Трансгенна рослина цукрової тростини, яка містить днк, що кодує інсектицидний білок cry1fa, і днк, що кодує інсектицидний білок cry1ab, для боротьби з вогнівкою цукрової тростини

Реферат: Даний винахід стосується способів і рослин цукрової тростини для боротьби з комахою вогнівкою цукрової тростини (SCB), де вказані рослини цукрової тростини містять корові токсиновмісні білки Cry1Fa і Cry1Ab, в комбінації для затримки або попередження розвитку резистентності у SCB. UA 112056 C2 (12) UA 112056 C2 UA 112056 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ОПИС Рівень техніки Щорічно мільярди доларів витрачаються на боротьбу з комахами-шкідниками, і ще мільярди доларів втрачаються за рахунок збитку, який вони наносять. Синтетичні органічні хімічні інсектициди були основними інструментами, які використовувалися для боротьби з комахамишкідниками, але біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, отримані з Bacillus thuringiensis (Bt), в деяких областях зіграли дуже важливу роль. Можливість отримання стійких до комах рослин за допомогою трансформації генів інсектицидних Bt-білків привела до революційних перетворень в сучасному сільському господарстві, і підкреслила важливість і значення інсектицидних білків і їх генів. Деякі Bt-білки використовували для створення стійких до комах трансгенних рослин, які до теперішнього часу були успішно зареєстровані і стали промислово доступними. Вони включають Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fа і Cry3Bb в кукурудзі, Cry1Aс і Cry2Ab в бавовнику і Cry3A в картоплі. Промислово доступні продукти, які експресують дані білки, експресують один білок, за винятком тих випадків, коли бажаний комбінований спектр 2 інсектицидних білків (наприклад, Cry1Ab і Cry3Bb в комбінації в кукурудзі для забезпечення стійкості відповідно до лускокрилих шкідників і кореневих нематод), або коли незалежна дія білків робить їх придатною як інструмент для затримки розвитку резистентності у чутливих популяцій комах (наприклад, Cry1Aс і Cry2Аb в комбінації в бавовнику для забезпечення керування резистентністю у тютюнової листовійки). Тобто, деякі властивості стійких до комах трансгенних рослин, які привели до швидкого і широкого впровадження даної технології, також дали підставу вважати, що в популяціях комах буде розвиватися резистентність до інсектицидних білків, які продукуються такими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для того, щоб зберегти застосування Bt-ознак стійкості до комах, які включають застосування діючих білків у високій дозі в комбінації зі "сховищем" і альтернативно зі спільним розміщенням інших токсинів (McGaughey et al. (1998) "B.t. Resistance Management", Nature Biotechnol., 16:144-146). Для білків, вибраних для застосування в стеках керування резистентністю комах (IRM), потрібно виявляти їх інсектицидний ефект незалежно, так, щоб резистентність, що виникла до одного білка, не додавала резистентності до другого білка (тобто була відсутня перехресна резистентність до білків). Якщо, наприклад, популяція шкідників, вибрана за рахунок наявності резистентності до "білка А", одночасно є сприйнятливою до "білка В", то заявники стверджують, що відсутня перехресна резистентність і що комбінація білка А і білка В буде ефективною в затримці розвитку резистентності до одного білка А. При відсутності резистентних популяцій комах можна провести прогностичні оцінки, основані на інших характеристиках, ймовірно пов'язаних з механізмом дії і можливістю розвитку перехресної резистентності. Було запропоновано використовувати опосередковане рецептором зв'язування для ідентифікації інсектицидних білків, для яких, ймовірно, не характерна перехресна резистентність (van Mellaert et al., 1999). Ключовим прогностичним показником відсутності перехресної резистентності в даному підході є той факт, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори у сприйнятливих видів комах. У тому випадку, коли два Bt-токсини конкурують у комах за один і той же рецептор, і якщо рецептор мутує у цієї комахи таким чином, що один з токсинів більше не зв'язується з рецептором і в результаті більше не виявляє інсектицидної активності проти цієї комахи, то це може бути випадком, коли у комахи також буде розвиватися резистентність до другого токсину (який конкурентно зв'язаний з тим же рецептором). Однак якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це може бути показником того, що комаха не буде одночасно мати резистентність до цих двох токсинів. Білок Cry1Fa використовується для боротьби з багатьма лускокрилими комахами, включаючи кукурудзяного стеблового метелика (Hübner) і кукурудзяну листову совку (FAW; Spodoptera frugiperda), і білок активний проти вогнівки цукрової тростини (SCB; Diatraea saccharalis). Білок Cry1Fa, продукований в трансгенних рослинах кукурудзи, що містить подію TC1507, відповідальний за провідну в галузі ознаку резистентності комах в заходах для боротьби з FAW. Білок Cry1Fa також входить до складу продуктів Herculex®, SmartStax™ і WideStrike™. Можливість проводити дослідження, основані на зв'язуванні (конкурентному або гомологічному) з