших методів підвищення афінності. Іншим об'єктом винаходу є застосування антигензв'язуючої молекули, варіанти антигензв'язуючої молекули або поліпептиду для лікування захворювання, насамперед пов'язаних з проліферацією клітин порушень, при яких відбувається експресія CEA, насамперед аномальна експресія CEA (наприклад, надекспресія та / або аномальне розподілення у різних структурах в клітині) порівняно зі здоровою тканиною, що складається з клітин цього ж типу. Зазначені порушення включають (але, не обмежуючись лише ними) колоректальний рак, NSCLC (недрібноклітинний рак легені), рак шлунка, рак підшлункової залози та рак молочної залози. Рівні експресії CEA можна визначати методами, відомими в даній галузі і представленими в даному описі (наприклад, за допомогою імуногістохімічного аналізу, імунофлуоресцентного аналізу, імуноферментного аналізу, ELISA, проточної цитометрії, радіоімуноаналізу, Вестерн-блотингу, по зв'язуванню ліганду, за кіназною активністю і т.д.). 22 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Конкретним варіантом здійснення винаходу є гуманізована антигензв'язуюча молекула або її ділянка або фрагмент, які мають специфічність відносно пов'язаного з мембраною CEA, яка містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить одну будь-яку з SEQ ID NO: 225-248. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізована антигензв'язуюча молекула або її ділянка або фрагмент, які мають специфічність відносно пов'язаного з мембраною CEA, яка / який містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить одну будь-яку з SEQ ID NO: 105, 108 або 207-216. У конкретному варіанті здійснення винаходу гуманізована антигензв'язуюча молекула або її ділянка або фрагмент, яка / який зв'язується зі зв'язаним з мембраною CEA, містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить одну будь-яку з SEQ ID NO: 225-248, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить одну будь-яку з SEQ ID NO: 105, 108 або 207216. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу гуманізована антигензв'язуюча молекула містить також константну ділянку людського важкого ланцюга і / або константну ділянку людського легкого ланцюга. Зазначені константні ділянки представлені в даному описі і відомі в даній ділянці. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу гуманізована антигензв'язуюча молекула містить Fc-ділянку, більш конкретно Fc-ділянку, створену з використанням глікоінженерії. Методи гуманізації нелюдських антитіл відомі в даній ділянці. Наприклад, гуманізовані АЗМ, запропоновані в даному винаході, можна отримувати за допомогою методів, описаних в US 5225539 на ім'я Winter, US 6180370 на ім'я Queen та ін або US 6632927 на ім'я Adair та ін., повний змiст яких включено в даний опис в якості посилання. Переважно гуманізоване антитіло несе один або кілька інтродукованих в нього амінокислотних залишків, отриманих з джерела крім людини. Ці нелюдські амінокислотні залишки часто називають "імпортними" залишками, які, як правило, отримують з "імпортного" варіабельного домена. Гуманізацію, як правило, можна здійснювати за допомогою методу, описаного у Winter із співробітниками (Jones та ін., Nature, 321, 1986, сс. 522-525; Riechmann та ін., Nature, 332, 1988, сс. 323-327; Verhoeyen та ін., Science, 239, 1988, сс. 1534-1536), шляхом заміни на послідовності гіперваріабельних ділянок відповідних послідовностей людського антитіла. Таким чином, такі "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами, (US 4816567), в яких ділянка, істотно менша в порівнянні з інтактною людською варіабельною ділянкою, замінена на відповідну послідовність з антитіл видів крім людини. На практиці гуманізовані антитіла представляють собою типові людські антитіла, в яких деякі залишки гіперваріабельної ділянки і ймовірно деякі залишки FR-ділянки замінені залишками з аналогічних сайтів нелюдських антитіл (наприклад, антитіл гризунів). Пропоновані у винаході гуманізовані антитіла до CEA необов'язково можуть містити константні ділянки людського імуноглобуліну. Вибір людських варіабельних ділянок як легкого, так і важкого ланцюга, що