Трансгенна рослина, яка містить днк, що кодує інсектицидний білок cry1ab, і днк, що кодує інсектицидний білок cry1be, для керування резистентністю комах

Реферат: Даний винахід стосується способів і рослин для боротьби з кукурудзяним стебловим метеликом і/або кукурудзяною листовою совкою, де вказані рослини містять інсектицидний білок Cry1Ab і інсектицидний білок Cry 1Be, і різні комбінації інших білків, що містять дану пару білків, для затримки або попередження розвитку резистентності у комах. UA 111935 C2 (12) UA 111935 C2 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рівень техніки Люди вирощують кукурудзу для отримання продуктів харчування і енергії. Люди також обробляють багато інших сільськогосподарських культур, включаючи соєві боби і бавовники. Щорічно мільярди доларів витрачаються на боротьбу з комахами-шкідниками, і ще мільярди доларів втрачаються за рахунок збитку, який вони наносять. Синтетичні органічні хімічні інсектициди були основними інструментами, які використовувалися для боротьби з комахамишкідниками, але біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, отримані з Bacillus thuringiensis (Bt), в деяких галузях зіграли досить важливу роль. Можливість отримання стійких до комах рослин за допомогою трансформації генів інсектицидних Bt-білків, привела до революційних перетворень в сучасному сільському господарстві, і підкреслила важливість і значення інсектицидних білків і їх генів. Деякі Bt-білки використали для створення стійких до комах трансгенних рослин, які до теперішнього часу були успішно зареєстровані і стали промислово доступними. Вони включають Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fа і Cry3Bb в кукурудзі, Cry1Aс і Cry2Ab в бавовнику і Cry3A в картоплі. Промислово-доступні продукти, експресуючі дані білки, експресують один білок, за винятком тих випадків, коли бажаний комбінований спектр 2 інсектицидних білків (наприклад, Cry1Ab і Cry3Bb в комбінації в кукурудзі для забезпечення стійкості відповідно до лускокрилих шкідників і кореневих нематод), або коли незалежна дія білків робить їх придатною як інструмент для затримки розвитку резистентності у чутливих популяцій комах (наприклад, Cry1Aс і Cry2Аb в комбінації в бавовнику для забезпечення керування резистентністю у тютюнової листовійки). Дивись також публікацію заявки на патент США № 2009/0313717, яка стосується білка Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F або Cry1A для боротьби з Helicoverpa zea або armigerain. Міжнародна заявка WO 2009/132850 стосується Cry1F або Cry1A і Vip3Aa для боротьби з Spodoptera frugiperda. Публікація заявки на патент США № 2008/0311096 частково стосується Cry1Ab для боротьби з кукурудзяним стебловим метеликом, резистентним до Cry1F (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)). Тобто, деякі властивості стійких до комах трансгенних рослин, які привели до швидкого і широкого впровадження даної технології, також дали підставу вважати, що в популяціях комах буде розвиватися резистентність до інсектицидних білків, продукованих такими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для того, щоб зберегти застосування Bt-ознак стійкості до комах, які включають застосування діючих білків у високій дозі в комбінації зі «сховищем» і альтернативно з спільним розміщенням інших токсинів (McGaughey et al. (1998) «B.t. Resistance Management», Nature Biotechnol., 16:144-146). Для білків, вибраних для застосування в стеках керування резистентністю комах (IRM), потрібно виявляти їх інсектицидний ефект незалежно, так, щоб резистентність, що виникла до одного білка, не додавала резистентності до іншого білка (тобто була відсутня перехресна резистентність до білків). Якщо, наприклад, популяція шкідників, вибрана за рахунок наявності резистентності до «білка А», одночасно є сприйнятливою до «білка В», то заявники стверджують, що відсутня перехресна резистентність і, що комбінація білка А і білка В буде ефективною в затримці розвитку резистентності до одного білка А. При відсутності резистентних популяцій комах можна провести прогностичні оцінки, основані на інших характеристиках, приблизно зв'язаних з механізмом дії і можливістю розвитку перехресної резистентності. Було запропоновано використати опосередковане рецептором зв’язування для ідентифікації інсектицидних білків, для яких, ймовірно, не характерна перехресна резистентність (van Mellaert et al., 1999). Ключовим прогностичним показником відсутності перехресної резистентності в даному підході є той факт, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори у сприйнятливих видів комах. У тому випадку, коли два Bt-токсини конкурують у комах за один і той самий рецептор, і якщо рецептор мутує у цієї комахи таким чином, що один з токсинів більше не зв'язується з рецептором і в результаті більше не виявляє інсектицидної активності проти цієї комахи, то це може бути випадком, коли у комахи також буде розвиватися резистентність до другого токсину (який конкурентно зв'язаний з тим же рецептором). Тобто, комаха має перехресну резистентність до обох Bt-токсинів. Однак якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це може бути показником того, що комаха не буде одночасно мати резистентність до цих двох токсинів. Наприклад, білок Cry1Fa використовується для боротьби з багатьма лускокрилими комахами, включаючи кукурудзяного стеблового метелика (Hubner) і кукурудзяну листову совку (FAW; Spodoptera frugiperda), і білок активний проти вогнівки цукрової тростини (SCB; Diatraea saccharalis). Білок Cry1Fa, продукований в трансгенних рослинах кукурудзи, що містить подію 1 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 TC1507, відповідальний за ведучу в галузі ознаку резистентності комах в заходах для боротьби TM TM з FAW. Білок Cry1Fa також входить до складу продуктів Herculex®, SmartStax і WideStrike . Можливість провести дослідження, основані на зв’язуванні (конкурентному або гомологічному) з рецептором з використанням білка Cry1Fa була обмежена, оскільки доступний звичайний метод введення мітки в білки для детектування в тестах зв’язування з рецептором приводив до інактивації інсектицидної активності білка Cry1Fa. Додаткові Cry-токсини приводяться на веб-сайті офіційного комітету по номенклатурі У цей час відоме майже 60 основних груп «Cry»-токсинів (Cry1-Cry59) з додатковими Cyt- і VIPтоксинами і тому подібне. Багато з кожної нумераційної групи поділяються на підгрупи під великою літерою, і підгрупи під великою літерою поділяються на підпідгрупи, позначені малою літерою (наприклад, Cry1 має A-L, і Cry1A має a-i). Суть винаходу Даний винахід частково стосується дивного відкриття того, що Cry1Ab і Cry1Be не конкурують за сайти зв’язування в мембранних препаратах клітин кишечника кукурудзяного стеблового метелика (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) або кукурудзяної листової совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Як це буде зрозуміле фахівцям в даній галузі за допомогою даного розкриття, рослини, які продукують два ці білки (включаючи інсектицидні фрагменти повнорозмірних білків), можуть затримувати або попереджати розвиток резистентності до будьякого одного з даних інсектицидних білків. Кукурудза і соєві боби є тільки деякими переважними рослинами. ECB представляє переважний шкідник-мішень для даної пари токсинів. Таким чином, даний винахід частково стосується застосування білка Cry1Ab в комбінації з білком Cry1Be. Рослини (і території, засаджені такими рослинами), які продукують обидва таких білка, включені в об'єм даного винаходу. Даний винахід також стосується потрійних стеків або «пірамід» з трьох (або більше) токсинів, в яких білки Cry1Ab і Cry1Be є основною парою. У деяких переважних