рецептором з використанням білка Cry1Fa була обмежена, оскільки доступний звичайний метод введення мітки в білки для детектування в тестах зв'язування з рецептором приводив до інактивації інсектицидної активності білка Cry1Fa. 1 UA 112056 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Cry1Ab і Cry1Fa є інсектицидними білками, які застосовуються в цей час (окремо) в трансгенній кукурудзі для захисту рослин від різних комах-шкідників. Ключовим шкідником кукурудзи, від якого забезпечується захист даними білками, є кукурудзяний стебловий метелик (ECB). Патент США № 2008/0311096 стосується частково застосування Cry1Ab для боротьби з резистентною до Cry1Fa популяцією ECB. Суть винаходу Даний винахід частково стосується неймовірного відкриття того, що Cry1Fa є дуже активним проти популяції вогнівки цукрової тростини (SCB), яка є резистентною до Cry1Ab. Як це буде зрозуміло фахівцям в даній галузі за допомогою даного розкриття, рослини цукрової тростини, які продукують Cry1Fa і Cry1Ab (включаючи інсектицидні фрагменти повнорозмірних білків), будуть придатними для затримки або попередження розвитку резистентності у SCB до будьякого одного з даних інсектицидних білків. Докладний опис винаходу Даний винахід частково стосується неймовірного відкриття того, що Cry1Fa є дуже активним проти популяції вогнівки цукрової тростини (SCB; Diatraea saccharalis), яка резистентна до Cry1Ab. Отже, даний винахід частково стосується неймовірного відкриття того, що Cry1Fa можна використовувати в комбінації з або "в стеку" з Cry1Ab в цукровій тростині для боротьби з розвитком резистентності у SCB до будь-якого одного з даних інсектицидних білків. Кажучи інакше, даний винахід частково стосується неймовірного відкриття того, що популяція вогнівки цукрової тростини, вибрана внаслідок резистентності до Cry1Ab, не є резистентною до Cry1Fa; вогнівка цукрової тростини, резистентна до токсину Cry1Ab, чутлива (тобто не має перехресної резистентності) до Cry1Fa. Таким чином, даний винахід включає застосування Cry1Fa-токсину на цукровій тростині для боротьби з популяціями вогнівки цукрової тростини, які резистентні до Cry1Ab. Як буде зрозуміло фахівцям в даній галузі за допомогою даного розкриття, рослини цукрової тростини, які експресують cry1Fa і cry1Ab (включаючи їх інсектицидні фрагменти), будуть придатними для затримки або попередження розвитку резистентності SCB до будь-якого одного з даних інсектицидних білків. Даний винахід включає застосування Cry1Fa і Cry1Ab для захисту цукрової тростини від пошкодження і втрат урожаю, викликаного вогнівкою цукрової тростини або популяціями вогнівки цукрової тростини, у яких розвинулася резистентність до Cry1Ab. Таким чином, даний винахід стосується стека IRM для придушення розвитку резистентності до Cry1Ab і/або Cry1Fa у вогнівки цукрової тростини. Частково основуючись на даних, описаних в цьому документі, спільна експресія генів cry1Ab і cry1Fa в цукровій тростині може продукувати високу дозу стека IRM для контролю SCB. До даної комбінації можна додати інші білки для розширення спектра дії. На основі цих даних можна передбачити, що Cry1Fa буде ефективним в контролі популяцій SCB, у яких розвинулася резистентність до Cry1Ab. Однією можливістю впровадження є застосування даних Cry-білків в географічних зонах, в яких Cry1Ab став неефективним в боротьбі з SCB за рахунок розвитку резистентності. Іншою можливістю впровадження буде застосування одного або обох таких Cry-білків в комбінації з Cry1Ab для придушення розвитку резистентності у SCB до Cry1Ab. Химерні токсини за даним винаходом включають повний N-кінцевий фрагмент, відповідний коровому токсину Bt-токсину, в тій же точці після кінця фрагмента токсину білок має перехід в гетерологічну послідовність протоксину. N-кінцевий фрагмент токсину в Bt-токсині далі стосується "корового токсину". Перехід в сегмент гетерологічного протоксину має місце приблизно в сполуці токсину/протоксину, або альтернативно фрагмент нативного протоксину (що простягається за фрагментом корового токсину) може зберегтися, з переходом в гетерологічний протоксин, який розташований даунстрим. Як приклад один химерний токсин за даним винаходом містить повний фрагмент корового токсину Cry1Ab (амінокислоти 1-601) і гетерологічний протоксин (амінокислоти 602 до С-кінця). У одному переважному варіанті здійснення фрагмент химерного токсину, який містить протоксин, отримують з білка-токсину Cry1Ab. Якдругий приклад другий химерний токсин за даним винаходом містить повний фрагмент корового токсину Cry1Са (амінокислоти 1-619) і гетерологічний протоксин (амінокислоти 620 до С-кінця). У переважному варіанті здійснення фрагмент химерного токсину, який містить протоксин, отримують з білка-токсину Cry1Ab (вказане вище також стосується інсектицидних білків Cry1Fa). Якщо не указано інакше, то послідовності можна отримати, як описано в заявці на патент США № 2008/0311096. Фахівцям в даній галузі, очевидно, зрозуміло, що Bt-токсини, навіть всередині певного класу, такого як Cry1Fa або Cry1Ab, до деякої міри будуть варіювати в довжині і точному положенні 2 UA 112056 