застосовуються для створення гуманізованих антитіл, дуже важливий для зниження антигенності. Згідно так званого методу "найкращого підбору" послідовність варіабельної ділянки антитіла-донора (наприклад, гризуна) піддають скринінгу з використанням повної бібліотеки відомих послідовностей людських варіабельних ділянок. Потім людську послідовність, найбільш схожу з послідовністю донора (наприклад, гризуна), відбирають в якості людської каркасної ділянки (FR) для створення гуманізованого антитіла (Sims та ін., J. Immunol., 151, 1993, с. 2296; Chothia та ін., J. Mol. Biol., 196, 1987, с. 901). Інший метод вибору послідовності людської каркасної ділянки полягає в порівнянні послідовності кожної індивідуальної підобласті повної каркасної ділянки донора (наприклад, гризуна) (тобто, FR1, FR2, FR3 і FR4) або певної комбінації індивідуальних підобластей (наприклад, FR1 і FR2) і бібліотеки відомих послідовностей людських варіабельних ділянок, що відповідають зазначеній каркасній підобласті (наприклад, з використанням нумерації за Кеботом), і виборі людської послідовності для кожної підобласті або комбінації, яка є найбільш схожою з послідовністю гризунів (Leung, заявка на патент США № 2003/0040606A1, опублікована 27 лютого 2003). Ще один метод заснований на застосуванні конкретної каркасної ділянки, виведеної з консенсусної послідовності конкретної підгрупи легких і важких ланцюгів всіх людських антитіл (Carter та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1992, с. 4285; Presta та ін., J. Immunol., 151, 1993, с. 2623). В одному з варіантів здійснення винаходу людські каркасні ділянки вибирають з колекції послідовностей людської зародкової лінії. Зазначені колекції послідовностей людської зародкової лінії можна знайти в таких базах даних, як IMGT або VBase. Каркасні ділянки можна вибирати індивідуально (наприклад, FR1-3, відібрані в якості акцептора для варіабельних ділянок важкого і / або легкого ланцюга гуманізованих АЗМ, мішенню яких є CEA, можуть кодуватися різними генами зародкової лінії або частиною одного і того ж гена зародкової лінії). У більш конкретному варіанті здійснення винаходу FR1-3 важкого ланцюга кодуються послідовністю гену імуноглобуліну людської зародкової лінії IGHV7_4_1 * 02 (реєстраційний № X62110, SEQ ID NO: 114). В іншому конкретному варіанті здійснення 23 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу FR1-3 легкого ланцюга кодуються генною послідовністю людської зародкової лінії IMGT_hVK_1_39 (реєстраційний № X59315, SEQ ID NO: 118). В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу FR4 важкого ланцюга кодується генною послідовністю людської зародкової лінії JH6 (див. GenBank, реєстраційний № M63030). В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу FR4 легкого ланцюга кодується генною послідовністю людської зародкової лінії JK2 (див. GenBank, реєстраційний № X61584). В цілому, є бажаним, щоб антигензв'язуючі молекули, такі як антитіла та їх фрагменти, будучи гуманізовані, зберігали свою високу афінність до антигену та інші цінні біологічні властивості. Таким чином, відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу гуманізовані антитіла одержують за допомогою аналізу батьківських послідовностей і різних концептуальних (схематичних) гуманізованих продуктів з використанням тривимірних моделей батьківських і гуманізованих послідовностей. Тривимірні моделі імуноглобулінів доступні і добре відомі фахівцям в даній галузі. Доступні комп'ютерні програми, які ілюструють і відображають можливі тривимірні конформаційні структури вибраних в якості перспективних ("кандидатів") послідовностей імуноглобулінів. Оцінка цих зображень дозволяє проаналізувати ймовірну роль залишків у прояві функції послідовності імуноглобуліну-«кандидата", тобто аналіз залишків, які впливають на здатність імуноглобуліну-«кандидата" зв'язуватися з його антигеном. Таким методом можна відбирати залишки FR-ділянки і об'єднувати отримані з реципієнта і "імпортні" послідовності так, щоб отримувати необхідні характеристики антитіла, такі як підвищена афінність до антигену (ам)-мішені (ям). В цілому, залишки