Виділена молекула нуклеїнової кислоти (варіанти), химерний рослинний ген (варіанти), трансформуючий рослину вектор (варіанти), рослинна клітина (варіанти), спосіб одержання рослини, що проявляє стійкість до гер

1 Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая регуляторный элемент гена гелиантинина, где указанный регуляторный элемент управляет семя-специфичной генной экспрессией в растении и включает нукдеотиды 2304-2401 SEQ IDNO 1 CCTGGCA. TAACCTCTTA GbTGTCACTT CCTCCTTGAT CTTCTTCCAC TATAAAACCA GCTAGTTCAC AACACCTATT CACCACATCA CRTCCCATTC С 2 Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая регуляторный элемент гена гелиантинина, где указанный регуляторный элемент управляет корень-специфичной генной экспрессией в растении и включает нуклеотиды 851-1639 или 1-1639 SEQ ID NO 1 GGATCCTCTA ССТАТАТАТА TATATATAtFA TGAATTTTTT АААААААТСС CGTACCCCTC GAAAAAACGG GCCTTATGCG GAAGTCCTCC TCGCACACCT AAAGAGCCGC CCATGCTTTT TAATCAAATA GATGTGCATC ATGTAGTGAT AGTTTTTACT ААААТССАТТ AGTTTATAAA ТАТТХТАААТ GTTTTTTTTT GTTTATATAA AAAAAGAAAA ТТААААААСА AAATGTCCAA AATACTCCTG ТАТСААСТАТ GCAAAAAGAC АААААААССС TTTTGGTTAA CAAAGTCTTT ААТТТААСТА AGTTTGTCAT TTGAAGGAAA ТТСАААСААА AACGAACGTG GGGGCGCGGG GGTGGGGTGT TTGGTTACAA AAAGTTTTAA TTTTAGATTA AAGTATAAAA ATTGCCCAAA CCTCAGGACA АТТТТТАСАТ ТТАТААСТСА TTGTCTAAAT АСТААААТАС ACCAAGTCAA TGGGTGAAAG ТТАСТАТСТТ TTTTATTGCA АГТТСАСАТТ АССТТАТТТА CTTTTGAGAA AGACGACATA ACAATTMGG AGTTATAGTC TGATCGGTTT GCGCTATTTT TCATACtTAA GGTCCAGGTT TGAATCTTTT AAACATTTTT TTTTAACTTG ATCATAACAA TATAACAATT AAGGAGTTAT GATCTGATGG TTTGCGTTAT GTTTTCGTAC TAATTAAGGT CCCGGTTTGA ATCTCTCAAA CAATATATTA TTTTTTCTTA AAAACGAATG AGACATGCTC ACAATGGGAA TTGAACCGAC ACCTATTGGT TTAAAATTAA AGCTATAACA AACTGAGCTA САСАТГТТТА ATTTAAAAAT GTCGACTATC TTAGTTAATC AAATAAATTT ATTTTGATTT GTTTTGTTAA TGTATTTTCT ССТААТТГАА AGTCGATGTG TATTTATATA ATATTAGTAA TATTTTATTA ACATCAATAC ATGCTTCAGG TTTTGTGTTA GTCTTCGTTT TTTATATGGT TTTATCAGTG GTGTGGTGTA CGATGACGAT TATTTAAATA ATGACGAACT TCTTGGTTGT TACTTATTGA q 44217 TGTACGAAGC TGAGATGTAA CGAACCGAAC ACATATAAAT AACATTTTGG ATAAGATTAC GACTTTATTT ATCGGTTGCC ATGAAATTTA GAAGATTTGG GTTAAGACAC AACCACATAT AATGTGATGG TAAATAGCAT TTACAACTAA TGTTAATCTT TTGTTACAAA TGTTGTTAAC TAGGCTTGAT ATGTAAAATT TTTAAAGACT ATCAGGTGTT CTTACGGTTT TACATCTAGT AAGAGATTAA AAAAAAAAAA GCAAGGAAAG TAAGTGTAAA GAGAGTAAAG AGAATGTAGC CATGATATGG CTGATTGTTC ATCACCATCC CATTTATACT TATCATCTTG ATGATGCATA TAGACATGAT GTGTGCTACG TACCGAATTX TAACAGCTTC CCGGCGCAAC ACACGTGTAT АААТЛССАТА GATTATAAAC CAAATACGCT ACGTATAGGT GGTTATATGA TACCTATGAT GACTTGACCT TTCGTTACAC TTGAGCTGAA AAAAATAAAA AAATGTGGCT ATAGGCGCAT Ь&ТСАСАвТГ ГГГГГ&Гв-Т 3 Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая регуляторный элемент гена гелиантинина, отличающаяся тем, что указанный регуляторный элемент управляет генной экспрессией в ответ на ABA в растении и включает нуклеотидную последовательность, выбранную из 1-2401 SEQ ID NO 1, 851-1639 SEQ ID NO 1, 1639-2303 SEQ ID NO 1 или 1-404 SEQ ID NO SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N O : 1 : GGATCCTCTA CCTATATATA TATATATATA TGAATTTTTT AAAAAAATCC CGTACCCCTC GAAAAAACGG GCCTTATGCG GAAGTCCTCC TCGCACACCT AAAGAGCCGC CCATGCTTTT TAATCAAATA GATGTGCATC ATGTAGTGAT AGTTTTTACT AAAATCCATT AGTTTATAAA TATTTTAAAT GTTTTXTITT GTTTATATAA AAAAAGAAAA TTAAAAAACA AAATGTCCAA AATACTCCTG TATCAACTAT GCAAAAAGAC AATTTAACTA AAAAAAACCC TTTTGGTTAA CAAAGTCTTT AGTTTGTCAT TTGAAGGAAA TTCAAACAAA GGTGGGGTGT TTGGTTACAA AAAGTTTTAA AACGAACGTG GGGGCGCGGG TTTTAGATTA AAGTATAAAA ATTGCCCAAA CCTCAGGACA ATTTTTACAT TTATAACTCA TTGTCTAAAT ACTAAAATAC ACCAAGTCAA TGGGXGAAAG TTACTATCTT TTTTATTGCA ATTTCACATT ACCTTATTTA CTTTTGAGAA AGACGACATA ACAATTAAGG AGTTATAGTC TGATCGGTTT GCGCTATTTT TCATACTTAA GGTCCAGGTT TGAATCTTTT AAACATTTTT TTTTAACTTG ATCATAACAA TATAACAATT AAGGAGTTAT GATCTGATGG TTTGCGTTAT GTTTTCGTAC TAATTAAGGT CCCGGTTTGA ATCTCTCAAA CAATATATTA TTTTTTCTTA AAAACGAATG AGACATGCTC ACAATGGGAA TTGAACCGAC ACCTATTGGT TTAAAATTAA AGCTATAACA AACTGAGCTA САСАТПТГА 5 44217 6 ATTTAAAAAT GTCGACTATC TTAGTTAATC AAATAAATTT ATTTTGATTT GTTTTGTTAA TGTATTTTCT CCTAATTTAA AGTCGATGTG TATTTATATA ATATTAGTAA тАТТТТАТТА ACATCAATAC ATGCTTCAGG TTTTGTGTTA G X C T T C G T T T 'ПТАТАТССТ TTTATCAGTG GTGTGGTGTA CGATGACGAT TATTTAAATA ATGACGAACT TCTTGGTTGT TACTTATTGA TGTACGAAGC TGAGATGTAA CGAACCGAAC ACATATAAAT AACATFTTGG ATAAGATTAC GACTTTATTT ATCGGTTGCC ATGAAATTTA GAAGATTTGG GTTAAGACAC AACCACATAT AATGTGATGG TAAATAGCAT TTACAACTAA TGTTAATCTT TTGTTACAAA TGTTGTTAAC TAGGCTTGAT ATGTAAAATT TTTAAAGACT ATCAGGTGTT CTTACGGTTT TACATCTAGT AAGAGATTAA AAAAAAAAAA GCAAGGAAAG TAAGTGTAAA GAGAGTAAAG AGAATGTAGC CATGATATGG CTGATTGTTC ATCACCATCC CATTTATACT TATCATCTTG ATGATGCATA TAGACATGAT GTGTGCTACG TACCGAATTT TAACAGCTTC CCGGCGCAAC ACACGTGTAT AAATACCATA GATTATAAAC CAAATACGCT ACGTATAGGT GGTTATATGA TACCTATGAT GACTTGACCT TTCGTTACAC TXGAGCTGAA AAAAATAAAA AAATGTGGCT ATAGGCGCAT eGTCACAGTT TTrTTGTGTG GCCATATACA ATTTTTGACG TAGCGTTAGT TAATCAGATA AATTTATTTT GATTTGTTTT GTTAATGTAT TTTCTCCTAA TTTCAAGTAG ACGTGTATTT ATATAATATT AGTAATATTT TATTAACATC AATACATGCT TCATGTTTTG GGTTAGTCTT CGTTTTTTAT ATGGTTTTAT CAGTGGTGTA CGATGACGAT TATTTAAATA ATGACGGACT TCTTGGTTGT TACTTATTGA TGTACGAAGC TGAGATGTAA CGAACCGAAC ACATATAAAT AACATTTXGG ATAAGATTAC GACTTTATTT ATCGGTTGCC ATGAAATTTG GAAGACTTGG GTTAAGACAC AACCACATAT AATGTGATGG TAAATAGCAT TTACAACTAA TGTTAATCTT TTGTTACAAA TGTTGTTAAC TAGGCTTGAT ATGTAAAATT TTTAAAGACT ATATGGTGTT CTTACGGTTT TACATCTAGT AAGAGATTAA AAAAAAAAAA AAAAGCAAGG AAAGTAAGTG TAAAGAGAGT AAAGAGAATG TAGCCATGAT ATGGCTGATT GTTCATCACC ATCCCATTTA TACTTATCAT CTTGATGATG CATATAGACA AACACACTAC TTATACAGAT GTAGCATGTC TCAGCTCCAA ATGGTGATCT TCTCCTGGCA TAACCTCTTA GATGTCACTT CCTCCTTGAT CTTCTTCCAC TATAAAACCA GCTAGTTCAC AACACCTATT CACCACATCA CATCCCATTC С последовательность £Еф ID № 3: GTCGACTATC TTAGTTAATC AAATAAATTT ATTTTGATTT GTTrTGTTAA TGTATTTT CCTAGTTTAA AGTCGATGTG TATTTATATX ь ^ ь -™ ГЛАТАТ* АТЛТТАСТАЛ ТАТГГТАТГА KZKTZ ATGCTTCAGG ТТТГСТСГГА GTCTTCGTTT ГГГГСТАТССТ VTCAGC& GTGTGCTGTA CGATGACGAT TATTTAAATA ATGACGGACT TCTTGGTTGT TACTTATTGA TGTACCAAGC TGAGATGTAA ACATATAAAT AACATTTTGG ATAAGATTAC САСТТТАГГТ ATCGGTTGCC ATGAAATTTG GAAGACTTGG GTTAAGACAC AACCACATAT AATGTGATGG TAAATAGCAT TTACAACTAA TGTTAATCTT TTGTTACAAA TOTT CGAACCGAAC 4 Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая регуляторный элемент гена гелиантинина, отличающаяся тем, что указанный регу ляторный элемент управляет временно измененной генной экспрессией в растении и включает нукдеотиды 1-851 или 1639-2303 SEQ ID NO 1 8 17 Химерный растительный ген, включающий 5'фланкирующую область, оперативно соединенную с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, отличающийся тем, что указанная кодирующая последовательность гетерологичного гена оперативно связана с сайтом 3'полиаденилирования и где указанная 5'фланкирующая область включает молекулу нуклеиновой кислоты, охарактеризованную в п 4 18 Химерный растительный ген по п 17, отличающийся тем,что дополнительно содержит промотор, который функционирует в растениях, где указанный промотор оперативно связан по 5'концу с указанной кодирующей последовательностью, а по З'-концу с указанной молекулой нуклеиновой кислоты 19 Химерный растительный ген по п 18, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой промотор вируса растения 20 Химерный растительный ген по п 19, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой промотор вируса мозаики цветной капусты 21 Трансформирующий растение вектор, отличающийся тем, что содержит химерный растительный ген, охарактеризованный в п 5 22 Трансформирующий растение вектор, отличающийся тем, что содержит химерный растительный ген, охарактеризованный в п 9 23 Трансформирующий растение вектор, отличающийся тем, что содержит химерный растительный ген, охарактеризованный в п 13 24 Трансформирующий растение вектор, отличающийся тем, что содержит химерный растительный ген, охарактеризованный в п 17 25 Растительная клетка, отличающаяся тем, что содержит химерный растительный ген, охарактеризованный в п 5 26 Растительная клетка по п 25, отличающаяся тем, что представляет собой клетку хлопка, табака, масличного рапса, кукурузы или сои 27 Растительная клетка, отличающаяся тем, что содержит химерный растительный ген, охарактеризованный в п 9 28 Растительная клетка по п 27, отличающаяся тем, что представляет собой клетку хлопка, табака, масличного рапса, кукурузы или сои 29 Растительная клетка, отличающаяся тем, что содержит химерный растительный ген, охарактеризованный в п 13 30 Растительная клетка по п 29, отличающаяся тем, что представляет собой клетку хлопка, табака, масличного рапса, кукурузы или сои 31 Растительная клетка, отличающаяся тем, что содержит химерный растительный ген, охарактеризованный в п 17 32 Растительная клетка по п 31, отличающаяся тем, что указанная растительная клетка представляет собой клетку хлопка, табака, масличного рапса, кукурузы или сои 33 Способ получения растения, которое проявляет устойчивость к гербициду, который предусматривает трансформацию растительной клетки трансформирующим вектором, охарактеризованным в п 21, и регенерацию указанного растения из указанной трансформированной растительной 44217 5 Химерный растительный ген, включающий 5'фланкирующую область, оперативно соединенную с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, отличающийся тем, что указанная кодирующая последовательность гетерологичного гена оперативно связана с сайтом 3'полиаденилирования, и где указанная 5'фланкирующая область включает молекулу нуклеиновой кислоты, охарактеризованную в п 1 6 Химерный растительный ген по п 5, отличающийся тем, что дополнительно содержит промотор, который функционирует в растениях, где указанный промотор оперативно связан по 5'-концу с указанной кодирующей последовательностью, а по З'-концу - с указанной молекулой нуклеиновой кислоты 7 Химерный растительный ген по п 6, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой промотор вируса растения 8 Химерный растительный ген по п 7, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой промотор вируса мозаики цветной капусты 9 Химерный растительный ген, включающий 5'фланкирующую область оперативно соединенную с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, отличающийся тем, что указанная кодирующая последовательность гетерологичного гена оперативно связана с сайтом 3'полиаденилирования и где указанная 5'фланкирующая область включает молекулу нуклеиновой кислоты, охарактеризованную в п 2 10 Химерный растительный ген по п 9, отличающийся тем, что содержит промотор, который функционирует в растениях, где указанный промотор оперативно связан по 5'-концу с указанной кодирующей последовательностью, а по З'-концу с указанной молекулой нуклеиновой кислоты 11 Химерный растительный ген по п 10, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой промотор вируса растения 12 Химерный растительный ген по п 11, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой промотор вируса мозаики цветной капусты 13 Химерный растительный ген, включающий 5'фланкирующую область, оперативно соединенную с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, отличающийся тем, что указанная кодирующая последовательность гетерологичного гена оперативно связана с сайтом 3'полиаденилирования и где указанная 5'фланкирующая область включает молекулу нуклеиновой кислоты, охарактеризованную в п 3 14 Химерный растительный ген по п 13, отличающийся тем, что содержит промотор, который функционирует в растениях, где указанный промотор оперативно связан по 5'-концу с указанной кодирующей последовательностью, а по З'-концу - с указанной молекулой нуклеиновой кислоты 15 Химерный растительный ген по п 14, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой промотор вируса растения 16 Химерный растительный ген по п 15, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой промотор вируса мозаики цветной капусты 44217 10 трансформирующим вектором, охарактеризованклетки ным в п 23, и регенерацию указанного растения 34 Способ получения растения, которое проявляиз указанной трансформированной растительной ет устойчивость к гербициду, который предусматклетки ривает трансформацию растительной клетки 36 Способ получения растения, которое проявлятрансформирующим вектором, охарактеризованет устойчивость к гербициду, который предусматным в п 22, и регенерацию указанного растения ривает трансформацию растительной клетки из указанной трансформированной растительной трансформирующим вектором, охарактеризованклетки ным в п 24, и регенерацию указанного растения 35 Способ получения растения, которое проявляиз указанной трансформированной растительной ет устойчивость к гербициду, который предусматклетки ривает трансформацию растительной клетки Гелиантини представляет собой запасной белок семян подсолнечника Настоящее изобретение относится к 51-регуляторным областям генов гелиантинина Более конкретно, настоящее изобретение относится к специфическим цисрегуляторным элементам указанной регуляторной области, которые управляют тканеспецифическои, регулируемой во времени, или восприимчивой к воздействию абсцизовой кислоты экспрессией генов Настоящее изобретение относится к химерным генам, включающим в себя цисрегуляторные элементы, сцепленные с кодирующей последовательностью гетерологичного гена для регуляции экспрессии этих генов Химерные гены настоящего изобретения могут быть использованы для сообщения трансгенным растениям резистентности к гербицидам и улучшения качества липидов семян Развитие семян, специфическое для высших растений, включает в себя эмбриональное развитие и процессы физиологической адаптации, которые происходят в семенах, обеспечивая тем самым выживаемость развивающихся саженцев после их прорастания После оплодотворения наблюдаются быстрый рост и дифференциация зародыша и эндосперма, после чего во время периода созревания в процессе развития семян начинают откладываться запасы питательных веществ Эти запасы сохраняются в течение периода блока развития для более позднего их использования развивающимися проростками Этот период блока развития продолжается до фазы десикации развития семян В течение эмбриогенеза аккумулируются белки зерна нескольких классов, включая запасные белки, лектины и ингибиторы трипсина Основная функция запасных белков семян заключается в их аккумуляции во время эмбриогенеза и сохранение запасов углерода и азота для развивающихся саженцев после их прорастания Этим белкам, а также генам, кодирующим эти белки, были посвящены многочисленные исследования (см , например, Shotwell и др (1989) в The Biochemistry of Plants, 15, Academic Press, NY, 297 Гены, кодирующие запасные белки семян, являются в высокой степени регулируемыми и дифференциально экспрессируемыми