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переходу від фрагмента корового токсину до фрагмента протоксину. Як правило, токсини Cry1Fa мають довжину приблизно від 1150 до приблизно 1200 амінокислот. Звичайно перехід від фрагмента токсину до фрагмента протоксину складає приблизно від 50 % до приблизно 60 % від повної довжини токсину. Химерний токсин за даним винаходом буде включати повну експансію даного N-кінцевого фрагмента корового токсину. Таким чином, химерний токсин буде включати щонайменше приблизно 50 % від повної довжини Cry1Fa або Cry1Ab Bt-токсину. Це буде становити щонайменше приблизно 590 амінокислот. Відносно фрагмента протоксину, то повна експансія фрагмента протоксину Cry1Ab простягається від кінця фрагмента токсину до Скінця молекули. Це приблизно останні 100-150 амінокислот даного фрагмента, які є найбільш важливими для включення в химерний токсин за даним винаходом. Гени і токсини. Гени і токсини, придатні для застосування за даним винаходом, включають не тільки розкриті повнорозмірні послідовності, але також фрагменти даних послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, які зберігають специфічну пестицидну активність токсинів, конкретно приведених як приклад. У тому значенні, в якому в даному документі використовуються терміни "варіанти" або "варіації" генів, вони стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують одні і ті ж токсини, або які кодують еквівалентні токсини, що мають пестицидну активність. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "еквівалентні токсини", він стосується токсинів, що мають таку ж або по суті таку ж біологічну активність проти шкідників-мішеней, як і токсини за даним винаходом. У тому значенні, в якому в даному документі використовується цей термін, межі становлять приблизно 95 % (Cry1Ab's і Cry1Fa's), 78 % (Cry1Ab's і Cry1Fa's) і 45 % (Cry1's) ідентичність послідовностей згідно з "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D. R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998), Vol. 62:807-813. Ці пороги відсікання молекулярної маси також можуть бути застосовні тільки до корових токсинів (для токсинів Cry1Ab і Cry1Fa). Фахівцям в даній галузі, очевидно, зрозуміло, що гени, що кодують активні токсини, можна ідентифікувати і отримати декількома способами. Конкретні гени або фрагменти генів, приведені як приклад, можна отримати з ізолятів, які депоновані в колекції культур, як описано вище. Дані гени або їх фрагменти, або варіанти, також можна сконструювати синтетичним шляхом, наприклад, при використанні синтезатора генів. Варіації генів можна легко сконструювати з використанням звичайних способів отримання точкових мутацій. Також фрагменти даних генів можна отримати з використанням промислово доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз, слідуючи стандартним процедурам. Наприклад, можна використовувати ферменти, такі як Bal31, або сайт-направлений мутагенез для методичного відсікання нуклеотидів від кінців таких генів. Також гени, які кодують активні фрагменти, можна отримати з використанням різних рестриктаз. Протеази можна використовувати для безпосереднього отримання активних фрагментів даних токсинів. Фрагменти і еквівалентні варіанти, які зберігають пестицидну активність приведених як приклад токсинів, будуть знаходитися в об'ємі даного винаходу. Також за рахунок виродженості генетичного коду широкий ряд різних ДНК-послідовностей може кодувати амінокислотні послідовності, розкриті в даному документі. Фахівцям в даній галузі добре відоме отримання таких альтернативних ДНК-послідовностей, що кодують одні і тих же або по суті одні і ті ж токсини. Такі варіантні ДНК-послідовності знаходяться в об'ємі даного винаходу. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "по суті одні і ті ж" послідовності, він стосується послідовностей, які мають амінокислотні заміни, делеції, додавання або інсерції, які не впливають істотно негативним чином на пестицидну активність. Фрагменти генів, що кодують білки, які зберігають пестицидну активність, також входять в об'єм даного визначення. Додатковим способом ідентифікації генів, що кодують токсини, і фрагментів генів, придатних для даного винаходу, є застосування олігонуклеотидних зондів. Такі зонди представляють детектовані нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можна детектувати з використанням відповідної мітки або їх можна зробити спочатку флуоресцентними, як описано в міжнародній заявці WO93/16094. Як добре відомо в даній галузі, якщо молекула зонда і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються з утворенням сильного зв'язку між двома молекулами, то розумно передбачити, що зонд і зразок мають значну гомологію. Переважно гібридизацію проводять в жорстких умовах з використанням методів, відомих в даній галузі, описаних, наприклад, Keller G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Деякі приклади концентрацій солей і комбінацій температури є наступними (в порядку збільшення жорсткості): 2X SSPE або SSC при кімнатній температурі; 1X SSPE або SSC при 42ºC; 0,1X SSPE або SSC при 42ºC; 0,1X SSPE або SSC при 65ºC. Детектування зонда забезпечує