гіперваріабельних ділянок безпосередньо і найбільшою мірою впливають на зв'язування антигену. Одним з об'єктів винаходу є гуманізовані із дозрілою афінністю антигензв'язуючі молекули, мішенню яких є CEA, або їх варіанти, які мають необхідні властивості і характеристики, які включають (але, не обмежуючись лише ними): виражену афінність зв'язування з антигеном CEA, насамперед зі зв'язаним із мембраною CEA, і при цьому практично повну відсутність перехресної реактивності до розчинного CEA; здатність індукувати клітинний лізис екпресуючих CEA клітин in vitro і ex vivo, бажано в залежності від дози; здатність інгібувати опосередковувану CEA клітинну адгезію in vitro; здатність інгібувати ріст пухлинної тканини і / або індукувати регрес пухлинної тканини (наприклад, як це продемонстровано на моделях пухлин (наприклад, створених на мишах з використанням ксенотрансплантатів)). Як зазначено вище, згідно з деякими варіантами здійснення винаходу варіанти антигензв'язуючих молекул, пропоновані у винаході, мають підвищену афінність зв'язування, наприклад, в результаті дозрівання афінності батьківського антитіла, яке містить один або кілька CDR антитіла PR1A3. Афінність антигензв'язуючих молекул і варіантів антигензв'язуючих молекул, запропонованих у винаході, можна визначати методами, відомими в даній галузі і представленими в даному описі. У конкретному варіанті здійснення винаходу зв'язування гуманізованих антигензв'язуючих молекул, мішенню яких є CEA, або їх варіантів з людським CEA, переважно зі зв'язаним з мембраною CEA, характеризується величиною константи афінності (KD) одновалентних антигену і антитіла (константа афінності одновалентної взаємодії), що становить не більш ніж від приблизно 1 мкм до приблизно 0,001 нМ, більш конкретно не більше ніж від приблизно 800 до приблизно 1нм і ще більш краще не більше ніж від приблизно 550 до приблизно 10 нм. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули являє собою антитіло із дозрілою афінністю або його фрагмент, зв'язування якого з пов'язаним з мембраною CEA характеризується величиною константної афінності одновалентної взаємодії (KD), що становить не більш ніж від приблизно 100 до приблизно 10 нм. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули являє собою антитіло із дозрілою афінністю або його фрагмент, зв'язування якого з пов'язаним з мембраною CEA характеризується величиною константи афінності одновалентної взаємодії (KD), що становить не більш ніж від приблизно 10 до приблизно 0,1 нМ. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули являє собою антитіло із дозрілою афінністю або його фрагмент, зв'язування якого з пов'язаним з мембраною CEA характеризується величиною константи афінності одновалентної взаємодії (K D), що становить 100, 10, 1, 0,1 нМ або менше. У деяких варіантах здійснення винаходу антигензв'язуюча молекула являє собою антитіло або його фрагмент з "дозрілою" стабільністю (створене / створений таким чином, щоб воно / він мало / мав підвищену стабільність), яке / який зберігає підвищену афінність зв'язування, притаманну його батькові із дозрілою афінністю. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули зв'язується зі зв'язаним з мембраною CEA з більш високою афінністю, ніж він зв'язується з відщепленим (від мембрани) CEA. В одному з варіантів здійснення винахід варіант антигензв'язуючої молекули зв'язується зі зв'язаним з мембраною CEA в 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20 раз або більше високу афінність, ніж він 24 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язується з відщепленим CEA. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючої молекули, пропонований у винаході, як правило, пов'язується з тим же епітопом, який розпізнає мишаче антитіло PR1A3, або він має здатність конкурувати з антитілом PR1A за зв'язування зі зв'язаним з мембраною CEA. Для скринінгу антитіл, які зв'язуються з епітопом людської CEA, який зв'язується з антитілом, що становить інтерес (наприклад, які блокують зв'язування антитіла PR1A3 з людським CEA), можна застосовувати загальноприйнятий аналіз перехресної блокади, описаний в: Antibodies, A Laboratory Manual, під ред. Harlow і Lane, вид-во Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. В альтернативному варіанті можна здійснювати епітопне картування, описане у Champe та ін., J. Biol. Chem. 270, 1995, сс. 1388-1394, для вирішення питання про те, чи зв'язується антитіло із епітопом що становить інтерес. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу створюють варіанти антигензв'язуючих молекул, специфічні для людського CEA, з батьківської антигензв'язуючої молекули, мішенню якої є CEA, що містить щонайменше один CDR моноклонального антитіла PR1A3, при цьому, батьківське антитіло до CEA пов'язується з тим же епітопом, що і антитіло PR1A3, і має здатність конкурувати з PR1A3 за зв'язування з антигеном. В одному з варіантів здійснення винаходу батьківська антигензв'язуюча молекула містить щонайменше один, два або, як правило, три CDR важкого ланцюга антитіла PR1A3; в іншому варіанті здійснення винаходу батьківська антигензв'язуюча молекула містить щонайменше один, два або, як правило, три CDR легкого ланцюга антитіла PR1A3; в наступному варіанті здійснення винаходу батьківська антигензв'язуюча молекула містить три CDR важкого ланцюга і три CDR легкого ланцюга антитіла PR1A3. Переважно, коли варіант антигензв'язуючої молекули містить HCDR1 PR1A3, то HCDR1 має заміну валіну на глутамат в положенні 31 за Кеботом. Варіант АЗМ, як правило, має більш високу афінність до CEA, ніж батьківське антитіло. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант AСM має підвищену стабільність в порівнянні з батьківським антитілом. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант AСM містить Fc-ділянку. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант АЗМ створений за допомогою глікоінженерії. В одному з варіантів здійснення винаходу варіант АЗМ має підвищену ADCC-активність в порівнянні з батьківською АЗМ. У конкретному варіанті здійснення винаходу підвищена ADCC є результатом підвищеної афінності, що досягається, наприклад, в результаті дозрівання афінності батьківською AСM, яка здійснюється при створенні варіанту AСM. Згідно більш конкретного варіанту здійснення винаходу підвищення ADCC складає щонайменше від приблизно 40 % до приблизно 100 % в порівнянні з ADCC батьківською антигензв'язуючою молекулою. Відповідно до іншого конкретного варіанту здійснення винаходу підвищення активності ADCC у варіанту АЗМ становить від щонайменше приблизно 10 % до приблизно 100 % при оцінці цитотоксичності за допомогою аналізу in vitro. Згідно більш конкретного варіанту здійснення винаходу варіант AСM індукує ADCC від щонайменше приблизно в 10 разів до приблизно в 1000 разів більш ефективно при застосуванні в конкретній концентрації в порівнянні з мишачим антитілом PR1A3. Відповідно до іншого конкретного варіанту здійснення винаходу підвищена ADCC-активність є результатом створення Fc-ділянки за допомогою глікоінженерії. Відповідно до іншого конкретного варіанту здійснення винаходу підвищена ADCC-активність є результатом комбінації процесів дозрівання афінності і глікоінженерії. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу варіант антигензв'язуючих молекул, запропонованих у винаході, містить одну або кілька амінокислотних замін щонайменше в одному CDR. Кількість амінокислотних замін може становити від однієї до десяти (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10), переважно від двох до п'яти (наприклад, 2, 3, 4 або 5). Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу щонайменше один CDR важкого ланцюга містить одну або кілька амінокислотну (их) заміну (н). В іншому варіанті здійснення винаходу щонайменше один CDR легкого ланцюга містить одну або кілька амінокислотну (их) заміну (н). В іншому варіанті здійснення винаходу щонайменше один CDR важкого ланцюга містить одну або кілька амінокислотну (их) заміну (н) і щонайменше один CDR легкого ланцюга містить одну або кілька амінокислотну (их) заміну (н). Краще, коли антигензв'язуюча молекула стримає HCDR1 PR1A3, то HCDR1 містить заміну валіну на глутамат в положенні 31 за Кеботом. Для досягнення істотних змін біологічних