в процессе развития семян Эта экспрессия является регулируемой во времени мРНК, быстро аккумулирующейся во время фазы созревания эмбриогенеза Указанная экспрессия также является тканеспецифическои и происходит, главным образом, в семядоле или эндосперме развивающихся семян Образующиеся запасные белки процессируются и направляются в белковые тельца, в которых эти запасные остаются в течение периода десикации и покоя зародыша После прорастания проростки используют эти запасные белки, как источник углерода и азота (Higgms (1984) Ann Rey Plant Physiol, 35, 191) Белки семян, включая, запасные белки, лектины и ингибиторы трипсина, кодируются негомологичными мультигенными семействами, которые не амплифицируются или структурно изменяются в процессе развития (см, Goldberg и др, (1989) Cell 56, 149) Эти гены являются регулируемыми пространственно и во времени, но они необязательно являются связанными Хотя посттранскрипционные механизмы направлены на регуляцию аккумулирования некоторых из этих белков, однако регуляция происходит, главным образом, на транскрипционном уровне В соответствии с этим, гены белков семян представляют собой прекрасную систему для "поставки" генетических регуляторних элементов, особенно тех элементов, которые сообщают тканеспецифичность, временную регуляцию и восприимчивость к воздействию окружающей среды и химических соединений Наблюдения временной и пространственной регуляции генов белков семян позволяют предположить, что эти гены регулируются отчасти общими клеточными факторами, известными как трансактивирующие факторы Однако, поскольку характер экспрессии генов белка семян имеет качественное и количественное отличие для каждого отдельного гена, то для обеспечения способов осуществления дифференциальной экспрессии для каждой конкретной группы белков семян, очевидно, должны также существовать более специфические факторы Типы дифференциальной экспрессии наблюдались для мажорных запасных белков семян рапса, круциферина и напина (см Crouch и др , (1981) Planta 153, 64, Fmkelstem и др , (1985) Plant Physiol 78, 630) и для отдельных членов генного семейства соевого ингибитора трипсина Kunitz (Tofukie и др , (1989) Plant Cell, 1, 1079) Сравнение генов мажорного запасного белка семян сои выявило различие в тайминге и клеточной типоспецифичности экспрессии рконглицина (7S) и глицинина (11S) мРНК субъе 11 44217 12 диницы 7S появлялась за несколько дней до мРНК экспрессии гетерологических белков URE вклю11S Кроме того, члены генного семейства глицичает в себя несколько регуляторних элементов, нина все активировались одновременно (Nielsen и которые сообщают различные типы регулируемой др (1989) Plant Cell, I, 313), тогда как члены генноэкспрессии гетерологичным генам, экспрессируего семейства [3-конглицина регулировались дифмым в трансгенных растениях, при связывании ференциально (Barker и др , (1988) Proc Nate этих элементов с кодирующими областями этих Acad Sei USA 85, 458, Chen и др , (1989) Dev генов Genet 10, 112) Каждый из этих генов содержит Более конкретно, настоящее изобретение отряд цис-регуляторных элементов, которые сообносится к выделенным ДНК, содержащим регулящают типы дифференциальной экспрессии разторные элементы гелиантияина, которые способличным генным семействам или генам внутри ны регулировать семя-специфическую экспрессию данного семейства гена, корне-специфическую экспрессию гена, экспрессию гена, восприимчивую к воздействию абГелиантинин является мажорным запасным цизовой кислоты (ABA), и/или меняющуюся во белком семян (глобулином 11S) подсолнечника времени экспрессию гена (Hehanthusannus) Аналогично другим запасным белкам семян, экспрессия гелиантинина является В другом своем варианте настоящее изобретканеспецифической и находится под эволюционтение относится к химерным генам растений, соным контролем Однако регуляторные элементы держащих указанные регуляторные элементы гелиантинина, которые сообщают такую специЭти регуляторные элементы являются соответстфичность, до настоящего времени не были иденвующим образом связанными с кодирующей потифицированы Сначала была обнаружена мРНК следовательностью гетерологичного гена таким гелиантинина в зародышах через семь дней после образом, что указанный элемент способен регуцветения (ДПЦ) , причем максимальный уровень лировать экспрессию продукта, кодированного мРНК достигался на стадии 12-15 ДПЦ, после чего гетерологичным геном Если необходимо, в констэтот уровень транскриптов гелиантинина начинал рукции химерных генов могут быть включены допадать В зрелых семенах или в проростках, полнительные промоторные элементы или части транскрипты гелиантинина отсутствовали От 7 до этих элементов В объем настоящего изобретения 19 ДПЦ, накопление полипептида гелиантинина также входят векторы трансформации растений, происходило быстро, но затем замедлялось, как включающие в себя химерные гены настоящего только семена достигали стадии созревания (Allen изобретения, растительные клетки, трансформии др , (1985) Plant Мої Biol 5, 165) рованные этими векторами, и растения и их потомство, содержащие указанные химерные гены Как и большинство запасных белков, гелиантинин кодируется небольшим генным семейством Известны, по крайней мере, два различных подсемейства, которые обозначаются На2 и НаЮ Были выделены и частично охарактеризованы два клона HaG3-A и HaG3-l, представляющих неаллельные члены подсемейства На2 (Vonder Haar и др, (1988), Gene, 74, 433) Однако детального анализа регуляторних элементов этих или любых других генов гелиантинина до сих пор не было проведено В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что регуляторные элементы, происходящие от генов гелиантинина, могут управлять семя-специфической экспрессией гена, корнеспецифической экспрессией гена, экспрессией гена, восприимчивой к воздействию абсцизовой кислоты, и/или меняющейся во времени экспрессией гена Эти регуляторные элементы способны регулировать экспрессию специфических генных продуктов в трансгенных растениях Таким образом, настоящее изобретение позволяет осуществлять более высокую степень регулирования экспрессии генов в трансгенных растениях и тем самым дает возможность получать семена более высокого качества и с более высокой устойчивостью к условиям окружающей среды, например, таким, как засуха, а также осуществлять более высокий контроль генов устойчивости к гербицидам Настоящее изобретение относится к 5'регуляторной области гена гелиантинина В настоящем описании, эта область будет иметь название "5 -концевой регуляторный ансамбль" (URE) и будет использована для регулирования В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования растения, обладающего более высоким качеством семенных липидов В соответствии с настоящим изобретением, сконструированные химерные гены, содержащие регуляторный элемент, который способен регулировать семя-специфическую экспрессию, связан с кодирующей областью гена, которая кодирует фермент липидного метаболизма Если растительные клетки трансформировать этим химерным геном, то могут быть регенерированы растения с улучшенным качеством липидов семян В еще одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу продуцирования растений, обладающих резистентностью к гербицидам Например, в соответствии с настоящим изобретением, конструируются химерные гены, в которых корне-специфический