варіантах здійснення пірамід комбінація вибраних токсинів забезпечує три сайти дії проти ECB. Деякі переважні пірамідні комбінації з «трьома місцями дії» включають основну пару білків за даним винаходом плюс Cry2A, Cry1I і DIG-3 як третій білок для цілеспрямованої дії на ECB. Такі конкретні потрійні стеки будуть, за даним винаходом, переважно і разюче забезпечувати три сайти дії проти ECB. Це може допомогти знизити або елімінувати необхідність в територіях«сховищах». Незважаючи на те, що даний винахід розкривається в даному документі у вигляді пари токсинів Cry1Ab і Cry1Be, яких окремо або в «піраміді» з трьох або більше токсинів, які забезпечують стійкість кукурудзи до ECB, очевидно, зрозуміло, що комбінації Cry1Ab і Cry1Be, описані в даному документі, також можна використати з додатковими білками для цілеспрямованого впливу на FAW на соєвих бобах і кукурудзі. Також за даним винаходом можна додати додаткові токсини/гени. Наприклад, якщо Cry1Fa піддають стекінгу з парою білків за даним винаходом (Cry1Fa і Cry1Be обидва активні проти FAW і ECB), то додавання одного додаткового білка до даного потрійного стека, де четвертий доданий білок спрямований проти ECB, буде забезпечувати три сайти дії проти FAW, і три сайти дії проти ECB. Такий доданий білок (четвертий білок для направленої дії проти FAW) можна вибрати з групи, що складається з Cry1Fa, Vip3Ab і Cry1E. Це буде приводити до забезпечення стека з чотирьох білків, що має три сайти дії проти двох комах (ECB і FAW). Короткий опис таблиць Таблиця 1: приводяться приклади амінокислот з чотирьох класів амінокислот. Короткий опис фігур Фіг. 1: представлений графік, що показує зв’язування в процентах міченого Cry1Ab з ECB BBMV в порівнянні з Cry1Be. Фіг. 2: представлений графік, що показує зв’язування в процентах міченого Cry1Ab з FAW BBMV в порівнянні з Cry1Be. Фіг. 3: представлений графік, що показує зв’язування в процентах міченого Cry1Be з FAW BBMV в порівнянні з Cry1Ab. Докладний опис винаходу Даний винахід частково стосується дивного відкриття того, що Cry1Ab і Cry1Be не конкурують один з одним за сайти зв’язування в кишечнику кукурудзяного стеблового метелика (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) або кукурудзяної листової совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Таким чином, білок Cry1Ab можна використати в комбінації з білком Cry1Be в трансгенній кукурудзі (і інших рослинах, наприклад, бавовнику і соєвих бобах) для затримки і попередження розвитку резистентності у ECB до будь-якого одного з даних білків. Пара білків за даним винаходом може бути ефективною в захисті рослин (таких як рослини кукурудзи) від 2 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пошкодження ECB з резистентністю до Cry. Тобто, одним застосуванням даного винаходу є захист кукурудзи і інших економічно важливих видів сільськогосподарських культур від пошкодження і втрат урожаю, викликаного популяціями ECB, в яких може розвинутися резистентність до Cry1Ab або Cry1Be. Таким чином, даний винахід стосується стека для керування резистентністю у комах (IRM), що включає Cry1Ab і Cry1Be, для попередження або пригнічення розвитку резистентності ECB до одного або обох даних білків. Крім того, незважаючи на те, що даний винахід, розкритий в даному документі, стосується стека IRM, що містить Cry1Ab і Cry1Be, для попередження резистентності ECB до одного або обох даних білків, в об'ємі винаходу, розкритого в даному документі, знаходиться те, що один або обидва Cry1Ab і Cry1Be можна адаптувати, самостійно або в комбінації, для попередження резистентності FAW до одного або обох даних білків. Даний винахід стосується композицій для боротьби з лускокрилими шкідниками, що містять клітини, які продукують істинний токсинвмісний білок Cry1Ab і істинний токсинвмісний білок Cry1Be. Винахід додатково включає хазяїна, трансформованого для продукції як інсектицидного білка Cry1Ab, так і інсектицидного білка Cry1Be, де вказаний хазяїн є мікроорганізмом або рослинною клітиною. Полінуклеотид(и) за даним винаходом переважно знаходиться в генетичній конструкції під контролем не-Bacillus thuringiensis промотору(ів). Полінуклеотиди за даним винаходом можуть містити кодон, переважний для застосування в рослинах для підвищеної експресії. Додатково передбачається, що винахід стосується способу боротьби з лускокрилими шкідниками, що включає контактування вказаних шкідників або навколишнього середовища вказаних шкідників з ефективною кількістю композиції, яка містить інсектицидний білок Cry1Ab і додатково містить інсектицидний білок Cry1Be. Варіант здійснення винаходу стосується рослини кукурудзи, що містить експресований в рослині ген, що кодує істинний токсинвмісний білок Cry1Be, і експресований в рослині ген, що кодує істинний токсинвмісний білок Cry1Ab, і насіння такої рослини. Додатковий варіант здійснення винаходу стосується рослини кукурудзи, де експресований в рослині ген, що кодує істинний токсинвмісний білок Cry1Be, і експресований в рослині ген, що кодує істинний токсинвмісний білок Cry1Ab, інтрогресовані у вказану рослину кукурудзи, і насіння такої рослини. Як описано в прикладах, досліди з конкурентним зв’язуванням з рецептором з використанням мічених радіоактивною міткою білків Cry1Ab і Cry1Be показують, що білок Cry1Be не конкурує за зв’язування в тканинах ECB або FAW, з якими зв'язується Cry1Ab. Дані результати також вказують на те, що комбінація білків Cry1Ab і Cry1Be може бути ефективним засобом для пригнічення розвитку резистентності в популяціях ECB і FAW до одного з двох даних білків. Таким чином, основуючись частково на даних, описаних в цьому документі, вважається, що спільна продукція (стекінг) білків Cry1Ab і Cry1Be може використовуватися для високоефективного стека IRM для ECB. До цієї пари можна додати інші білки. Наприклад, даний винахід також частково стосується потрійних стеків або «пірамід» з трьох (або більше) токсинів, в яких Cry1Ab і Cry1Be є основною парою. У деяких переважних варіантах здійснення пірамід вибрані токсини мають три окремих сайти дії проти FAW. Деякі переважні пірамідні комбінації з «трьома сайтами дії» включають основну пару за даним винаходом плюс Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1C, Cry1D або Cry1E як третій білок для цілеспрямованої дії на FAW. Дані конкретні потрійні стеки за даним винаходом будуть переважно і разюче забезпечувати три місця сайти проти FAW. Це допоможе знизити або елімінувати потребу в територіях-сховищах. Під виразом «окремі сайти дії» розуміється, що будь-який з даних білків не викликає перехресної резистентності в іншому. До даного винаходу також можна додати додаткові токсини/гени. Наприклад, якщо Cry1Fa входить до складу стека з парою білків за даним винаходом (обидва Cry1Ab і Cry1Be активні проти обох FAW і кукурудзяного стеблового метелика (ECB)), то додавання одного додаткового білка до даного потрійного стека, де четвертий доданий білок направлений проти ECB, буде забезпечуватися три сайти дії проти FAW і три сайти дії проти ECB. Даний доданий білок (четвертий білок) можна вибрати з групи, що складається з Cry2A, Cry1I і DIG-3 (дивись заявку на патент США № 61/284278 (подану 16 грудня 2009) і заявку на патент США № 2010/00269223). Це буде приводити до отримання стека з чотирьох білків, що містить три сайти дії проти комах (ECB і FAW). Таким чином, однією можливістю впровадження є застосування пари білків за даним винаходом в комбінації з третім токсином/геном і застосування даного потрійного стека для 3 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пригнічення розвитку резистентності у ECB і/або FAW до будь-якого з даних токсинів. Отже, даний винахід також частково стосується потрійних стеків