властивостей антигензв'язуючих молекул здійснювали відбір замін, які значною мірою відрізняються за своїм впливом на підтримання (a) структури поліпептидного каркаса в ділянки заміни, наприклад, β-складчастої або спіральної конформації, (б) заряду або гідрофобності молекули в ділянки -мішені або (в) загального обсягу бічного ланцюга. Варіанти антигензв'язуючих молекул, що містять амінокислотні заміни, можуть мати поліпшену біологічну активність, наприклад, поліпшену афінність зв'язування антигену і 25 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підвищену ADCC, в порівнянні з батьківською антигензв'язуючою молекулою. Амінокислотні заміни можна інтродуціювати за допомогою різних методик, відомих в даній галузі, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) сайтнаправленний мутагенез та / або дозрівання афінності батьківської антигензв'язуючої молекули, наприклад, за допомогою фагового дисплея. Для ідентифікації перспективних з позицій модифікації сайтів ("сайтів-кандидатів"), наприклад, залишків у гіперваріабельній ділянці, можна здійснювати мутагенез, такий як сканування аланіном, для виявлення залишків, які вносять значний внесок у зв'язування антигену. В альтернативному або додатковому варіанті може виявитися цінним здійснювати аналіз кристалічної структури комплексу антиген-антитіло для ідентифікації точок контакту між антитілом і людським CEA. Зазначені залишки, які входять в контакт й сусідні залишки є кандидатами для замін з використанням методів, відомих у даній галузі, та / або поданих в даному описі. Після створення таких варіантів панель варіантів можна піддавати скринінгу за допомогою методів, відомих у даній галузі, та / або поданих в даному описі, і антитіла, які мають поліпшені властивості за даними одного або декількох відповідних аналізів, можна відбирати для додаткового удосконалення. Фаговий дисплей можна застосовувати для створення популяції послідовностей гіперваріабельних ділянок з батьківської антигензв'язуючої молекули, яка містить випадкову (і) амінокислотну (і) мутацію (і). Наприклад, змінюють шляхом мутації кілька сайтів гіперваріабельної ділянки (наприклад, 6-7 сайтів) для створення всіх можливих амінокислотних замін в кожному сайті. В альтернативному варіанті можна піддавати неспецифічному мутагенезу варіабельні ділянки важкого і / або легкого ланцюга. Мутації можна створювати за допомогою методик, відомих в даній галузі, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) застосування мутагенезних праймерів, контроль кількості циклів і використання мутагенних нуклеотидних аналогів 8-оксо-ДГТФ і ДПТФ в процесі ПЛР-ампліфікації. Створені таким чином варіанти антитіл експонуються в одновалентній формі на частинках нитчастих фагів у вигляді злиттів із продуктом гену III фагу M13, упакованого в кожну частинку. Варіанти, отримані за допомогою фагового дисплея, потім піддають скринінгу щодо їх біологічної активності (наприклад, афінності зв'язування) згідно методів, представлених в даному описі, і кандидати, з одним або декількома поліпшеними видами активності, застосовують для подальшого удосконалення. Методи створення фагових дисплейних бібліотек описані у Huse та ін., Science, 246, 1989, сс. 1275-1281; Proc. Nat'l Acad. Sci., USA, 88, 1991, сс. 4363-4366, повний змiст кожної з публікацій включено в даний опис в якості посилання. Альтернативний метод ідентифікації антигензв'язуючих молекул із дозрілою афінністю описано, наприклад, в US 7432063 на ім'я Balint та ін., повний змiст якого включено в даний опис в якості посилання. У деяких варіантах здійснення винаходу антигензв'язуючі молекули і варіанти антигензв'язуючих молекул, запропоновані в даному винаході, містять Fc-ділянку, переважно людську Fc-ділянку. Послідовності і структури Fc-ділянок відомі в даній галузі та охарактеризовані. У конкретному варіанті здійснення винаходу людську константну ділянку виводять з IgG1, і вона має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 121 і 122. Однак під обсяг даного винаходу підпадають також варіанти і ізоформи людської Fc-ділянки. Наприклад, варіанти Fc-ділянок, які можна застосовувати