регуляторний элемент управляет экспрессией гербицидрезистентного гена Поэтому с помощью растительных клеток, трансформированных указанным химерным геном, могут быть регенерированы растения, обладающие устойчивостью к гербицидам На рис I изображена нуклеотидная последовательность URE гена HaG3-A гелиантинина Номера нуклеотидов от -2377 до +24 на рис I соответствуют номерам нуклеотидов 1 -2401 последовательности, показанной в SEQ Ю № I На рис 2 изображена нуклеотидная последовательность части URE гена HaG3-D гелиантинина Номера нуклеотидов -2457 до -726 на рис 2 соответствуют номерам нуклеотидов последовательности, показанной в SEQ 1D № 2 13 44217 14 На рис 3 представлена нуклеотидная послезерна, например, в семядолях и эмбрионных довательность части URE гена HaG3-D гелиантистволах зародыша и в эндосперме Однако эта нина Номера нуклеотидов от -725 до -322 на рис экспрессия гена не наблюдается в проростках или З соответствуют номерам нуклеотидов от І до 404 соматических тканях зрелого растения для генов последовательности, показанной в SEQ 1D № З В под семя-специфическим контролем гене HaG3-D нуклеотидная последовательность, Для идентификации регуляторних элементов, изображенная на рис 3, находится непосредступравляющих семя-специфической экспрессией, венно ниже ("вниз по течению") последовательноможет быть осуществлен делеционный анализ сти, изображенной на рис 2 полного URE гена гелиантинина В делеционном анализе нуклеотяды последовательно удаляют из На рис 4 показаны FL/GUS-конструкция полного URE, и полученные фрагменты лигируют HaG3-A и контрольные конструкции рВІ2І І и с кодирующей последовательностью гена- "репоррВІЮІ I тера" или другого гетерологичного гена Затем На рис 5 представлены рестрикционная карконструкции анализируют на их способность к рета геномных клонов HaG3-A и HaG3-D) гелиантигулированию семя-специфической экспрессии нина и рестрикционные фрагменты, используемые путем обнаружения присутствия продукта репордля конструирования родительских плазмид терного гена в тканях семян, но не в других ткаНа рис 6 изображены конструкции HaG3-A и нях Семя-специфичные элементы, которые были HaG3-D), которые являются дериватизированныидентифицированы, могут быть также модифицими по отношению к конструкции с полной длиной рованы, например, с помощью сайтНа рис 7 проиллюстрирована гистохимиченаправленного мутагенеза Эти модифицированская локализация GUS-активности в трансгенных ные регуляторные элементы могут быть затем проростках, содержащих конструкции HaG3-D-N и проанализированы на их способность к регулироHaG3-A-SB/R A HaG3-D-404N, 8 дней после набуванию семя-специфической экспрессии, что похания (ДПН), В HaG3-A-SB/R, 8 ДПН, С HaG3-Dзволяет идентифицировать альтернативные по404 N, I4 DPI, D HaG3-A-SB/R, 14 ДПН, Е HaG3-Aследовательности, несущие семя-специфичность SB-R, 8 ДПН, F HaG3-A-SB/R, 6 ДПН Описанная техника идентификации регуляторних На рис 8 графически проиллюстрировано инэлементов может быть применена ко всем генам дуцирование GUS-активности в листьях трансгенгелиантинина Например, в предпочтительном ного табака, содержащих конструкцию HaG3-Dварианте осуществления настоящего изобрете404N, в течение прогрессирующей десикации, с ния, анализ URE гена HaG3-A гелиантинина покапоследующей компенсацией недостатка воды зал, что семя-специфические регуляторные элеНа рис 9 графически проиллюстрировано менты определяются нуклеотидами 851 - 2401 и АВА-индуцирование GUS-экспрессии в листьях нуклеотидами I - 2401 в последовательности SEQ табака, содержащих HaG3-D-404N Ю№1 В настоящем описании раскрываются цисрегуляторные элементы 5'-концевого регуляторноДругие регуляторные элементы настоящего го "ансамбля" (URE) генов гелиантинина подсолизобретения управляют корне-специфической нечника Эти цис-регуляторные элементы являютэкспрессией Корне-специфическая экспрессия ся дискретными областями URE, под контролем представляет особый интерес и важность Обычно которых происходит регулируемая экспрессия ген гелиантинина подсолнечника экспрессируется гена В частности, настоящее изобретение отнотолько в семенах При выделении конкретных обсится к выделенной нуклеиновой кислоте, содерластей URE гелиантинина из полного URE в соотжащей, по крайней мере, один регуляторный элеветствии с настоящим изобретением, экспрессия мент, происходящий от гена гелиантинина, и локализуется исключительно в корнях растений регулирующий, по крайней мере, одну из следуюКорне-пецифический регуляторний элемент предщих экспрессии гена семя-специфическую эксставляет собой конкретную нуклеотидную послепрессию, корне-специфическую экспрессию, АВАдовательность, обладающую способностью вызывосприимчивую экспрессию, или изменяющуюся вать экспрессию гена под своим контролем, со временем экспрессию гена Указанные регулякоторая имеет место лишь в корнях растения, но торные элементы могут происходить от любого не в других тканях растения Регуляторные элегена гелиантинина, например, от генов На2 и менты, управляющие корне-специфической эксНаЮ, которые являются представителями двух прессией, могут быть идентифицированы путем разных подсемейств генов гелиантинина В преданализа фрагментов URE гелиантинина на их спопочтительном варианте осуществления настоящесобность сообщать корне-специфическую эксго изобретения такими генами гелиантинина явпрессию, который осуществляют спосоляются HaG3-A и HaG3-D-reHbi, которые являются бом,аналогичным описанному выше для членами подсемейства На2 идентификации семя-специфических регуляторных элементов за исключением того, что указанОдин из рассматриваемых регуляторних эленая экспрессия обнаруживается в тканях корней ментов контролирует семя-специфическую эксрастений Модификации нуклеотидных последопрессию Семя-специфический регуляторный вательностей, которые стимулируют корнеэлемент представляет собой конкретную нуклеоспецифическую экспрессию могут быть также тидную последовательность, способную вызывать идентифицированы,как описано выше С помоэкспрессию гена под своим контролем, которая щью указанной техники могут быть идентифициимеет место в зерне, то есть, экспрессию гена, рованы корне-слецифические регуляторные элеобнаруживаемую в зерне Семя-специфическая менты, происходящие от любого гена экспрессия может происходить в любой части 15 44217 16 гелиантинина Например, в предпочтительном последовательностей любого гена гелиантинина, варианте осуществления настоящего изобретекоторые индуцируют экспрессию гена под своим ния, анализ URE гена HaG3-A гелиантинина покаконтролем в ответ на воздействие ABA, может зывает, что корне-специфические регуляторяые быть использован делеционныи анализ Эти поэлементы представлены нуклеотидами I - I639 и следовательности могут быть модифицированы, нуклеотидами 831 -1639 в SEQ Ю №1 как описано выше, а затем проанализированы для идентификации альтернативных последовательЭкспрессия гелиантинина происходит под ностей, индуцирующих ABA - восприимчивую эксстрогим временным контролем с участием мРНК, прессию В одном из предпочтительных вариантов впервые обнаруживаемой на 12 ДПЦ В соответосуществления настоящего изобретения, анализ ствии с этим, было обнаружено, что существуют URE гена HaG3-A гелиантинина показал, что элецис-регуляторные элементы, сообщающие измемент, ответственный за ABA - восприимчивую эксняющуюся во времени экспрессию гена, обнарупрессию