або «пірамід» з трьох (або більше) токсинів. У деяких переважних варіантах здійснення пірамід вибрані токсини мають три окремі сайти дії проти ECB і/або FAW. Серед можливостей впровадження за даним винаходом буде застосування двох, трьох або більше білків з білків за даним винаходом в районах з обробкою сільськогосподарських культур, де можуть розвинутися резистентні популяції ECB і/або FAW. Керівництво по застосуванню Cry1Fa і Cry1Be (для боротьби з ECB і/або FAW) дивись в заявці на патент США № 61/284290 (поданої 16 грудня 2009). З Cry1Fa, активним проти ECB (і FAW), Cry1Ab плюс Cry1Be, плюс Cry1Be за даним винаходом переважно і дивно забезпечуються три сайти дії проти ECB. Це може допомогти знизити або елімінувати потребу в територіях-сховищах. ® TM TM Білок Cry1Fa входить до складу продуктів Herculex , SmartStax і WideStrike . Пару генів за даним винаходом (Cry1Ab і Cry1Be) можна об'єднати, наприклад, в продукті на основі Cry1Fa, TM TM такому як Herculex®, SmartStax і WideStrike . Отже, пара білків за даним винаходом може бути ефективною в зниженні тиску відбору на дані і інші білки. Таким чином, пару білків за даним винаходом можна використати в комбінаціях з трьох генів для кукурудзи і інших рослин (наприклад, бавовнику і соєвих бобів). Як вже обговорювалося вище, до даного винаходу також можна додати додаткові токсини/гени. Для цілеспрямованого впливу на ECB можна використати Cry2A, Cry1I і/або DIG3. Дивись, наприклад, заявку на патент США № 61/284278 (подану 16 грудня 2009) і заявку на патент США № 2010/00269223. Інформацію по комбінації Cry1F і Cry1Ab (для боротьби з ECB) дивись в публікації заявки на патент США № 2008/0311096. Рослини (і території, засаджені такими рослинами), які продукують будь-яку з комбінацій білків за даним винаходом, включаються в об'єм даного винаходу. Також можна додати додаткові токсини/гени, але конкретні стеки, обговорені вище, переважно і разюче забезпечують численні сайти дії проти ECB і/або FAW. Це може допомогти знизити або елімінувати потребу в територіях-сховищах. Таким чином, поле площею більше 10 акрів, засаджене такими рослинами, включається в об'єм винаходу. GENBANK також можна використати для отримання послідовностей будь-якого з генів і білків, які обговорюються в даному документі. Дивись Додаток А нижче. Також можна використати патенти. Наприклад, в патенті США № 5188960 і патенті США № 5827514 описані істинний токсинвмісні білки Cry1F, відповідні для застосування в здійсненні винаходу. У патенті США № 6218188 описані ДНК-послідовності, оптимізовані для застосування в рослинах, кодуючі істинні токсинвмісні білки Cry1Fa, які підходять для використання в даному винаході. Комбінації білків, описані в даному документі, можна використати для боротьби з лускокрилими шкідниками. Дорослі лускокрилі комахи і метелики харчуються, головним чином, нектаром квітів і є основними ефекторами запилення. Майже всі личинки лускокрилих комах, тобто гусениці, харчуються на рослинах, і багато хто з них є серйозними шкідниками. Гусениці харчуються на поверхні і всередині листя, або на корінні або стеблині рослин, тим самим лишаючи рослину поживних речовин і часто руйнуючи фізичну підтримуючу структуру рослини. Крім того, гусениці харчуються на фруктах, бавовні і зернах, що зберігаються, а також квітах, руйнуючи ці продукти, призначені для продажу, або серйозно знижують їх якість. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «лускокрилі шкідники», він стосується різних стадій розвитку шкідника, включаючи личинкові стадії. Деякі химерні токсини за даним винаходом включають повний N-кінцевий фрагмент, відповідний істинному токсину Bt-токсину, в тій же точці після кінця фрагмента істинного токсину білок має перехід в гетерологічну послідовність протоксину. N-кінцевий, активний як інсектицид фрагмент токсину в Bt-токсині, далі стосується «істинного токсину». Перехід сегмента істинного токсину в сегмент гетерологічного протоксину знаходиться приблизно в з'єднанні токсину/протоксину, або альтернативно фрагмент нативного протоксину (що тягнеться за фрагментом істинного токсину) може зберегтися, з переходом в гетерологічний протоксин, що розташовується даунстрим. Як приклад один химерний токсин за даним винаходом має повний фрагмент істинного токсину білка Cry1Ab (амінокислоти 1-601) і/або гетерологічний протоксин (приблизно амінокислоти 602 до С-кінця). В одному переважному варіанті здійснення фрагмент химерного токсину, що містить протоксин, отримують з білка-токсину Cry1Ab. У переважному варіанті здійснення фрагмент химерного токсину, що містить протоксин, отримують з білка-токсину Cry1Ab. Фахівцям в даній галузі, очевидно зрозуміло, що Bt-токсини, навіть всередині певного класу, 4 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такого як Cry1Be, до деякої міри будуть варіювати в довжині і точному положенні переходу від фрагмента істинного токсину до фрагмента протоксину. Як правило, токсини Cry1Be мають довжину приблизно від 1150 до приблизно 1200 амінокислот. Звичайно перехід від фрагмента істинного токсину до фрагмента протоксину складає приблизно від 50% до приблизно 60% від повної довжини токсину. Химерний токсин за даним винаходом буде включати повну експансію даного N-кінцевого фрагмента істинного токсину. Таким чином, химерний токсин буде включати щонайменше приблизно 50% від повної довжини Cry1Be. Це буде становити щонайменше приблизно 590 амінокислот. Відносно фрагмента протоксину, то повна експансія фрагмента протоксину Cry1Ab буде тягнутися від кінця фрагмента істинного токсину до С-кінця молекули. Гени і токсини. Гени і токсини, придатні для застосування за даним винаходом, включають не тільки розкриті повнорозмірні послідовності, але також фрагменти даних послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, які зберігають специфічну пестицидну активність токсинів, конкретно приведених як приклад. У тому значенні, в якому в даному документі використовуються терміни «варіанти» або «варіації» генів, вони стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують одні і ті ж токсини, або які кодують еквівалентні токсини, що мають пестицидну активність. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «еквівалентні токсини», він стосується токсинів, що мають таку ж або по суті таку ж біологічну активність проти шкідників-мішеней, як і токсини за даним винаходом. У тому значенні, в якому в даному документі використовується цей термін, кордони представляють приблизно 95% (Cry1Ab's і Cry1Be's), 78% (Cry1Ab's і Cry1Be's) і 45% (Cry1's) ідентичність послідовностей згідно з «Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins», N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998), Vol. 62:807813. Ці пороги відсікання молекулярної маси також можуть бути застосовні тільки до істинних токсинів. Фахівцям в даній галузі, очевидно зрозуміло, що гени, що кодують активні токсини, можна ідентифікувати і отримати декількома способами. Конкретні гени або фрагменти генів, приведені як приклад, можна отримати з ізолятів, депонованих в колекції культур, як описано вище. Дані гени або їх фрагменти, або варіанти, також можна сконструювати синтетичним шляхом, наприклад, при використанні синтезатора генів. Варіації генів можна легко сконструювати з використанням звичайних способів отримання точкових мутацій. Також фрагменти даних генів можна отримати з використанням промислово доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз, слідуючи стандартним процедурам. Наприклад, можна використати ферменти, такі як Bal31, або сайт-направлений мутагенез для методичного відсікання нуклеотидів від кінців таких генів. Також гени, які кодують активні фрагменти, можна отримати з використанням різних рестриктаз. Протеази можна використати для безпосереднього отримання активних фрагментів даних токсинів. Фрагменти і еквівалентні варіанти, які зберігають пестицидну активність приведених як приклад токсинів, будуть знаходитися в об'ємі даного винаходу. Також за рахунок виродженості генетичного коду широкий ряд різних ДНК-послідовностей може кодувати амінокислотні послідовності, розкриті в даному документі. Фахівцям в даній галузі добре відоме отримання таких альтернативних ДНК-послідовностей, що кодують одні і тих же або по суті одні і ті ж токсини. Такі варіантні ДНК-послідовності знаходяться в об'ємі даного винаходу. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін «по суті одні і ті ж» послідовності, він стосується послідовностей, які мають амінокислотні заміни, делеції, додавання або інсерції, які не впливають істотно негативного чином на пестицидну активність. Фрагменти генів, що кодують білки, які зберігають пестицидну активність, також входять в об'єм даного визначення. Додатковим способом ідентифікації генів, що кодують токсини, і фрагментів генів, придатних для даного винаходу, є застосування олігонуклеотидних зондів. Такі зонди представляють детектовані нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можна детектувати з використанням відповідної мітки або їх можна зробити спочатку флуоресцентними, як описано в міжнародній заявці WO 93/16094. Як добре відомо в даній галузі, якщо молекула зонда і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються з утворенням сильного зв'язку між двома молекулами, то розумно передбачити, що зонд і зразок мають значну гомологію. Переважно гібридизацію проводять в жорстких умовах з використанням методів, відомих в даній галузі, описаних, наприклад, Keller G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Деякі приклади концентрацій солей і комбінацій температури є наступними (в порядку збільшення жорсткості): 2X SSPE або SSC при кімнатній температурі; 1X SSPE або SSC при 42°С; 0,1X SSPE або SSC при 42°С; 0,1X SSPE або SSC при 65°С. Детектування зонда забезпечує спосіб 5 UA 111935 C2 5 10 15 20 визначення відомим шляхом того, чи мала місце гібридизація. Такий аналіз зонда забезпечує швидкий спосіб ідентифікації генів, що кодують токсини за даним винаходом. Нуклеотидні сегменти, які використовуються як зонди за винаходом, можна синтезувати з використанням ДНК-синтезатора і стандартних методів. Такі нуклеотидні послідовності також можна використати як ПЛР-праймери для ампліфікації генів за даним винаходом. Варіантні токсини. Деякі токсини за даним винаходом конкретно приводяться як приклад в даному документі. Оскільки дані токсини є тільки прикладами токсинів за даним винаходом, то, очевидно, зрозуміло, що даний винахід включає варіантні або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), що мають таку ж або аналогічну пестицидну активність зразкового токсину. Еквівалентні токсини повинні мати амінокислотну гомологію із зразковим токсином. Як правило, така амінокислотна гомологія буде складати більше 75%, переважно більше 90% і найбільш переважно більше 95%. Амінокислотна гомологія буде найвищою в найважливіших областях токсину, які відповідають за біологічну активність або беруть участь у визначенні тривимірної конфігурації, яка в кінцевому результаті відповідальна за біологічну активність. У цьому відношенні прийнятні деякі амінокислотні заміни, і можна чекати, що такі заміни знаходяться в областях, які не є важливими для вияву активності, або являють собою консервативні амінокислотні заміни, які не впливають негативним чином на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можна розділити на наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислі. Консервативні заміни, за допомогою яких амінокислота одного класу замінюється іншою амінокислотою того ж типу, знаходяться в об'ємі даного винаходу, за умови, що заміна істотно не змінює біологічну активність сполуки. Нижче наводиться перелік прикладів амінокислот, що належать до кожного класу. Таблиця 1 Приклади амінокислот в чотирьох класах амінокислот Клас амінокислоти Неполярні Незаряджені полярні Кислі Основні Приклади амінокислот Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Asp, Glu Lys, Arg, His 25 30 35 40 45 50 У деяких випадках також можна провести неконсервативні заміни. Критичним чинником є те, що такі заміни не повинні істотно знижувати біологічну активність токсину. Рекомбінантні хазяїни. Гени, що кодують токсини за даним винаходом, можна ввести в широкий ряд мікробних або рослинних хазяїв. Експресія гена токсину, прямо або опосередковано, приводить до внутрішньоклітинної продукції і збереження пестициду. Кон’югаційне перенесення і рекомбінантне перенесення можна використати для отримання Btштаму, який експресує обидва токсини за даним винаходом. Також можна трансформувати інші мікроорганізми-хазяї одним або обома генами токсинів для отримання синергічного ефекту. Відносно відповідних мікроорганізмів-хазяїв, наприклад, Pseudomonas, то мікроби можна застосувати в положення шкідника, де вони будуть проліферувати і поглинатися. Результатом є боротьба з шкідником. Альтернативно мікроорганізм, що містить ген токсину, можна обробити в умовах, які пролонгують активність токсину і стабілізують клітину. Потім на оброблену клітину, яка зберігає токсичну активність, можна впливати середовищем шкідника-мішені. У тому випадку, коли ген Bt-токсину вводять в мікроорганізм-хазяїн за допомогою відповідного вектора, і на вказаний хазяїн впливають середовищем в живому стані, то важливо, щоб використовувалися певні мікроорганізми-хазяїни. Вибирають мікроорганізми-хазяїни, про яких відомо, що вони проживають в «фітосфері» (філоплані, філосфері, ризосфері і/або ризоплані) однієї або більше цікавлячих культур. Дані мікроорганізми вибирають таким чином, щоб вони були здатні успішно конкурувати в певному навколишньому середовищі (культура і інші комахи-жителі) з мікроорганізмами дикого типу для забезпечення стабільної підтримки і експресії гена, що експресує поліпептид-пестицид, і бажано, забезпечення підвищеного захисту пестициду від деградації і інактивації в навколишньому середовищі. Відома велика кількість мікроорганізмів, які проживають в філоплані (на поверхні листя рослин) і/або ризосфері (в ґрунті, що оточує коріння рослин) широкого ряду важливих сільськогосподарських культур. Такі мікроорганізми включають бактерії, водорості і гриби. Особливий інтерес представляють мікроорганізми, такі як бактерії, наприклад, родів 6 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophillius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azobacter, Leuconostoc і Alacaligenes; гриби, зокрема, дріжджі, наприклад, родів Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula і Aureobasidium. Особливий інтерес представляють такі види бактерій, які проживають в фітосфері, як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroids, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus і Azotobacter vinlandii, і види дріжджів фітосфери, такі як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, С. diffluens, С. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae і Aureobasidium pollulans. Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми. Є велика кількість способів інтродукції Bt-гена, що кодує токсин, в мікроорганізм-хазяїн в умовах, які забезпечують стабільне збереження і експресію гена. Ці способи добре відомі фахівцям в даній галузі і описані, наприклад, в патенті США № 5135867, який включений в даний документ для зведення. Обробка клітин. Bacillus thuringiensis або рекомбінантні клітини, експресуючі Bt-токсини, можна обробити для пролонгування активності токсинів і стабілізації клітини. Пестицидна мікрокапсула, яка утвориться, містить Bt-токсин або Bt-токсини в клітинній структурі, яка стабілізована і буде захищати токсин, коли мікрокапсула піддається впливу навколишнього середовища шкідника-мішені. Відповідні клітини-хазяї можуть включати прокаріоти або еукаріоти, і звичайно обмежуються клітинами, які не продукують речовин, токсичних для вищих організмів, таких як ссавці. Однак можна використати мікроорганізми, які продукують речовини, токсичні для вищих організмів, в тому випадку, коли токсичні речовини є нестабільними, або їх вміст є досить низьким для того, щоб уникнути вияву будь-якої можливої токсичності для ссавця-хазяїна. Як хазяї особливий інтерес представляють прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби. При обробці звичайно клітини повинні бути інтактними і в основному знаходитися в проліферативній формі, краще не в формі спор, хоча, в деяких випадках можна використати спори. Обробку клітини мікроорганізму, наприклад, мікроорганізму, що містить ген або гени Btтоксину, можна провести хімічним або фізичним методами, або комбінацією хімічного і/або фізичного методів, за умови, що метод не впливає негативним чином на властивості токсину і не знижує здатності клітин захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галогеновані сполуки, зокрема, галогенвмісні сполуки з 17-80 атомами. Конкретніше, можна використати йод в м'яких умовах і протягом достатнього періоду часу для досягнення бажаних результатів. Інші відповідні способи включають обробку альдегідами, такими як глутаральдегід; протиінфекційними препаратами, такими як зефіран хлорид і цетилпіридиній хлорид; спиртами, такими як ізопропіловий і етиловий спирт; різними гістологічними фіксаторами, такими як йодний розчин Люголя, фіксатор Буена, різні кислоти і фіксатор Хеллі (дивись Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967) або обробку комбінацією фізичного (нагрівання) і хімічного агентів, які зберігають і пролонгують активність токсину, продукованого в клітині, коли клітину вводять в середовище хазяїна. Прикладами фізичних методів є короткохвильове опромінення, таке як гамма-опромінення, і рентгенівське опромінення, УФ-опромінення, ліофілізація і тому подібне. Способи обробки клітин мікроорганізмів розкриті в патентах США № 4695455 і 4695462, які включені в даний документ для зведення. Як правило, клітини мають підвищену стабільність структури, яка підвищує стійкість до впливу умов навколишнього середовища. У тих випадках, коли пестицид знаходиться в проформі, то метод обробки клітин потрібно вибрати таким чином, щоб не інгібувати процесинг проформи в зрілу форму пестициду під дією патогену шкідника-мішені. Наприклад, формальдегід буде поперечно зшивати білки і може інгібувати процесинг проформи поліпептиду-пестициду. Спосіб обробки повинен зберігати, щонайменше, значну частину біологічної доступності або біологічної активності токсину. Характеристики, що представляють особливий інтерес при виборі клітини-хазяїна для цілей продукції, включають простоту введення Bt-гена або Bt-генів хазяїну, доступність експресійних систем, ефективність експресії, стабільність пестициду в хазяїні і наявність додаткових генетичних властивостей. Характеристики, що представляють особливий інтерес для застосування як мікрокапсули пестициду, включають захисні властивості для пестициду, такі як товщина клітинних стінок, пігментація і внутрішньоклітинна упаковка або утворення тілець включення; виживаність у водному середовищі; відсутність токсичності для ссавців; 7 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 привабливість для захоплення шкідниками; простота в індукції загибелі і фіксації без пошкодження токсину і тому подібне. Інші чинники включають простоту формуляції і поводження, економічні міркування, стабільність при зберіганні і тому подібне. Ріст клітин. Клітина-хазяїн, що містить інсектицидний Bt-ген або Bt-гени, можна культивувати в будь-якому звичайному поживному середовищі, в якому ДНК-конструкція забезпечує виборчу перевагу, забезпечуючи селективне середовище, в якому по суті всі або всі клітини зберігають Bt-ген. Потім можна зібрати такі клітини з використанням звичайних методів. Альтернативно клітини можна обробити до збирання. Bt-клітини, продукуючі токсини за винаходом, можна культивувати з використанням звичайних в даній галузі середовищ і методів ферментації. Після здійснення циклу ферментації бактерії можна зібрати першим відділенням спор і кристалів Bt з культурального бульйону способами, відомими в даній галузі. Виділені спори і кристали Bt можна формулювати у вигляді змочуваного порошку, рідкого концентрату, гранул і інших препаративних форм з додаванням поверхнево-активних речовин, диспергаторів, інертних носіїв і інших компонентів для полегшення поводження з ними і їх застосування проти конкретних шкідників-мішеней. Такі препаративні форми і способи застосування відомі в даній галузі. Препаративні форми. Формульовані гранули-приманки, що містять атрактант і спори, кристали і токсини Bt-ізолятів, або рекомбінантні мікроорганізми, що містять гени, отримані з Btізолятів, розкритих в даному документі, можна вносити в ґрунт. Формульований продукт також можна застосовувати у вигляді покриття насінин або агента для обробки коріння, загальної обробки рослин на більш пізніх стадіях вегетаційного періоду. Для обробки рослин і ґрунту Btклітинами можна використати змочувані порошки, гранули або дусти, які отримують змішуванням з різними інертними речовинами, такими як неорганічні мінеральні речовини (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати і тому подібне) або матеріали рослинного походження (такі як подрібнена серцевина кукурудзяного качана, рисове лушпиння, шкаралупа горіхів і тому подібне). Препаративні форми можуть включати ад’юванти прилипали, стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або поверхнево-активні речовини. Рідкі препаративні форми можуть бути на водній або неводній основі, і їх можна застосовувати у вигляді пін, гелів, суспензій, емульгованих концентратів або тому подібного. Інгредієнти можуть включати реологічну добавку, поверхнево-активні речовини, диспергатори або полімери. Фахівцям в даній галузі, очевидно зрозуміло, що концентрація пестициду буде варіювати в широких межах в залежності від природи конкретної формуляції, зокрема, чи є вона концентратом або призначена для безпосереднього застосування. Пестицид буде знаходитися в концентрації, що становить, щонайменше, 1% мас., або концентрація може дорівнювати 100% мас. Сухі препаративні форми будуть містити приблизно 1-95% мас. пестициду, в той час як рідкі препаративні форми звичайно будуть містити приблизно 1-60% мас. твердих частинок в 2 рідкій фазі. У препаративних формах звичайно буде знаходитися приблизно від 10 до 4 приблизно 10 клітин/мг. Такі препаративні форми будуть застосовуватися в кількостях приблизно від 50 мг (рідина або суха речовина) до 1 кг або більше на га. Препаративні форми можна застосовувати в середовищі мешкання лускокрилого шкідника, наприклад, на листя або в грунт, обприскуванням, запиленням, поливом або тому подібне. Трансформація рослин. Переважний рекомбінантний хазяїн для продукції інсектицидних білків за даним винаходом являє собою трансформовану рослину. Гени, що кодують Bt-білки токсини, розкриті в даному документі, можна вставити в рослинні клітини з використанням різних способів, добре відомих в даній галузі. Наприклад, є велика кількість клонуючих векторів, що містять реплікаційну систему Escherichia coli, і маркер, який дозволяє відібрати трансформовані клітини для проведення інсерції чужорідних генів у вищі рослини. Вектори включають, серед іншого, наприклад, pBR322, серії