відповідно до даного винаходу, можна отримувати за допомогою методів, викладених в US 6737056 на ім'я Presta (варіанти Fc-галузі зі зміненою ефекторною функцією в результаті однієї або декількох амінокислотних модифікацій); або в заявках на патент США № № 60/439498; 60/456041; 60/514549; або в WO 2004/063351 (варіанти Fc-ділянок з підвищеною афінністю зв'язування в результаті амінокислотних модифікацій); або в заявці на патент США № 10 / 672280 або WO 2004/099249 (варіанти Fcгалузі зі зміненим зв'язуванням з FcγR в результаті амінокислотних модифікацій), повний змiст всіх документів включено в даний опис в якості посилання. У конкретному варіанті здійснення винаходу АЗМ, мішенню яких є CEA, і варіанти АЗМ містять Fc-ділянку, створену за допомогою глікоінженерії з метою зміни активності ефекторної функції АЗМ (наприклад, зниження фукозилювання, підвищення афінності зв'язування з Fc-рецептором, підвищення ADCC і т.д.). Методи глікоінженерії, які можна застосовувати, детально викладені нижче в даному описі і відомі в даній галузі. В одному з варіантів здійснення винаходу антигензв'язуючу молекулу або варіант антигензв'язуючої молекули, пропоновану / пропонований в даному винаході, кон'югують з додатковим фрагментом, таким як радіоактивна мітка або токсин. Зазначені кон'юговані антигензв'язуючі молекули можна отримувати численними методами, які добре відомі в даній галузі. Кон'югати, містять АЗМ, мішенню яких є CEA, пропоновані у винаході, детально викладені нижче в даному описі в розділі "Кон'югати антигензв'язуючих молекул, мішенню яких є CEA". 26 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Експресійні вектори і клітини-хазяїни Одним з об'єктів даного винаходу є експресійний вектор і / або клітина-хазяїн, які містять один або кілька виділених полінуклеотидів, запропонованих в даному винаході. Наприклад, клітина-хазяїн або експресійний вектор містить один або кілька полінуклеотидів або полінуклеотидів, які кодують поліпептиди, АЗМ та / або варіанти АЗМ, представлені в даному описі. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб одержання АЗМ, яка специфічно зв'язується зі зв'язаним з мембраною людським CEA, що полягає в тому, що: культивують клітину-хазяїна, яка містить один або кілька виділених полінуклеотидів, запропонованих в даному винаході, або експресійний вектор, який містить один або кілька виділених полінуклеотидів, запропонованих в даному винаході, в середовищі або в умовах, в яких може відбуватися експресія одного або декількох полінуклеотидів, де один або декілька полінуклеотидів кодує (ють) один або кілька поліпептидів, що утворюють частину АЗМ; і виділяють зазначену АЗМ, де АЗМ або її частина зв'язується зі зв'язаним з мембраною CEA. Як правило, для експресії АЗМ, пропонованої в даному винаході, можна застосовувати культивовану клітинну лінію будь-якого типу. У кращому варіанті здійснення винаходу в якості основної клітинної лінії для створення клітин-хазяїнів, запропонованих у винаході, використовують CHO-клітини, BHK-клітини, NS0-клітини, SP2/0-клітини, клітини мієломи лінії YO, клітини мишачої мієломи лінії P3X63, PER-клітини, PER.C6-клітини або клітини гібридоми, інші клітини ссавців, клітини дріжджів, клітини комах або клітини рослин. У конкретному варіанті здійснення винаходу клітина-хазяїн або експресійний вектор містить один або кілька полінуклеотидів, що кодують анти-CEA АЗМ, представлену в даному описі. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло являє собою антитіло із дозрілою афінністю. Антитіло із дозрілою афінністю, як правило, має підвищену афінністю зв'язування в порівнянні з референс-антитілом, з якого виведено антитіло із дозрілою афінністю. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло з необхідними терапевтичними властивостями, включаючи (але, не обмежуючись лише ними): виражену афінність зв'язування з антигеном CEA, зокрема, зі зв'язаним з мембраною CEA, і при цьому практично повну відсутність перехресної реактивності до розчинного CEA; здатність індукувати клітинний лізис клітин, які екпресують CEA in vitro і ex vivo, бажано в залежності від дози; здатність інгібувати опосередковувану CEA клітинну адгезію in vitro; здатність інгібувати ріст пухлинної тканини і / або індукувати регрес пухлинної тканини в дослідах на моделях пухлин, створених на мишах (наприклад, створених на мишах з використанням ксенотрансплантату). В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло має підвищену стабільність в порівнянні з батьківським антитілом, з якого виведено більш стабільне антитіло. В іншому варіанті здійснення винаходу варіант антитіла або його фрагмент містить людську Fc-ділянку. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу один або кілька полінуклеотидів, що кодують АЗМ, пропоновану в даному винаході, можна експресувати під контролем конститутивного промотору або в альтернативному варіанті в регульованій експресійній системі. Прийнятні регульовані експресійні системи включають (але, не обмежуючись ними) регульовану тетрацикліном експресійну систему, індуковану екдізоном експресійну систему, яка може перемикатися за допомогою lac експресійну систему, індуковану глюкокортикоїдом експресійну систему, систему з використанням індукованого температурою промотору і індуковану металом металотіонеїну експресійну систему. Якщо в систему клітини-хазяїна входять декілька різних нуклеїнових кислот, що кодують АЗМ, запропоновані в даному винаході, то деякі з них можна експресувати під контролем конститутивного промотору, а інші експресувати під контролем регульованого промотору. За максимальний рівень експресії приймають найбільш високий можливий рівень стабільної експресії поліпептиду, який не чинить значного шкідливого впливу на швидкість клітинного росту, і його можна визначати за допомогою звичайного експерименту. Рівні експресії визначають методами, добре відомими в даній галузі, в тому числі за допомогою Вестерн-блотингу з використанням антитіла, специфічного щодо АCМ, або антитіла, специфічного до пептидної мітки, злитої із АЗМ; і методом Нозерн-блотингу. В іншому варіанті полінуклеотид може бути функціонально пов'язаний з репортерним геном; рівні експресії АЗМ, представленої в даному описі, визначають, оцінюючи сигнал, який корелює з рівнем експресії репортерного гену. Репортерний ген можна транскрибувати разом з нуклеїновою (ими) кислотою (ами), яка (і) кодує (ють) АЗМ, у вигляді однієї молекули мРНК; відповідні їм такі, що кодують послідовності можуть бути злиті або за допомогою внутрішнього сайту зв'язування (посадки) рибосом (IRES) або за допомогою незалежного від кепа енхансеру трансляції (CITE). Репортерний ген можна транслювати в поєднанні щонайменше з однією нуклеїновою кислотою, що кодує АЗМ, представлену в даному описі, з утворенням одного поліпептидного ланцюга. Нуклеїнові кислоти, які кодують АЗМ, 27 UA 115030 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пропоновану в даному винаході, можна функціонально пов'язувати з репортерним геном під контролем одного промотору, так, щоб нуклеїнова кислота, що кодує АЗМ і репортерний ген, транскрибувалася із молекули РНК, з якої в результаті альтернативного сплайсингу утворювалися дві різні молекули матричної РНК (мРНК); після трансляції однієї з утворених мРНК отримують репортерний білок, а після трансляції другий отримують АЗМ. Для конструювання експресійних векторів, що містять послідовність, що кодує АЗМ, яка зв'язується з тим же епітопом, що і мишаче антитіло PR1A3, поряд з відповідними сигналами, контролюючими транскрипцію / трансляцію, можна застосовувати методи, добре відомі фахівцям в даній галузі. Ці методи являють собою методи рекомбінантної ДНК in vitro, методи синтезу і методи рекомбінації / генетичної рекомбінації in vivo (див, наприклад, методи, описані у Maniatis та ін., Molecular Cloning A Laboratory Manual, вид-во Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989; та Ausubel та ін., Current Protocols in Molecular Biology, вид-во Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989). Для експресії яка кодує послідовності АЗМ, пропонованої в даному винаході, можна використовувати різні системи експресійних векторів-хазяїнів. Переважно клітини ссавців застосовують у ролі систем