спосіб 3 UA 112056 C2 5 10 15 20 визначення відомим шляхом того, чи мала місце гібридизація. Такий аналіз зонда забезпечує швидкий спосіб ідентифікації генів, що кодують токсини за даним винаходом. Нуклеотидні сегменти, які використовуються як зонди за винаходом, можна синтезувати з використанням ДНК-синтезатора і стандартних методів. Такі нуклеотидні послідовності також можна використовувати як ПЛР-праймери для ампліфікації генів за даним винаходом. Деякі токсини за даним винаходом конкретно приводяться як приклад в даному документі. Оскільки дані токсини є тільки прикладами токсинів за даним винаходом, то, очевидно, зрозуміло, що даний винахід включає варіантні або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), що мають таку ж або аналогічну пестицидну активність зразкового токсину. Еквівалентні токсини повинні мати амінокислотну гомологію із зразковим токсином. Як правило, така амінокислотна гомологія буде складати більше 75 %, переважно більше 90 % і найбільш переважно більше 95 %. Амінокислотна гомологія буде найбільш високою в найбільш важливих областях токсину, які відповідають за біологічну активність або беруть участь у визначенні тривимірної конфігурації, яка в кінцевому результаті відповідальна за біологічну активність. У цьому відношенні прийнятні деякі амінокислотні заміни, і можна очікувати, що такі заміни знаходяться в областях, які не є важливими для прояву активності, або являють собою консервативні амінокислотні заміни, які не впливають негативним чином на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можна розділити на наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислі. Консервативні заміни, за допомогою яких амінокислота одного класу замінюється іншою амінокислотою того ж типу, знаходяться в об'ємі даного винаходу, за умови, що заміна істотно не змінює біологічну активність сполуки. Нижче приводиться перелік прикладів амінокислот, що стосуються кожного класу. 25 30 35 40 45 50 У деяких випадках також можна провести неконсервативні заміни. Критичним чинником є те, що такі заміни не повинні істотно знижувати біологічну активність токсину. Рекомбінантні хазяї. Гени, що кодують токсини за даним винаходом, можна ввести в широкий ряд мікробних або рослинних хазяїв. Експресія гена токсину, прямо або опосередковано, приводить до внутрішньоклітинної продукції і збереження пестициду. Кон'югаційне перенесення і рекомбінантне перенесення можна використовувати для отримання Bt-штаму, який експресує обидва токсини за даним винаходом. Також можна трансформувати інші мікроорганізми-хазяї одним або обома генами токсинів для отримання синергічного ефекту. Відносно відповідних мікроорганізмів-хазяїв, наприклад, Pseudomonas, то мікроби можна застосувати в положення шкідника, де вони будуть проліферувати і поглинатися. Результатом є боротьба зі шкідником. Альтернативно мікроорганізм, що містить ген токсину, можна обробити в умовах, які пролонгують активність токсину і стабілізують клітину. Потім на оброблену клітину, яка зберігає токсичну активність, можна впливати середовищем шкідника-мішені. У тому випадку, коли ген Bt-токсину вводять в мікроорганізм-хазяїн за допомогою відповідного вектора, і на вказаний хазяїн впливають середовищем в живому стані, то важливо, щоб використовувалися певнімікроорганізми-хазяї. Вибирають мікроорганізми-хазяї, про яких відомо, що вони мешкають в "фітосфері" (філоплані, філосфері, ризосфері і/або ризоплані) однієї або більше культур, які цікавлять. Дані мікроорганізми вибирають таким чином, щоб вони були здатні успішно конкурувати в певному навколишньому середовищі (культура і інші комахимешканці) з мікроорганізмами дикого типу для забезпечення стабільної підтримки і експресії гена, який експресує поліпептид-пестицид, і бажано, забезпечення підвищеного захисту пестициду від деградації і інактивації в навколишньому середовищі. Відома велика кількість мікроорганізмів, які мешкають в філоплані (на поверхні листя рослин) і/або ризосфері (в ґрунті, який оточує коріння рослин) широкого ряду важливих сільськогосподарських культур. Такі мікроорганізми включають бактерії, водорості і гриби. 4 UA 112056 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Особливий інтерес представляють мікроорганізми, такі як бактерії, наприклад, родів Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophillius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azobacter, Leuconostoc і Alacaligenes; гриби, зокрема, дріжджі, наприклад, родів Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula і Aureobasidium. Особливий інтерес представляють такі види бактерій, які мешкають в фитосфере, як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroids, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus і Azobacter vinlandii, і види дріжджів фітосфери, такі як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, С. diffluens, С. laurentii, Saccharоmyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae і Aureobasidium pollulans. Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми. Є велика кількість способів інтродукції Bt-гена, що кодує токсин, в мікроорганізм-хазяїн в умовах, які забезпечують стабільне збереження і експресію гена. Ці способи добре відомі фахівцям в даній галузі і описані, наприклад, в патенті США № 5135867, який включений в даний документ для ознайомлення. Обробка клітин. Bacillus thuringiensis або рекомбінантні клітини, які експресують Bt-токсини, можна обробити для пролонгування активності токсинів і стабілізації клітини. Пестицидна мікрокапсула, яка утворюється, містить Bt-токсин або Bt-токсини в клітинній структурі, яку стабілізована і буде захищати токсин, коли мікрокапсула піддається впливу навколишнього середовища шкідника-мішені. Прийнятні клітини-хазяї можуть включати прокаріоти або еукаріоти, і звичайно обмежуються клітинами, які не продукують речовин, токсичних для вищих організмів, таких як ссавці. Однак можна використовувати мікроорганізми, які продукують речовини, токсичні для вищих організмів, в тому випадку, коли токсичні речовини є нестабільними, або їх вміст є досить низьким для того, щоб уникнути вияву будь-якої можливої токсичності для ссавця-хазяя. Як хазяї особливий інтерес представляють прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби. При обробці звичайно клітини повинні бути інтактними і в основному знаходитися в проліферативній формі, краще не в формі спор, хоч, в деяких випадках можна використовувати спори. Обробку клітини мікроорганізму, наприклад, мікроорганізму, що містить ген або гени Btтоксину, можна проводити хімічним або фізичним методами, або комбінацією хімічного і/або фізичного методів, при умові, що метод не впливає негативним чином на властивості токсину і не знижує здатності клітин захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галогеновані сполуки, зокрема, галогенвмісні сполуки з 17-80 атомами. Конкретніше, можна використовувати йод в м'яких умовах і протягом достатнього періоду часу для досягнення бажаних результатів. Інші відповідні способи включають обробку альдегідами, такими як глутаральдегід; протиінфекційними препаратами, такими як зефіран хлорид і цетилпіридиній хлорид; спиртами, такими як ізопропіловий і етиловий спирт; різними гістологічними фіксаторами, такими як йодний розчин Люголю, фіксатор Буена, різні кислоти і фіксатор Хеллі (дивись Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967) або обробку комбінацією фізичного (нагрівання) і хімічного агентів, які зберігають і пролонгують активність токсину, продукованого в клітині, коли клітину вводять в середовище хазяя. Прикладами фізичних методів є короткохвильове опромінення, таке як гамма-опромінення, і рентгенівське опромінення, УФ-опромінення, ліофілізація і тому подібне. Способи обробки клітин мікроорганізмів розкриті в патентах США № 4695455 і 4695462, які включені в даний документ для ознайомлення. Як правило, клітини мають підвищену стабільність структури, яка підвищує стійкість до впливу умов навколишнього середовища. У тих випадках, коли пестицид знаходиться в проформі, то метод обробки клітин потрібно вибрати таким чином, щоб не інгібувати процесинг проформи в зрілу форму пестициду під дією патогену шкідника-мішені. Наприклад, формальдегід буде поперечно зшивати білки і може інгібувати процесинг проформи поліпептиду-пестициду. Спосіб обробки повинен зберігати щонайменше значну частину біологічної доступності або біологічної активності токсину. Характеристики, що представляють особливий інтерес при виборі клітини-хазяя для цілей продукції, включають простоту введення Bt-гена або Bt-генів хазяю, доступність експресійних систем, ефективність експресії, стабільність пестициду в хазяї і наявність додаткових генетичних властивостей. Характеристики, що представляють особливий інтерес для застосування як мікрокапсул пестициду, включають захисні властивості для пестициду, такі як товщина клітинних стінок, пігментація і внутрішньоклітинна упаковка або утворення тілець 5 UA 112056 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включення; виживаність у водному середовищі; відсутність токсичності для ссавців; привабливість для захоплення шкідниками; простота в індукції загибелі і фіксації без пошкодження токсину і тому подібне. Інші чинники включають простоту формуляції і поводження, економічні міркування, стабільність при зберіганні і тому подібне. Ріст клітин. Клітину-хазяїн, що містить інсектицидний Bt-ген або Bt-гени, можна культивувати в будь-якому звичайному поживному середовищі, в якому ДНК-конструкція забезпечує вибіркову перевагу, забезпечуючи селективне середовище, в якому по суті всі або всі клітини зберігають Bt-ген. Потім можна зібрати такі клітини з використанням звичайних методів. Альтернативно клітини можна обробити до збору. Bt-клітини, які продукують токсини за винаходом, можна культивувати з використанням звичайних в даній галузі середовищ і методів ферментації. Після здійснення циклу ферментації бактерії можна зібрати першим відділенням спор і кристалів Bt з культурального бульйону способами, відомими в даній галузі. Виділені спори і кристали Bt можна формулювати у вигляді змочуваного порошку, рідкого концентрату, гранул і інших препаративних форм з додаванням поверхнево-активних