pUC, серії M13mp, pACYC184. Отже, фрагмент ДНК, що містить послідовність, що кодує Bt-білок токсин, можна вставити у вектор у відповідному сайті рестрикції. Отриману плазміду використовують для трансформації Е. coli. Клітини E. coli культивують у відповідному поживному середовищі, потім збирають і лізують. Плазміду виділяють. Як правило, проводять аналіз послідовності, рестрикційний аналіз, електрофорез і використовують інші біохімічні-молекулярні біологічні методи як методи аналізу. Після кожної маніпуляції ДНК-послідовність, що використовується, можна розщепнути і приєднати до наступної ДНК-послідовності. Кожну послідовність плазміди можна клонувати в одну і ту ж або різні плазміди. Залежно від способу вставки бажаних генів в рослину, можуть бути необхідні інші ДНК-послідовності. Наприклад, якщо для трансформації рослинної клітини використовують Ti- або Ri-плазміду, то щонайменше правий кордон, але часто правий і лівий кордон Т-ДНК Ti- або Ri-плазміди, потрібно з'єднати у вигляді фланкуючої області генів, призначених для вставки. Застосування Т-ДНК для трансформації рослинних клітин інтенсивно 8 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 досліджувалося і в достатній мірі описано в Європейському патенті 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al. (1986) і An et al. (1985), і добре відомо в даній галузі. Після інтеграції вставленої ДНК в геном рослини вона є відносно стабільної. Звичайно вектор для трансформації містить селектований маркер, який додає трансформованим рослинним клітинам резистентність, серед іншого, до біоциду або антибіотику, такому як біалафос, канаміцин, G418, блеоміцин або гігроміцин. Маркер, що використовується індивідуально, отже, дозволить відібрати трансформовані клітини краще, ніж клітини, які не містять вставлену ДНК. Є велика кількість методів для інсерції ДНК в рослинну клітину-хазяїна. Такі методи включають трансформацію Т-ДНК з використанням Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як трансформуючий агент, злиття, ін'єкцію, біологічну балістику (бомбардування мікрочастинками) або електропорацію, а також інші можливі методи. Якщо для трансформації використовують Agrobacteria, то ДНК, призначену для вставки, клонують в спеціальні плазміди, а саме в проміжний вектор або бінарний вектор. Проміжні вектори можна інтегрувати в Ti- або Ri-плазміду гомологічною рекомбінацією завдяки послідовностям, які є гомологічними до послідовностей Т-ДНК. Ti- або Ri-плазміда також містить vir-область, необхідну для перенесення Т-ДНК. Проміжні вектори не можуть реплікуватися самостійно в Agrobacteria. Проміжний вектор можна перенести в Agrobacterium tumefaciens за допомогою плазмідихелпера (кон’югацією). Бінарні вектори можуть реплікуватися в Е. coli і Agrobacteria. Вони включають селективний ген-маркер і лінкер або полілінкер, який вставлений в рамку правої і лівої приграничних областей Т-ДНК. Їх можна безпосередньо трансформувати в Agrobacteria (Holsters et al., 1978). При використанні як клітини-хазяїна Agrobacterium повинні містити плазміду, що несе vir-область. Vir-область необхідна для перенесення Т-ДНК в рослинну клітину. Можуть міститися додаткові Т-ДНК. Трансформовану таким чином бактерію використовують для трансформації рослинних клітин. Експланти рослин переважно можна культивувати з Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes для перенесення ДНК в рослинну клітину. Потім можна регенерувати цілі рослини з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, шматочків листа, сегментів стеблини, коріння, а також протопластів або культивованих в суспензії клітин) у відповідному середовищі, яке може містити антибіотики або біоциди за винаходом. Потім отримані таким чином рослини можна тестувати на присутність вставленої ДНК. Відсутні особливі вимоги у відношенні плазмід у випадку методів ін'єкції і електропорації. Можна використати звичайні плазміди, наприклад, такі як похідні pUC. Трансформовані клітини розвиваються в рослинах звичайним шляхом. Вони можуть утворити зародкові клітини і передати трансформовану ознаку(и) потомству рослин. Такі рослини можна вирощувати звичайним шляхом і схрещувати з рослинами, які мають ті ж трансформовані спадкові фактори або інші спадкові фактори. Отримані гібриди мають відповідні фенотипічні властивості. У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини потрібно трансформувати генами, в яких кодон переважно оптимізований для застосування в рослинах. Дивись, наприклад, патент США № 5380831, який включений в даний документ для зведення. Незважаючи на те, що в даному документі як приклад приводяться зрізані токсини, добре відомо в галузі Bt-токсинів, що токсини масою 130 kDa (повна довжина) мають N-кінцевий фрагмент, який є істинним токсином, і С-кінцевий фрагмент є «хвостом» протоксину. Таким чином, відповідні «хвости» можна використати із зрізаними/істинними токсинами за даним винаходом. Дивись, наприклад, патент США № 6218188 і патент США № 6673990. Крім того, в даній галузі відомі способи отримання синтетичних Bt-генів для застосування в рослинах (Stewart and Burgin, 2007). Одним необмежувальним прикладом переважної трансформованої рослини є фертильна рослина кукурудзи, що містить експресований в рослині ген, що кодує білок Cry1Ab, і додатково містить другий експресований в рослині ген, що кодує білок Cry1Be. Перенесення (або інтрогресію) ознаки(ознак), що визначається Cry1Ab і Cry1Be, в інбредні лінії кукурудзи можна здійснити рекурентною селекцією, наприклад, зворотним схрещуванням. У цьому випадку необхідну рекурентну батьківську форму спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентною батьківською формою), який несе відповідний ген(и) для ознак, що визначаються Cry1Ab і Cry1Be. Потомство даного гібрида потім зворотно схрещують з рекурентною батьківською формою з подальшою селекцією отриманого потомства на необхідну ознаку(ознаки), яка призначена для перенесення від нерекурентної батьківської форми. Після трьох, переважно, чотирьох, більш переважно п'яти і більше поколінь зворотних гібридів з рекурентною батьківською формою з селекцією на необхідну ознаку(и), потомство буде гетерозиготним відносно локусів, контролюючих ознаку(и), яка переноситься, але буде таким же як рекурентна батьківська форма відносно більшості або майже всіх інших генів (дивись, 9 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, Poehlman&Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376). Стратегії керування резистентністю комах (IRM). Наприклад, Roush et al. описують стратегії, основані на двох токсинах, так зване «нагромадження» або «стекінг» для контролю інсектицидних трансгенних культур (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. В. (1998) 353, 1777-1786). На веб-сайті Агентства по захисту навколишнього середовища США (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) приводяться наступні вимоги для забезпечення нетрансгенних (тобто не-Bt) сховищ (розділ не-Bt культури/кукурудзи) для застосування з трансгенними культурами, продукуючими один Bt-білок, активний проти шкідників-мішеней. «Специфічними структурованими вимогами для Bt-захищеної (Cry1Ab і Cry1Fa) кукурудзи від кукурудзяного стеблового метелика продукти є наступними: структуровані сховища: 20% сховищ не-лускокрилих з Bt-кукурудзою в Кукурудзяному поясі; 50% сховищ не-лускокрилих з Bt-кукурудзою в кукурудзяному поясі Блоки 1. Внутрішній (тобто в Bt-поле) 2. Зовнішній (тобто окремі поля в межах 1/2 милі (1/4 милі, якщо можливо) від Bt-поля для максимального довільного схрещування) Смуги в поле Смуги повинні мати ширину щонайменше 4 ряди (переважно 6 рядів) для зниження ефектів, зв'язаних з пересуванням личинок». Крім того, Національна