в семенах, представлен нуклеотидами I живаемую уже примерно на 4 день после цвете2401 в SEQ ID № 1 В другом из предпочтительния (ДПЦ) ных вариантов осуществления настоящего изоДля идентификации регуляторних элементов, бретения было установлено, что элемент, индусообщающих временную экспрессию гена, может цирующий ABA - восприимчикую экспрессию в быть осуществлен делеционныи анализ BceroURE листьях зрелого растения, соответствует нуклеогена гелиантинина Фрагменты URE связывают с тидам 851 -1639 или 1639 - 2303 в SEQ ID № 1 В кодирующей последовательностью гетерологичеще одном предпочтительном варианте осущестного гена, и полученную химерную конструкцию вления настоящего изобретения анализ URE гена используют для трансформации растений СемеHaG3-D гелиантинина показал, что нуклеотиды Iна от трансформированных растений выращивают 404 последовательности SEQ ID № 3, соответстдо определенных стадий после цветения (дни повуют области, индуцирующей ABA - восприимчисле цветения, ДПЦ), после чего эти семена аналивую экспрессию в неэмбрионных тканях растений зируют на обнаружение экспрессии гетерологичного гена Элементы, регулирующие экспрессию В соответствии с вышеуказанным, ценность гетерологичного гена примерно до 10 ДПЦ, были ABA - восприимчивых элементов заключается в идентифицированы как элементы, вызывающие том, что специфические условия окружающей меняющуюся во времени экспрессию Модификасреды могут инициировать АВА-биосинтез, и тем ции нуклеотидных последовательностей таких самым индуцировать экспрессию генов под конэлементов, сообщающих нужный фенотип, могут тролем АВА-восприимчивых элементов Экспресбыть идентифицированы, как описано выше Укасия гетерологичных генов под контролем ABA занная техника идентификации регуляторных восприимчивых элементов URE гелиантинина не элементов, которые сообщают изменяющуюся во ограничивается лишь семенами, но также наблювремени экспрессию гена, может быть применена дается в листьях зрелых растений и в тканях проко всем генам гелиантинина В предпочтительном ростков варианте осуществления настоящего изобретеВыделенная нуклеиновая кислота, кодируюния, анализ URE гена HaG3-A гелиантинина покащая 5'-концевой регуляторный ансамбль гена гезывает, что элементы, регулирующие временную лиантинина, может быть получена следующим экспрессию гена, представлены нуклеотидами I образом Рекомбинантные геномные клоны гели851 и 1639 - 2303 в SEQ ID № 1 антинина выделяют путем скрининга геномной ДНК-библиотеки подсолнечника с рекомбинантной В другом своем варианте настоящее изобрекДНК, представлящей мРНК гелиантинина (Vonder тение относится к областям URE гелиантинина, Haas (1988) Gene 74, 433) Для получения геномкоторые стимулируют экспрессию гена, восприимных рекомбинантных ДНК гелиантинина могут чивую к воздействию абсцизовой кислоты (ABA) быть использованы методы, описанные Sambrook АВА-восприимчивый элемент представляет собой и др (1989) в "Molecular Cloning A Laboratory Manконкретную нуклеотидную последовательность, ual, Cold Spring Harbor, NY, либо в любом из мнокоторая способна вызывать экспрессию гена под гочисленных руководств по технике рекомбинантсвоим контролем в ответ на воздействие ABA ных ДНК, которые имеются в настоящее время Экспрессия гена под контролем АВАДля определения нуклеотидных последовательвосприимчивого элемента может быть индуцироностей существует множество способов, хорошо вана путем обработки абсцизовой кислотой (ABA), известных каждому специалисту в этой области или внешними раздражителями, которые известНапример, рестрикционные фрагменты, содержаны как стимуляторы АВА-биосинтеза Например, щие URE гелиантинина, могут быть субклонироАВА-биосинтез инициируется в результате спада ваны в сайт полилинкера секвенирущего вектора, тургора, вызванного стрессами, обусловленными такого, как pBluescnpt (Stratagene) Эти pBluescnpt состоянием окружающей среды, например, недос-субклоны могут быть затем секвенированы с потатком воды, водными стрессами, и стрессами, мощью двухнитевого дидезокси метода (Chen вызванными засолением субстрата (см , Zeewart и nSeeburg (1985) DNA, 4, 165) др , (1988) Annu Rev Plant Phusiol 39,439) Уровни ABA также возрастают в ответ на скарификаНуклеотидная последовательность для ДНК, цию (Репа, Cortes и др, (1989) Proc Natl Acad кодирующей URE клона гена HaG3-A гелиантиниSci USA 86, 9851) ABA - восприимчивые элеменна, показана на рис I, и представлена как SEQ ID ты идентифицируют, как описано выше, для иден№ 1 (см ниже) Аналогично, нуклеотидная послетификации других регуляторних элементов Надовательность для ДНК, кодирующей область пример, для идентификации нуклеотидных URE клона HaG3l гелиантинина, показана на рис 17 44217 18 2, и представлена ниже как нуклеотидная послесию гена, АВА-восприимчивую экспрессию гена довательность SEQ Ю № 2 URE других генов геили временную экспрессию гена, причем, указанлиантинина могут быть получены аналогичным ный химерный ген лигируют с кодирующей послеобразом Альтернативно, клоны, представляющие довательностью гетерологичного гена так, чтобы другие члены семейства генов гелиантинина,могут регуляторный элемент был способен регулиробыть получены с использованием кодирующих вать экспрессию продукта, кодированного гетероHaG3A - или HaG3D - последовательностей или логичным геном Таким гетерологичным геном URE - последовательностей настоящего изобреможет быть любой ген, не являющийся геном гетения в качестве гибридизационных зондов для лиантинина Если необходимо, то в химерные скрининга геномной библиотеки гелиантинина и конструкции могут быть включены дополнительидентификации дополнительных генов гелиантиные промоторные элементы или части этих эленина ментов, достаточные для индуцирования экспрессии, которая приводит к продуцированию Идентификация цис-регуляторных последоваэффективного количества полипептида, кодиротельностей, которые осуществляют временную, ванного гетерологичным геном тканеспецифическую и АВА-чувствительную регуляцию, может быть осуществлена путем трансВ соответствии с вышеуказанным, настоящее крипционного лигирования специфических послеизобретение относится к химерным генам, содердовательностей с кодирующей жащим области URE гелиан-тинина, который инпоследовательностью гетерологичного гена, подуцирует семя-слецифическую экспрессию в соследующего переноса химерного гена в подходяответствии с настоящим изобретением, и который щего хозяина, и обнаружения экспрессии гетеросвязан с последовательностью, кодирующей логичного гена Выбор анализа для обнаружения фермент липидного метаболизма, такой, как десаэкспрессии зависит от природы гетерологичной тураза В предпочтительном варианте осуществпоследовательности Например, для оценки ления настоящего изобретения, области URE сотранскрипционной и трансляционной компетенции ответствуют нуклеотидам 851 - 2401 или I - 2401 химерных конструкций обычно используют репорHaG3, как показано в SEQ ID № 1 В настоящее терные гены, идентифицированные с помощью изобретение может быть включена любая модихлорамфениколацетилтрансферазы и рфикация, стимулирующая семя-специфическую глюкуронидазы (GUS) Имеются также стандартэкспрессию, семена аккумулируют и хранят белки ные анализы для чувствительного обнаружения и липиды, которые имеют важное агрономическое репортерного фермента в трансгенном организме значение Поскольку элементы URE