речовин, диспергаторів, інертних носіїв і інших компонентів для полегшення поводження з ними і їх застосування проти конкретних шкідників-мішеней. Такі препаративні форми і способи застосування відомі в даній галузі. Препаративні форми. Формульовані гранули-приманки, що містять атрактант і спори, кристали і токсини Bt-ізолятів, або рекомбінантні мікроорганізми, що містять гени, отримані з Btізолятів, розкритих в даному документі, можна вносити в ґрунт. Формульований продукт також можна застосовувати у вигляді покриття насіння або агента для обробки коріння, загальної обробки рослин на більш пізніх стадіях вегетаційного періоду. Для обробки рослин і ґрунту Btклітинами можна використовувати змочувані порошки, гранули або дусти, які отримують змішуванням з різними інертними речовинами, такими як неорганічні мінеральні речовини (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати і тому подібне) або матеріали рослинного походження (такі як подрібнена серцевина кукурудзяного качана, рисова лузга, шкаралупа горіхів і тому подібне). Препаративні форми можуть включати ад'юванти прилипачі, стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або поверхнево-активні речовини. Рідкі препаративні форми можуть бути на водній або неводній основі, і їх можна застосовувати у вигляді пін, гелів, суспензій, емульгованих концентратів або тому подібне. Інгредієнти можуть включати реологічну добавку, поверхнево-активні речовини, диспергатори або полімери. Фахівцям в даній галузі, очевидно, зрозуміло, що концентрація пестициду буде варіювати в широких межах залежно від природи конкретної формуляції, зокрема, чи є вона концентратом або призначена для безпосереднього застосування. Пестицид буде знаходитися в концентрації, що становить щонайменше 1 % мас., або концентрація може дорівнювати 100 % мас. Сухі препаративні форми будуть містити приблизно 1-95 % мас. пестициду, в той час як рідкі препаративні форми звичайно будуть містити приблизно 1-60 % мас. твердих часток в рідкій 2 4 фазі. У препаративних формах звичайно буде знаходитися приблизно від 10 до приблизно 10 клітин/мг. Такі препаративні форми будуть застосовуватися в кількостях приблизно від 50 мг (рідина або суха речовина) до 1 кг або більш на га. Препаративні форми можна застосовувати в середовищі мешкання лускокрилого шкідника, наприклад, на листя або в ґрунт, обприскуванням, запиленням, поливом або тому подібне. Трансформація рослин. Переважний рекомбінантний хазяїн для продукції інсектицидних білків за даним винаходом являє собою трансформовану рослину. Гени, що кодують Bt-білки токсини, розкриті в даному документі, можна вставити в рослинні клітини з використанням різних способів, добре відомих в даній галузі. Наприклад, є велика кількість клонуючих векторів, що містять реплікаційну систему Escherichia coli, і маркер, який дозволяє відібрати трансформовані клітини для проведення інсерції чужорідних генів у вищі рослини. Вектори включають, серед іншого, наприклад, pBR322, серії pUC, серії M13mp, pACYC184. Отже, фрагмент ДНК, що містить послідовність, що кодує Bt-білок токсин, можна вставити у вектор у відповідному сайті рестрикції. Отриману плазміду використовують для трансформації Е. coli. Клітини E. coli культивують у відповідному поживному середовищі, потім збирають і лізують. Плазміду виділяють. Як правило, проводять аналіз послідовності, рестрикційний аналіз, електрофорез і використовують інші біохімічні-молекулярні біологічні методи як методи аналізу. Після кожної маніпуляції використовувану ДНК-послідовність можна розщепити і приєднати до наступної ДНК-послідовності. Кожну послідовність плазміди можна клонувати в одну і ту ж або різні плазміди. Залежно від способу вставки бажаних генів в рослину, можуть бути необхідні інші ДНК-послідовності. Наприклад, якщо для трансформації рослинної клітини використовують Tiабо Ri-плазміду, то щонайменше праву межу, але часто праву і ліву межі Т-ДНК Ti- або Riплазміди, потрібно з'єднати у вигляді фланкуючої області генів, призначених для вставки. 6 UA 112056 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Застосування Т-ДНК для трансформації рослинних клітин інтенсивно досліджувалося і в достатній мірі описано в Європейському патенті 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al. (1986) і An et al. (1985), і добре відоме в даній галузі. Після інтеграції вставленої ДНК в геном рослини вона є відносно стабільною. Звичайно вектор для трансформації містить селектований маркер, який додає трансформованим рослинним клітинам резистентності, серед іншого, до біоциду або антибіотику, такому як біалафос, канаміцин, G418, блеоміцин або гігроміцин. Маркер, що індивідуально використовується, отже, дозволить відібрати трансформовані клітини краще, ніж клітини, які не містять вставлену ДНК. Є велика кількість методів для інсерції ДНК в рослинну клітину-хазяїн. Такі методи включають трансформацію Т-ДНК з використанням Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як трансформуючий агент, злиття, ін'єкцію, біологічну балістику (бомбардування мікрочастинками) або електропорацію, а також інші можливі методи. Якщо для