Асоціація виробників кукурудзи на їх веб-сайті (ncga.com/insectresistance-management-fact-sheet-bt-corn) також приводить аналогічні вказівки у відношенні вимог для сховищ. Наприклад: «Вимоги відносно IRM кукурудзяного стеблового метелика: засадити, щонайменше, 20% територій з кукурудзою гібридами сховища; у районах з виробництвом бавовни сховище повинно складати 50%; повинні висаджуватися в межах 1/2 милі від гібридів сховища; сховище можна засівати у вигляді смуг у Bt-поле; смуги сховища повинні бути шириною щонайменше 4 ряди сховище можна обробити звичайними пестицидами тільки, якщо досягаються економічні пороги для шкідника-мішені; не можна використовувати інсектициди, що обприскуються, на основі Bt на кукурудзі сховища; відповідне сховище повинно бути засаджено у кожному господарстві з Bt-кукурудзою». Як стверджує Roush et al. (на сторінках 1780 і 1784 правого стовпчика, наприклад), «стекінг» або «накопичення» двох різних білків, де кожний ефективний проти шкідників-мішеней і з низькою або відсутністю перехресної резистентності, дозволяє використовувати менше сховище. Roush пропонує, що при наявності успішного стека розмір сховища менше 10% може забезпечити порівнянне з приблизно 50% сховищем керування резистентністю для однієї (непірамідної) ознаки. Для наявних у даний час пірамідованих продуктів Bt-кукурудзи Агентство по охороні навколишнього середовища вимагає наявності значно меншого (у загальному 5%) структурованого сховища для засівання не-Bt-кукурудзою в порівнянні з продуктами з однією ознакою (у загальному 20%). Маються різні шляхи забезпечення ефектів IRM сховища, включаючи різні геометричні патерни висадження в полях (згадані вище) і суміші насінин у мішках, як додатково обговорюється Roush et al. (вище) і в патенті США № 6551962. Усі наведені вище або аналогічні співвідношення сховищ можна використовувати для даних подвійних або потрійних стеків або пірамід. Для потрійних стеків із трьома сайтами дії проти однієї шкідника-мішені метою буде нульове сховище (або, наприклад, менше ніж 5% сховище). Це особливо вірно для виробничих земель, наприклад, площею більше 10 акрів. Усі патенти, заявки на патент, попередні заявки і публікації, що стосуються або цитовані в даному документі, у повному обсязі включені в даний документ для зведення в тій мірі, до якої вони не суперечать положенням даної заявки. Якщо не зазначено або не мається на увазі інше, то в тому сенсі, в якому в даному документі використовуються терміни в однині, вони означають, «щонайменше один». Наступні приклади ілюструють способи здійснення винаходу. Приклади не слід розглядати як такі, що обмежують винахід. Усі відсотки виражені в % мас., і всі співвідношення сумішей розчинників виражені в об'ємних співвідношеннях, якщо не зазначено інакше. Усі значення 10 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 температури виражені в градусах Цельсію. ПРИКЛАДИ 125 Приклад 1 - Мічення I Cry-білків Йодування Cry-токсинів. Очищені зрізані Cry-токсини йодували з використанням йодогранул або йодогену (Pierce). Коротко, дві йодогранули двічі промивали 500 мкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину PBS (20 мМ фосфату натрію, 0,15М NaCl, рН 7,5) і вміщували в центрифугальну пробірку ємністю 1,5 мл за свинцевим екраном. До цього додавали 100 мкл PBS. У витяжній шафі і з використанням необхідних прийомів роботи з радіоактивними 125 речовинами 0,5 мКюрі Na I (17,4 кюрі/мг, серія 0114, Amersham) додавали до розчину йодогранул у PBS. Компоненти піддавали взаємодії протягом 5 хв. при кімнатній температурі, потім до розчину додавали 2-25 мкг високоочищеного зрізаного Cry-білка і піддавали взаємодії ще протягом 3-5 хв. Реакцію зупиняли видаленням розчину з йодогранулами і реакційну суміш наносили на спін-колонку Zeba ємністю 0,5 мл для знесолення (InVitrogen), урівноважену PBS. Йодогранули двічі промивали щоразу по 10 мкл PBS і промивний розчин також наносили на колонку для знесолення. Радіоактивний розчин елюювали через колонку для знесолення центрифугуванням при 1000×g протягом 2 хв. У випадку Cry1Da для введення радіоактивної мітки використовували метод з йодогеном. При використанні даного методу Cry-токсин у 100 мМ фосфатному буфері (рН 8) спочатку очищали від полісахаридів (LPS) пропущенням кілька разів через невелику колонку з поліміксином ємністю 0,5 мл. У пробірку з йодогеном (Pierce 125 Chem., Co) додавали 20 мкг LPS-невмісного Cry1Da-токсину, потім 0,5 мКюрі Na I. Реакційну суміш струшували протягом 15 хв. при 25°С. Розчин видаляли з пробірки і додавали 0,2М нерадіоактивного Na для гасіння реакції. Білок діалізували проти PBS із 3 змінами буфера для 125 видалення незв'язаного I. Радіоактивну чистоту йодованих Cry-білків визначали електрофорезом SDS-PAGE, візуалізували з використанням фосфорного екрана й аналізували на гамма-лічильнику. Коротко, 2 мкл радіоактивного білка розділяли SDS-PAGE. Після поділу гелі висушували з використанням апарата для висушування гелів BioRad, за інструкціями виробника. Висушені гелі візуалізували, загорнувши їх у плівку Mylar (товщиною 12 мкм) і експонували на багаторазових фосфорних екранах Dynamics (35×43 см.) протягом 1 год. Пластинки візуалізували з використанням приладу Molecular Dynamics Storm 820 phosphoroimager і візуалізовані зображення аналізували з використанням програмного забезпечення TM ImageQuant . Радіоактивну смугу разом із зонами безпосередньо вище і нижче смуги вирізували з гелю з використанням леза для бритви і визначали радіоактивність на гаммалічильнику. Радіоактивність виявляли тільки в смузі Cry-білка й у зонах нижче смуги. Радіоактивність не детектували вище смуги, указуючи на те, що всі радіоактивні домішки складалися з більш дрібних білкових компонентів у порівнянні з Cry-білком. Можливо, дані компоненти являли собою продукти деградації. Приклад 2 - Протокол готування BBMV Одержання і фракціонування солюбілізованих BBMV. Личинки останньої стадії розвитку Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis або Heleothis zea витримували без корму протягом ночі і потім зранку подрібнювали після охолодження на льоді протягом 15 хв. Витягали тканину середньої кишки з порожнини тіла, залишаючи задню кишку, приєднану до інтегументу. Середню кишку поміщали в 9× об’єм охолодженого на льоді буфера для гомогенізації (300 мМ маніту, 5 мМ ЕГТА, 17 мМ Тріс основи, рН 7,5) з додаванням суміші інгібіторів протеаз (кінцева концентрація компонентів суміші (у мкМ) складає AEBSF (500), EDTA (250 мМ), бестатин (32), Е64 (0,35), лейпептин (0,25) і апротинін (0,075) (Sigma P-2714), розведеної відповідно до рекомендацій виробника. Тканину гомогенізували 15 ходами скляного гомогенізатора для тканин. BBMV готували осадженням за допомогою MgCl2 по методу Wolfersberger (1993). Коротко, рівний об’єм 24 мМ розчину MgCl2 у 300 мМ розчині маніту змішували з гомогенатом середньої кишки, перемішували протягом 5 хв. і витримували на льоді протягом 15 хв. Розчин центрифугували при 2500×g протягом 15 хв. при 4°С. Супернатант залишали й осад суспендували у вихідному об’ємі 0,5× розведеного буфера для гомогенізації і знову центрифугували. Два супернатанти поєднували, центрифугували при 27000×g протягом 30 хв. при 4°С з одержанням фракції BBMV. Осад суспендували в 10 мл буферу для гомогенізації і додавали інгібітори протеаз і знову центрифугували при 27000×g протягом 30 хв. при 4°С для відмивання BBMV. Отриманий осад суспендували в буфері для збереження BBMV (10 мМ HEPES, 130 мМ KCl, 10% гліцерину, рН 7,4) до концентрації приблизно 3 мг/мл білка. Концентрацію білка визначали з використанням методу Бредфорда (1976) з бичачим сироватковим альбуміном (BSA) як стандарт. Визначення активності лужної фосфатази проводили