гелиантинина Ген р-глюкуронидазы может быть использован в могут индуцировать в высокой степени регуликачестве "поставщика" (репортера) промоторной руемую экспрессию в развивающихся семенах, то активности в трансгенных растениях табака эти элементы могут быть использованы для повследствие высокой стабильности этого фермента вышения качества липида и/или белка зерна Эти в клетках табака, недостатка р-глюкуронидазной элементы могут быть использованы для регулиактивности в высших растениях и доступности рования экспрессии генов, кодирующих ферменты качественного флуориметрического анализа и липидного метаболизма, такие, которые участвуют гистохимической техники локализации Tefferson и в элонгации и десатурации жирных кислот, и/или др , [(1987), ЕМВО Т , 6, 3901)] разработали станбелков, особенно белков с высоким содержанием дартные процедуры для биохимического и гистолизина и метионина Химерные гены, содержащие логического обнаружения GUS -активности в ткауказанные элементы, могут быть использованы нях растений Биохимический анализ для получения линий трансгенных растений, котоосуществляют путем смешивания лизатов растирые аккумулируют и хранят значительные количетельной ткани с 4-метилумбел-лиферил- B-Dства липидов и/или белков определенных классов глюкуронидом, флуориметрическим субстратом В другом своем варианте настоящее изобредля GUS, инкубирования при 37° С в течение одтение относится к химерным генам, содержащим ного часа, и последущего измерения флуоресценобласть URE гелиантинина, которая индуцирует ции полученного 4 -метилумбеллиферона Гистокорне-специфическую экспрессию, и которая прихимическую локализацию для GUS-активности соединена к гетерологичному гену Эта конструкопределяют путем инкубации образцов ткани расция индуцирует экспрессию, которая пространсттений в 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-глюкурониде венно отличается от "нормальной" экспрессии (X-Gluc) в течение 18 часов при 37 С с последуюгелиантинина тем, что указанный гетерологичный щим наблюдением характера окрашивания Xген экспрессируется исключительно в корнях расGluc Конструирование таких химерных генов потений Другими словами, если специфическую зволяет определить специфические регуляторные последовательность удалить из полного регуляпоследовательности, необходимые для регулироторного ансамбля URE, то в ткане-специфической вания экспрессии, и дает возможность проиллюрегуляции произойдет изменение В предпочтистрировать тот факт, что эти последовательности тельном варианте осуществления настоящего могут регулировать экспрессию гетерологических изобретения URE-область HaG3-A соответствует генов анализируемым способом нуклеотидам 1-1639 или 851 -1639 в SEQ ID № 1, и присоединена к промотору в обратной ориентаВ другом своем варианте настоящее изобреции, хотя эти элементы функционируют в любой тение относится к химерному гену растения, соориентации В другом предпочтительном варианте держащему регуляторний элемент от гена гелианосуществления настоящего изобретения, послетинина, индуцирующий семя-специфическую довательность, сообщающая растению резиэкспрессию гена, корне-специфическую экспрес 20 19 44217 стентность к гербицидам, представляет, по крайстрессам ней мере, часть гена агоА В объем настоящего Химерные гены настоящего изобретения конизобретения входит любая модификация этих струируют путем лигирования 5'-фланкирующей последовательностей, которая индуцирует корнепоследовательности геномной ДНК гелиантинина специфическую экспрессию с кодирующей последовательностью гетерологичного гена Присоединение этих последовательноОсобый интерес представляют химерные констей может быть осуществлено различными спострукции, сообщающие растению рез и стентность собами, в предпочтительном варианте настоящего к гербицидам Поскольку большинство гербицидов изобретения, указанные последовательности расоказывают свое токсическое воздействие не тольположены в следующем порядке (от 5' к 3') вверху ко на сорняки, но и на культурные растения, то регуляторная область гелиантинина, затем прополучение устойчивых к гербицидам растений моторная область, кодирующая последовательимеет особо важное значение в агротехнике, поность и сайт полиаденилирования скольку оно позволяет использовать гербициды широкого спектра В соответствии с этим, настояСпособы конструирования таких химерных гещее изобретение относится к химерным генам, нов хорошо известны каждому специалисту и мосодержащим элементы URE гелиантинина, котогут быть легко найдены в специальной литературые индуцируют корне-специфическую экспресре, например, Sambrook и др, (1989) Для сию и которые соединены, по крайней мере, с чалигирования фрагментов ДНК существует нестью промотора, функционирующего в растениях, сколько стратегий, выбор которых зависит от приа также соединены, по крайней мере, с частью роды концов ДНК - фрагментов Каждому специагена агоА или последовательностью, кодирующей листу известно, что для экспрессии полипептид, несущий рез и стентность к гербицигетерологичного гена необходимо, чтобы констдам В настоящем изобретении рассматриваются рукция содержала промоторные элементы и сигполипептиды, которые сообщают растению устойналы для эффективного полиаденилирования чивость к глифосату и родственным ингибиторам транскрипта В соответствии с этим, 5' -области 5-энолпировилшикимат-З-фосфатсинтазы (EPSPURE гелиантинина, которые содержат промоторсинтазы), сульфонилмочевинам, имидазолинонам, ные последовательности, известные как СААТ- и и ингибиторам а це толактазосинтазы (ALS ) и ТАТА-блоки, могут быть непосредственно присоеацетооксикислой синтазы (AHS) В предпочтидинены к гетерологической последовательности, тельном варианте осуществления настоящего не имеющей промотора Альтернативно, UREизобретения URE-области соответствуют нуклеообласти гелиантинина, которые не содержат САтидам 1-1639 или 851 - 1639 HaG3-A в SEG Ю № АТ- и ТАТА-блоки, могут быть присоединены к 1 и являются сцепленными в обратной ориентаДНК-фрагменту, кодирующему промотор, который ции с промотором В настоящем изобретении расфункционирует в растениях В этих целях могут сматривается любая модификация, которая индубыть использованы коммерческие растительные цирует корне-специфическую экспрессию промоторы, либо они могут быть химически синтезированы, исходя из их известных последоваВ другом своем варианте настоящее изобретельностей Примером вышеуказанного фрагментение относится к химерным генам, содержащим та может служить усеченный промотор 35S вируса элементы URE гелиантинина, которые индуцирумозаики цветной капусты, который содержат ют изменяющуюся во времени экспрессию и котоGAAT- и ТАТА-блоки Другими типичными проморые соединены в прямой или обратной ориентаторами являются промотор нопалинсинтазы и риции, по крайней мере, с частью промотора, було-зо-1, 5-бифосфаткарбоксилазы Промоторфункционирующего в растениях, а также с кодиный фрагмент, кроме того, сшивают с рующей областью гетерологичного гена В предгетерологической кодирующей последовательнопочтительном варианте осуществления настоящестью 3' - конец кодирующей последовательности го изобретения эти элементы URE соответствуют сшивают с сайтом полиаденилирования, применуклеотидам 1 - 851 или 1639 -2303 HaG3-A в ром которого является, но не ограничивается им, SEQ 1D № І В объем настоящего изобретения сайт полиаденилирования