трансформації використовують Agrobacteria, то ДНК, призначену для вставки, клонують в спеціальні плазміди, а саме в проміжний вектор або бінарний вектор. Проміжні вектори можна інтегрувати в Ti- або Ri-плазміду гомологічною рекомбінацією завдяки послідовностям, які є гомологічними до послідовностей Т-ДНК. Ti- або Ri-плазміда також містить vir-область, необхідну для перенесення Т-ДНК. Проміжні вектори не можуть реплікуватися самостійно в Agrobacteria. Проміжний вектор можна перенести в Agrobacterium tumefaciens за допомогою плазмідихелпера (кон'югацією). Бінарні вектори можуть реплікуватися в Е. coli і Agrobacteria. Вони включають селективний ген-маркер і лінкер або полілінкер, який вставлений в рамку з правої і лівої приграничних областей Т-ДНК. Їх можна безпосередньо трансформувати в Agrobacteria (Holsters et al., 1978). При використанні як клітини-хазяя Agrobacterium повинні містити плазміду, яка несе vir-область. Vir-область необхідна для перенесення Т-ДНК в рослинну клітину. Можуть міститися додаткові Т-ДНК. Трансформовану таким чином бактерію використовують для трансформації рослинних клітин. Експланти рослин переважно можна культивувати з Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes для перенесення ДНК в рослинну клітину. Потім можна регенерувати цілі рослини з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, шматочків листа, сегментів стебла, коріння, а також протопластів або культивованих в суспензії клітин) у відповідному середовищі, яке може містити антибіотики або біоциди за винаходом. Потім отримані таким чином рослини можна тестувати на присутність вставленої ДНК. Відсутні особливі вимоги відносно плазмід у разі методів ін'єкції і електропорації. Можна використовувати звичайні плазміди, наприклад, такі як похідні pUC. Трансформовані клітини розвиваються в рослинах звичайним шляхом. Вони можуть утворити зародкові клітини і передати трансформовану ознаку(ознаки) потомству рослин. Такі рослини можна вирощувати звичайним шляхом і схрещувати з рослинами, які мають ті ж трансформовані спадкові чинники або інші спадкові чинники. Отримані гібриди мають відповідні фенотипічні властивості. У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини потрібно трансформувати генами, в яких кодон переважно оптимізований для застосування в рослинах. Дивись, наприклад, патент США № 5380831, який включений в даний документ для ознайомлення. Незважаючи на те, що в даному документі як приклад приводяться зрізані токсини, добре відомо в області Bt-токсинів, що токсини масою 130 kDa (повна довжина) мають N-кінцевий фрагмент, який є коровим токсином, і С-кінцевий фрагмент є "хвостом" протоксину. Таким чином, відповідні "хвости" можна використовувати зі зрізаними/коровими токсинами за даним винаходом. Дивись, наприклад, патент США № 6218188 і патент США № 6673990. Крім того, в даній галузі відомі способи отримання синтетичних Bt-генів для застосування в рослинах (Stewart and Burgin, 2007). Одним необмежувальним прикладом переважної трансформованої рослини є фертильна рослина кукурудзи, що містить експресований в рослині ген, що кодує білок Cry1Fa, і додатково містить другий експресований в рослині ген, що кодує білок Cry1Ab. Перенесення (або інтрогресію) ознаки(ознак), що визначається Cry1Ab і Cry1Fa, в інбредні лінії кукурудзи можна здійснити рекурентною селекцією, наприклад, зворотним схрещуванням. У цьому випадку необхідну рекурентну батьківську форму спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентною батьківською формою), який несе відповідний ген(и) для ознак, що визначаються Cry1Ab і Cry1Fa. Потомство даного гібрида потім зворотно схрещують з рекурентною батьківською формою з подальшою селекцією отриманого потомства на необхідну ознаку(ознаки), яка призначена для перенесення від нерекурентної батьківської форми. Після трьох, переважно, чотирьох, більш переважно п'яти і більше покоління зворотних гібридів з рекурентною батьківською формою з селекцією на необхідну ознаку(ознаки), потомство буде гетерозиготним відносно локусів, контролюючих ознаку(ознаки), яка переноситься, але буде 7 UA 112056 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такою ж як рекурентна батьківська форма відносно більшості або майже всіх інших генів (дивись, наприклад, Poehlman&Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376). Стратегії керування резистентністю комах (IRM). Наприклад, Roush et al. описують стратегії, основані на двох токсинах, так зване "нагромадження" або "стекінг" для контролю інсектицидних трансгенних культур (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. В. (1998) 353, 1777-1786). На веб-сайті Агентства по захисту навколишнього середовища США (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) приводяться наступні вказівки для забезпечення нетрансгенних сховищ (розділ не-Bt культури/кукурудзи) для застосування з трансгенними культурами. "Специфічними структурованими вимогами для Bt-захищеної (Cry1Ab і Cry1Fa) кукурудзи від кукурудзяного стеблового метелика продукти є наступними: структуровані сховища: 20 % сховищ не-лускокрилих з Bt-кукурудзою в Кукурудзяному