до заморожування проб з використанням методу Sigma, згідно з інструкціями 11 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виробника. Специфічна активність даного ферменту-маркера у фракції BBMV, як правило, була в 7 разів вище в порівнянні з фракцією гомогенату середньої кишки. BBMV розливали на аліквотні порції по 250 мкл, швидко заморожували в рідкому N2 і зберігали при -80°С. 125 Приклад 3 - Спосіб оцінки зв'язування I-мічених Cry-білків з білками BBMV 125 Зв'язування I-мічених Cry-білків з білками BBMV. Для визначення оптимальної кількості 125 білка BBMV у тестах по оцінці зв'язування будували криву насичення. I-мічений Cry-білок (0,5 нМ) інкубували протягом 1 год. при 28°С з різними кількостями білка BBMV у межах 0-500 мкг/мл у буфері для зв'язування (8 мМ NaHPO 4, 2 мМ KH2PO4, 150 мМ NaCl, 0,1% бичачого 125 сироваткового альбуміну, рН 7,4). Загальний об’єм складав 0,5 мл. Зв'язаний з I Cry-білок відокремлювали від незв'язаного білка добором 150 мкл реакційної суміші в трьох паралелях з центрифугальної пробірки ємністю 1,5 мл у центрифугальну пробірку ємністю 500 мкл і центрифугуванням проб при 14000×g протягом 6 хв. при кімнатній температурі. Супернатант обережно видаляли й осад обережно промивали три рази буфером для зв'язування, охолодженим на льоді. Дно центрифугальної пробірки, що містить осад, відрізали і поміщали в скляну культуральну пробірку розміром 13×75 мм. Визначали радіоактивність проб протягом 5 хв. на гамма-лічильнику. Зі значення радіоактивності проби віднімали фонову радіоактивність (у даному випадку реакцію проводили з будь-яким білком) і будували графік залежності від концентрації білка BBMV. Оптимальна кількість білка, що використовували, склала 0,15 мг/мл білка BBMV. Для визначення кінетики зв'язування будували криву насичення. Коротко, BBMV (150 мкг/мл) 125 інкубували протягом 1 год. при 28°С зі зростаючими концентраціями I-міченого Cry-токсину в межах від 0,01 до 10 нМ. Загальне зв'язування визначали добором аліквотних порцій 150 мкл кожної концентрації в трьох паралелях, центрифугуванням проби і визначенням радіоактивності, як описано вище. Аналогічним чином визначали неспецифічне зв'язування з додаванням до реакційної суміші 1000 нМ гомологічного трипсинізованого нерадіоактивного Cry-токсину для насичення всіх неспецифічних сайтів зв'язування рецептора. Специфічне зв'язування розраховували, як різницю між загальним зв'язуванням і неспецифічним зв'язуванням. Тести гомологічного і гетерологічного конкурентного зв'язування проводили з використанням 125 150 мкг/мл білка BBMV і 0,5 нМ I-міченого Cry-білка. Концентрація конкурентного неміченого Cry-токсину, доданого в реакційну суміш, знаходилася в межах від 0,045 до 1000 нМ і його додавали одночасно з радіоактивним лігандом для гарантії реального конкурентного 125 зв'язування. Інкубацію проводили протягом 1 год. при 28°С і визначали кількість I-міченого Cry-білка, зв'язаного з рецептором токсину, як описано вище, з вирахуванням неспецифічного зв'язування. При повній відсутності ліганду-конкурента детектували 100% загальне зв'язування. За результатами аналізу будували напівлогарифмічний графік залежності загального специфічного зв'язування у відсотках від концентрації доданого конкурентного ліганду. Приклад 4 - Резюме за результатами 125 На Фіг. 1 показане специфічне зв'язування у відсотках I Cry1Ab (0,5 нМ) у BBMV з ECB з конкуренцією неміченим гомологічним Cry1Ab () і гетерологічним Cry1Be (). Крива витиснення для гомологічної конкуренції з Cry1Ab представляє сигмоїдальну за формою криву, що показує 50% витиснення радіоактивного ліганду приблизно при 0,5 нМ Cry1Ab. Cry1Be також витісняє 125 I Cry1Be із сайту зв'язування, але для цього потрібна концентрація приблизно 40 нМ (у 80 125 разів вище в порівнянні з необхідною концентрацією Cry1Ab) для витиснення 50% I Cry1Ab із сайту зв'язування. 125 На Фіг. 2 показане специфічне зв'язування у відсотках I Cry1Ab (0,5 нМ) у BBMV з FAW з конкуренцією неміченим гомологічним Cry1Ab () і гетерологічним Cry1Be (). Крива витиснення для гомологічної конкуренції з Cry1Ab представляє сигмоїдальну за формою криву, що показує 125 50% витиснення радіоактивного ліганду приблизно при 0,3 нМ Cry1Ab. Cry1Be витісняє I Cry1Ab із сайту зв'язування на 50% у концентрації приблизно 300 нМ або приблизно в 1000 разів вище в порівнянні з необхідною концентрацією для Cry1Ab. Помилки у вигляді рисок представляють межі значень, отриманих за даними подвійних рівнобіжних визначень. 125 На Фіг. 3 показане специфічне зв'язування у відсотках I Cry1Be (0,5 нМ) у BBMV з FAW з конкуренцією неміченим гомологічним Cry1Be () і гетерологічним Cry1Ab (). Крива витиснення для гомологічної конкуренції з Cry1Be представляє сигмоїдальну за формою криву, що показує 50% витиснення радіоактивного ліганду приблизно при 2 нМ Cry1Be. Cry1Ab у концентрації 1000 125 нМ (у 2000 разів вище в порівнянні з витиснутим I Cry1Be) приводить приблизно до 50% витисненню. Мається приблизно в 500 разів нижча афінність Cry1Ab у конкуренції за зв'язування Cry1Be. Помилки у вигляді рисок представляють межі значень, отриманих за даними трьох рівнобіжних визначень. 12 UA 111935 C2 5 10 15 20 25 30 Джерела літератури Heckel, D.G., Gahan, L.J., Baxter, S.W., Zhao, J.Z., Shelton, A.M., Gould, F., and Tabashnik. B.E. (2007). The diversity of Bt resistance genes in species of Lepidoptera. J Invertebr Pathol 95, 192-197. Luo, K., Banks, D., and Adang, M.J. (1999). Toxicity, binding, and permeability analyses of four bacillus thuringiensis cryl delta-endotoxins using brush border membrane vesicles of spodoptera exigua and spodoptera frugiperda. Appl. Environ. Microbiol. 65, 457-464. Palmer, M, Buchkremer, M, Valeva, A, and Bhakdi, S. Cysteine-specific radioiodination of proteins with fluorescein maleimide. Analytical Biochemistry 253, 175-179. 1997. Ref Type: Journal (Full) Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory). Schlenz, M. L., Babcock, J. M., and Storer, N. P. Response of Cry1F-resistant and Susceptible European Corn Borer and Fall Armyworm Colonies to Cry1A.105 and Cry12Ab2. DAI 0830, 2008. Indianapolis, Dow AgroSciences. Derbi Report. Sheets, J.J. and Storer, N.P. Analysis of Cry1Ac Binding to Proteins in Brush Border Membrane Vesicles of Corn Earworm Larvae (Heleothis zed). Interactions with Cry1F Proteins and Its Implication for Resistance in the Field. DAI-0417, 1-26. 2001. Indianapolis, Dow AgroSciences. Tabashnik, B.E., Liu, Y.B., Finson. N., Masson, L., and Heckel, D.G. (1997). One gene in diamondback moth confers resistance to four Bacillus thuringiensis toxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 1640-1644. Tabashnik, B.E., Malvar, T., Liu, Y.B., Finson. N., Borthakur, D., Shin, B.S., Park, S.H., Masson. L., de Maagd, R.A., and Bosch, D. (1996). Cross-resistance of the diamondback moth indicates altered interactions with domain II of Bacillus thuringiensis toxins. Appl. Environ. Microbiol. 62, 28392844. Tabashnik, B.E., Roush, R.T., Earle, E.D., and Shelton, A.M. (2000). Resistance to Bt toxins. Science 287, 42. Wolfersberger, M.G. (1993). Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the gypsy moth (Lymantria dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol 24, 139-147. Xu, X., Yu, L., and Wu, Y. (2005). Disruption of acadherin gene associated with resistance to Cry 1 Ac {delta}-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armigera. Appl Environ Microbiol 71, 948-954. 13 UA 111935 C2 14 UA 111935 C2 15 UA 111935 C2 16 UA 111935 C2 17 UA 111935 C2 18 UA 111935 C2 19 UA 111935 C2 20 UA 111935 C2 21 UA 111935 C2 22 UA 111935 C2 23 UA 111935 C2 24 UA 111935 C2 25 UA 111935 C2 26 UA 111935 C2 27 UA 111935 C2 28