нопалинсинтазы Кроме входит любая модификация этих последовательтого, существуют векторы, трансформирующие ностей, индуцирующая временную экспрессию растения, которые содержат один или несколько гена указанных сайтов полиаденилирования, граничаНастоящее изобретение также относится к щих с последовательностями, необходимыми для химерным генам, содержащим элементы URE трансформации растений Элементы URE гелиангелиантинина, которые индуцируют ABA - экстинина и гетерологичные кодирующие последовапрессию и которые являются необязательно прительности настоящего изобретения могут быть соединенными в прямой или обратной ориентасубклонированы в сайт полилинкера растение ции, по крайней мере, с частью промотора, трансформирующего вектора для получения хифункционирующего в растениях, а также с гетеромерных генов логичным геном В предпочтительном варианте настоящего изобретения эти элементы URE соот5-фланкирукщие элементы настоящего изоветствуют нуклеотидам 852 - 1639 или 1639 - 2303 бретения могут быть получены в результате переHaG3-A в SEQ Ю № I, или нуклеотидам I - 404 варивания геномного клона гелиантинина рестHaG3-D в SEQ ID № 3 Особый интерес представриктирующей эндонуклеазой или экзонуклеазой ляют конструкции, индуцирующие ABA - восприЭти рестрикционные фрагменты, содержащие имчивую экспрессию и тем самым сообщающие СААТ- и ТАТА-блоки гелиантинина, лигируют в растениям повышенную устойчивость к водным прямой ориентации с гетерологичным геном, не 22 21 44217 содержащим промотора, например, геном, кодиBarton и др , (1983), Cell, 32, 1033) В предпочтирующим [3-глюкуронидазу (GUS) Каждому спетельном варианте осуществления настоящего циалисту ясно, что 5'- регуляторные последоваизобретения, растения трансформируют векторательности гелиантинина могут быть получены и ми, происходящими от Agrobactenum Однако, для другими способами, например, путем химического вставки химерных генов настоящего изобретения или ферментного синтеза Указанным гетеролов растительные клетки могут быть использованы и гичным геном может быть кодирующая последодругие методы Такими альтернативными метовательность любого гена, который может быть дами являются электропорация (Klein и др (1987) экспрессирован в данной конструкции Описанные 327, 70), химически индуцированное внедрение способы также входят в объем настоящего изоДНК и использование вирусов или пыльцы в качебретения 3'- конец кодирующей последовательстве векторов ности может быть, но необязательно, лигирован с Если необходимо, то химерные гены настоясайтом полиаденилирования, примером которого щего изобретения могут быть введены в вектор является, но не ограничиваетсл им, сайт полиадетрансформации растения, например, бинарный нилирования нопалинсинтазы, или сайт полиадевектор, описанный Bevan (I984) Векторы для нилирования гена 7 Т-ДНК октопина Альтернатрансформации растений могут быть получены тивно, сайт полиаденилирования может путем модификации натуральной системы для обеспечиваться гетерологичным геном переноса гена, происходящей от Agrobacttenum tumefaciens Эта натуральная система представ5- регуляторные элементы гелиантинина, коляет собой большую ТІ (опухоль-индуцирующую) торые не содержат ТАТА-блок, могут быть лигироплазмиду, содержащую большой сегмент, известваны в прямой или обратной ориентации, по крайный как Т-ДНК, который переносится в трансфорней мере, с частью последовательности мированное растение Другой сегмент Ті растительного промотора, т е , промоторной поплазмиды, а именно, vir -область, является ответследовательности, содержащей, по крайней мере, ственным за перенос Т-ДНК Т-ДНК - область имеСААТ- и ТАТА-последовательности В предпочтиет на своих границах концевые повторы, в модительном варианте настоящего изобретения, укафицированных бинарных векторах, опухользанным промотором является усеченный промоиндуцирующие гены были делетированы, и функтор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) ции vir - -области были использованы для переПолученный в результате химерный комплекс моноса чужеродной ДНК, имеющей на своих гранижет быть лигирован с гетерологичной кодирующей цах пограничные Т-ДНК-последовательности Тпоследовательностью или последовательностью область также содержит селектируемый маркер полиаденилирования на резистентность к антибиотику и сайт множестДля индуцирования регулируемой экспрессии венного клонирования для инсерции переносимых гетерологич-яых генов растения трансформируют последовательностей Сконструированные таким химерной генной конструкцией настоящего изообразом, штаммы известны как "обезвреженные" бретения Перенос генов является хорошо изштаммы A tumefaciens, которые позволяют осувестным способом, применяемым для экспрессии ществлять эффективную трансформацию послегетерологичных генов в трансгенных растениях В довательностей, окаймленных Т-областями в нуккачестве хозяина чаще всего используют растение леарные геномы растений табака, поскольку оно легко регенерируется, дает большое количество жизнеспособных семян на Диски листьев со стерилизованной поверхноодно растение, и может быть трансформировано с стью инокулировали "обезвреженной" A tumefaвысокой степенью частоты с помощью Ті ciens, содержащей чужеродную ДНК и культивиплазмидного вектора, происходящего от агробакрованной в течение двух дней, а затем терии (klle и др , (1987) -Annu Rev Plant Physiol переносили на среду, содержащую антибиотик 38, 467) В качестве трансгенных хозяев предпочПосле укоренения в среде, содержащей антибиотительными являются двудольные растения, татик, трансформированные побеги отбирали и пекие, как хлопчатник, масличный рапс и соя Однареносили в почву Трансгенные растения подверко каждому специалисту ясно, что в качестве гали самоопылению, а семена от этих растений трансгенного растения в настоящем изобретении собирали и культивировали на среде, содержащей может быть использовано любое растение, котосоответствующий антибиотик рое может быть эффективно трансформировано и Экспрессия гетерологичного или репортерного регенерировано гена в развивающихся семенах, молодых проростках и зрелых растениях может быть проконтролиИзвестно несколько способов трансформации рована с помощью иммунологического и гистиоХимерные гены могут быть введены в растения с химического анализа или анализа на активность помощью процедуры трансформации-регенерации дисков листьев, описанной Horsch и др ,(1985) Как указывалось выше, выбор анализа на эксScience 227, 1229) В целях настоящего изобретепрессию химерного гена зависит от природы гетения могут быть использованы и другие способы рологичной кодирующей области Например, для трансформации, которые также входят в объем оценки транскрипции может быть использован настоящего изобретения, например, такие, как Нозерн-анализ, если имеются подходящие нуккультивирование протопластов (Horsch и др, леотидные зонды Если имеются антитела к поли(1984) Science 223,496, De Block и др , (1984) ЕМпептиду, кодированному гетерологичным геном, то ВО Т, 2, 2143, Barton и др , (1983) Cell 32, 1033) для оценки продуцирования и локализации полиили трансформация эксплантатов стебля или корпептида могут быть использованы Вестерн-анализ ня in vitro (Zambrysk и др , (1983) ЕМВО Т, 2, 2143, и иммуногистохимический анализ на локализацию, 24 23 44217 в зависимости от гетерологичного гена, может цидам Клетки