клітин-хазяїв, трансфектованих експресійними векторами у вигляді рекомбінантної плазмідної ДНК або рекомбінантної космідної ДНК, які містять послідовність, що кодує інтерес, який представляє білок, і кодуючи послідовність злитого поліпептиду. Найбільш переважно в якості системи клітин-хазяїв застосовують CHO-клітини, BHK-клітини, NS0-клітини, SP2/0-клітини, клітини мієломи лінії YO, клітини мишачої мієломи лінії P3X63, PER-клітини, PER.C6-клітини або клітини гібридоми, інші клітини ссавців, клітини дріжджів, клітини комах і клітини рослин. Деякі приклади експресійних систем і методів селекції дано у наступних публікаціях і наведених у них посиланнях: Borth та ін., Biotechnol. Bioen. 71 (4), 2000-2001, сс. 266-273, Werner та ін., Arzneimittelforschung / Drug Res. 48 (8), 1998, сс. 870-880, Andersen і Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13, 2002, сс. 117-123, Chadd і Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12, 2001, сс. 188-194 і Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12, 2001, сс. 450-454. В альтернативних варіантах здійснення винаходу можна застосовувати інші системи на основі еукаріотів-хазяїв, такі як клітини дріжджів, трансформовані рекомбінантними дріжджовими експресійними векторами, які містять послідовність, що кодує АЗМ, пропоновану в даному винаході, такі як системи експресії, описані в заявці на патент США № 60/344169 і в WO 03/056914 (методи отримання глікопротеїну який нагадує людський, у нелюдській еукаріотичній клітині-хазяїні) (зміст кожного з документів повністю включено в даний опис як посилання); системи клітин комах, заражених рекомбінантними вірусними експресійними векторами (наприклад, бакуловірусними векторами), які містять послідовність, що кодує антитіла до CEA; системи рослинних клітин, заражені рекомбінантними вірусними експресійними векторами (наприклад, вірусом мозаїки кольорової капусти, CaMV; вірусом мозаїки тютюну, TMV), або трансформовані рекомбінантними плазмідними експресійними векторами (наприклад Tiплазмідними), які містять послідовність, що кодує АЗМ, пропонованої у винаході, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) системи експресії, описані в заявці на патент США № 6815184 (методи експресії і секреції біологічно активних поліпептидів із створеної за допомогою генної інженерії ряски); WO 2004/057002 (виробництво глікозильованих білків в рослинних клітинах мохоподібних шляхом інтродукції гену глікозілтрансферази) і WO 2004/024927 (методи створення позаклітинного гетерологічного нерослинного білка в протопластах мохів); і в заявках на патент США № 60/365769, № 60/368047 і в WO 2003/078614 (процесинг глікопротеїнів в трансгенних рослинах, що містять функціональний фермент GnTIII ссавців) (зміст кожного з документів повністю включено в даний опис як посилання); або системи на основі клітин тварин, заражених рекомбінантними вірусними експресійними векторами (наприклад аденовірусними, на основі вірусу віспи), включаючи клітинні лінії, сконструйовані так, що вони містять безліч копій ДНК, яка кодує химерну анти-CEA АЗМ, де копії або стабільно ампліфікують (CHO / dhfr), або нестабільно ампліфікують в подвійних мікрохромосомах (наприклад мишачі клітинні лінії). Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу вектор, що містить полінуклеотид (и), який (і) кодує (ють) АЗМ, пропоновану у винаході, є поліцістронним. Крім того, відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу зазначена вище АЗМ є антитіло або його фрагмент. В одному з варіантів здійснення винаходу АЗМ є антитіло із дозрілою афінністю. В одному з варіантів здійснення винаходу АЗМ є антитіло з "дозрілою" стабільністю. Стабільна експресія, як правило, переважно являє собою короткочасну експресію, оскільки при цьому зазвичай отримують більш відтворені результати, а також це більше відповідає великомасштабному виробництву, проте вирішення питання про те, чи є короткочасна експресія більш кращою в конкретній ситуації, знаходиться в компетенції фахівця в даній галузі. Крім застосування експресійних векторів, які містять вірусні сайти ініціації реплікації, клітини-хазяїни 28