поясі; 50 % сховищ не-лускокрилих з Bt-кукурудзою в Кукурудзяному поясі Блоки 1. Внутрішній (тобто в Bt-поле) 2. Зовнішній (тобто окремі поля в межах 1/2 милі (1/4 милі, якщо можливо) від Bt-поля для максимального довільного схрещування) Смуги в полі Смуги повинні мати ширину щонайменше 4 ряди (переважно 6 рядів) для зниження ефектів, пов'язаних з пересуванням личинок". Крім того, Національна Асоціація виробників кукурудзи на їх веб-сайті (ncga.com/insectresistance-management-fact-sheet-bt-corn) також приводить аналогічні вказівки відносно вимог для сховищ. Наприклад: "Вимоги відносно IRM кукурудзяного стеблового метелика: засадити щонайменше 20 % територій з кукурудзою гібридами сховища; у районах з виробництвом бавовни сховище повинне складати 50 %; повинні висаджуватися в межах 1/2 милі від гібридів сховища; сховище можна засівати у вигляді смуг у Bt-полі; смуги сховища повинні бути шириною щонайменше 4 ряди; сховище можна обробити звичайними пестицидами тільки, якщо досягаються економічні пороги для шкідника-мішені; не можна використовувати розпилювані інсектициди на основі Bt на кукурудзі сховища; відповідне сховище повинне бути засаджене у кожному господарстві з Bt-кукурудзою". Як стверджує Roush et al. (на сторінках 1780 і 1784 правої колонки, наприклад), "стекінг" або "накопичення" дозволяє використовувати менше сховище. Roush пропонує приблизно 10 % сховища при наявності успішного стека в порівнянні (і нижче) із приблизно 30-40 %. Будь-який з вищевказаних відсотків (такий як для 1F/1Ab) або аналогічні співвідношення сховищ можна використовувати для подвійних або потрійних стеків або пірамід за даним винаходом на цукровій тростині. Є різні шляхи забезпечення сховища, включаючи різні геометричні патерни висадження в полях (згадані вище) і суміші насіння у мішках, як додатково обговорюється Roush et al. (вище) і в патенті США № 6551962. Усі патенти, заявки на патент, попередні заявки і публікації, що стосуються або цитовані в даному документі, у повному обсязі включені в даний документ для посилання в тому ступені, до якого вони не суперечать положенням даної заявки. Наступні приклади ілюструють винахід. Приклади не слід розглядати як обмежувальні винахід. ПРИКЛАДИ Приклад 1 - Резюме - Відповідь чутливої і резистентної до Cry1Ab вогнівки цукрової тростини на Cry-білок Bacillus thuringiensis Cry1Fa Білок Cry1Fa виявляв інсектицидну активність як проти Bt-чутливих (Bt-SS), так і проти Btрезистентних (Bt-RR) штамів вогнівки цукрової тростини Diatraea saccharalis. Штам Bt-RR D. saccharalis показав 142-кратну резистентність до трипсин-активованого білка Cry1Ab. Даний Btрезистентний штам D. saccharalis виявив деяку перехресну резистентність до Cry1Fa, але співвідношення резистентності були достовірно нижчими (в 4 рази). На основі цих результатів можна передбачити, що Cry1Fa може бути ефективним в керуванні резистентністю до Cry1Ab у D. saccharalis і інших видів вогнівки кукурудзи. Приклад 2 - Матеріали і методи Cry-білки Bacillus thuringiensis 8 UA 112056 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Очищений трипсин-активований білок Cry1Ab Bacillus thuringiensis (Bt) отримували від Dr. Marianne Puztai-Carey, кафедра біохімії, Університет Кейс Вестерн Резерв, Клівленд, штат Огайо. Cry1Fa отримували від Dow AgroSciences Company (Indianapolis, IN) в буферному розчині. Cry1Ab ліофілізували з чистотою 99,9 %. Джерела комах Bt-чутливий штам (Bt-SS) D. saccharalis отримували з використанням личинок, зібраних на кукурудзяних полях біля Віннсборо в Північній Луїзіані в 2004 р. Bt-резистентний штам (Bt-RR) D. saccharalis отримували з сімейства однієї ізолінії з використанням скринінгу покоління F 2. Дані Bt-резистентні комахи завершили розвиток личинкової стадії на виробничих гібридах кукурудзи Cry1Ab і виявили високу резистентність до очищеного трипсин-активованого Cry1Abтоксину. Під час підтвердження наявності Bt-резистентності окремі особні Bt-резистентного штаму піддавали зворотному схрещуванню з Bt-чутливим штамом і повторно відбирали по резистентності на тканині листа кукурудзи з Cry1Ab в F 2-поколінні гібрида, отриманого зворотним схрещуванням. Біологічні тести з комахами Чутливість штамів Bt-SS і Bt-RR D. saccharalis до Cry1Ab і Cry1Fa визначали з використанням методу включення в корм. У кожному біологічному тесті використовували 6 або 7 концентрацій Cry-білка. Межі концентрацій Bt складали від 0,03125 до 32 мкг/г білка Cry1Ab і від 0,03125 до 128 мкг/г для оцінки білка Cry1Fa. Розчини Cry-білків готували змішуванням Btбілків з відповідною кількістю дистильованої води для дослідів з Cry1Ab або буфера для дослідів з Cry1Fa. Потім розчини Bt змішували з meridic кормом перед розливом корму в окремі ямки в 128-ямковому підносі (Bio-Ba-128, C-D International, Pitman, NJ). У біологічних тестах приблизно 0,7 мл обробленого корму вміщували в кожну ямку з використанням шприців на 10 мл (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Корм, оброблений тільки дистильованою водою (чистий контроль) або буфером, використовували для контрольних обробок. Одна новонароджена особина D. saccharalis (протягом