растений трансформируют вектобыть использован соответствующий биохимичером, содержащим химерный ген, который включаский анализ Например, а це тилтрансферази моет в себя корне-специфический регуляторный гут быть обнаружены путем оценки ацетилироваэлемент, лигированный с кодирующей последования стандартного субстрата Экспрессия гена тельностью гена резистентности к гербицидам, резистентности к гербициду может быть обнарутакого, как ген резистентное™ к глифосату, после жена путем оценки трансгенного растения на речего отбирают растения, обладающие резистентзистентность к гербициду ностью к нужному гербициду Отбор производят по принципу выживаемости растения после его обВ другом своем варианте настоящее изобреработки гербицидом, который уничтожает нетение относится к трансгенным растениям или их трансформированные растения того же вида и в потомству, содержащим химерные гены настоятех же условиях В предпочтительном варианте щего изобретения В целях настоящего изобретенастоящего изобретения, регуляторний элемент ния могут быть использованы как однодольные, соответствует нуклеотидам I - 1639 или 851 так и двудольные растения, растительные клетки 1639 URE HaG3-A, как показано в SEQ Ю № I, a трансформируют химерными генами с использогетерологичная последовательность поставляется ванием любого из имеющихся методов трансфоргеном, кодирующим EPSP -синтезу, ацетолактазомации растений, описанных выше Трансформисинтазу, ацетооксисинтазу После этого трансрованные клетки растений, обычно в каллюсной формированные клетки растений регенерируют в культуре или дисках листьев, регенерируют в полрастения, обладающие резистентностью к гербиное трансгенное растение хорошо известными цидам В предпочтительном варианте осуществспособами (см , например, Horsch и др (1985) Sciления настоящего изобретения, растения трансence 227, 1129) В предпочтительном варианте формируют с помощью вектора pRPA-M -803, осуществления настоящего изобретения, транскоторый содержит корне-специфический регулягенными растениями являются хлопчатник, масторний элемент, соответствующий нуклеотидам личный рапс, кукуруза, табак, или соя Поскольку 851 - 1639 HG3-A и aroA-ген устойчивости к гербипотомство трансформированных растений наслециду дует химерные гены, то для сохранения линии трансгенного растения используются семена или В целях иллюстрации настоящего изобретечеренки от трансформированных растений ния, ниже приводятся следующие примеры Настоящее изобретение также относится к Пример I способу продуцирования растения с улучшенным Общие методы качеством липида семян Этот способ заключаетНуклеотидные последовательности, указанся в том, что клетку растения трансформируют с ные в приведенных ниже примерах, пронумеровапомощью вектора, содержащего химерный ген, ны в соответствии с рис 1-3 включающий в себя семя-специфический регуляКонструирование ген а-репортера G торный элемент, присоединенный к кодирующей Используемые в настоящих примерах кассеты последовательности фермента липидного метарепортерных генов GUS общего назначения были болизма, такого, как десатураза, а затем произвоописаны ранее Tefferson и др , (1987) ЕМВО Т 6, дят отбор растения с нужными характеристиками 390I) Короче говоря, кодирующую область G лиВ предпочтительном варианте, осуществления гировали с 5'-концом сайта полиадеяилирования настоящего изобретения регуляторный элемент нопалинсинтазы в области полилинкера вектора соответствует нуклеотидам I - 2401 или 851 - 2401 pBINI9, происходящего от A tumefaciens (Bevan URE HaG3-A, показанным в SEQ Ю № 1 Транс(1984) Nuclhc Acids Res 12, 8711) Вектор рВ1Ш9 формированные клетки растений регенерируют в содержит слева и справа от Т-ДНК пограничные растения с улучшенным качеством липида семян последовательности, необходимые для трансформации растений, а также ген резистентности к В другом варианте настоящее изобретение канамицину Полученная конструкция рВИ 01 изоотносится к способу продуцирования растения с бражена на рис 4 Уникальные сайты рестрикции, улучшенным качеством белка семян Этот способ расположенные выше кодона инициации (AUG) заключается в том, что растительную клетку GUS , позволяют инсертировать ДНК-фрагменты трансформируют вектором, содержащим химерпромотора ный ген, который включает в себя семяспецифический регуляторный элемент, присоедиПромотор 35S CaMV лигировали в Hind 111 и ненный к кодирующей последовательности запасBam H1 - сайты рВ1101 1 для создания рВ1121 1, ного белка семян с высоким содержанием лизиноизображенной на рис 4 Для построения рВ1120, вых и/или метиониновых остатков, а затем промотор 35S CaMV усекали у EcoRV -сайта у производят отбор растений с нужными характеринуклеотида - 90 (оставляя СААТ и ТАТА-блоки) и стиками В предпочтительном варианте осуществклонировали в полилинкерный сайт рВ1101 1 ления настоящего изобретения, регуляторный В Таблице I описаны родительские плазмиды элемент соответствует нуклеотидам I - 2401 или и производные конструкции На G3-A-FL и кон851 - 2401 URE HaG3-A, как показано в SEQ ID № трольные конструкции рВ1121 1 и рВ1101 1 изо1 Трансформированные клетки растений регенебражены на рис 4 На рис 5 показаны рестрикцирируют в растения с улучшенным качеством белка онные фрагменты геномных клонов HaG3-A и семян HaG3-D, использованные для конструирования родительских плазмид На рис 6 показаны схемаВ еще одном своем варианте настоящее изотически производные конструкции по отношению к бретение относится к способу продуцирования полной конструкции растений, обладающих резистентностью к герби 25 44217 26 Таблица Конструирование Родительские плазмид ы рВИ01 1 рВИ21 1 рВИ20 1 pHa-G3-A-2 8 pHa-G3-A-2 4 pHa-G3-A-2,3 HaG3-A-FL Ha-G3-A-HS/F-HS/R HaG3-A-HS/R Ha-G3-A-HB/F-HB/R Ha-G3-A-S2 /F-S2/R Ha-G3-A-S2/F-S2/R Описание Кассета репортерных генов GUS, не содержащая промотор и полученная на основе BIN-19 Промотор 35S CaMV, сшитый с GUS-кассетой в рВИ 01 1 Промотор 35S CaMV, усеченный у EcoRV-сайте с сохранением СААТ- и ТАТАблоков и сшитый с GUS-кодирующей областью/ 2,8кв - Вам IH-Pst І-фрагмент HaG3 в pbluescnpt, содержит 2,4кв выше от кодирующей области Ha-G3-A и 0,38 кв ниже от сайта инициации транскрипции, был использован для создания экзонуклеазных III делеций 2,4кв -Ha-GS-фрагмент, полученный в результате З'-переваривания экзонуклеазой III pHa-G3A-2,8 - +24, содержит СААТ и ТАТА-блоки HaG3-A 2,3кв -НаСЗ-А-фрагмент, генерированный в результате переваривания экзонуклеазой Ш pHaG3A-2,8 - (-75), содержит СААТ-блок HaG3-A Производные конструкции 2,4кв-вставка pHaG3A-2,4, лигированная с рВИ 01 1 в прямой ориентации 0 85-кв-Ват HI-Sall-фрагмент от pHaG3A-2,3, клонированный в прямой и обратной ориентации по отношению к усеченному промотору 35S CaMV рВИ 120 0,85кв-фрагмент, вырезанный как Sacl-фрагмент из HaG3A-HS/F, и клонированный в обратной ориентации по отношению к усеченному промотору 35S CaMV рВИ20 1,6кв-Ват HI - Ball-фрагмент из pHaG3A-2 3, клонированный в прямой и обратной ориентациях по отношению к усеченному CaMV-промотору 35S рВИ 20 0,6 KB-Sall-Ball-фрагмент из Ha-G3-A, клонированный в прямой и обратной ориентации по отношению к усеченному CaMV -промотору 35S в рВИ 20 и сконструированный путем делеций Sail-Bam НІ-фрагмента из HaG3-A-HB/F и HaG3-AHB/R, соответственно 1,4кв Sail- фрагмент из pHa-G3-A-2,3, клонированный в прямой и обратной ориентации по отношению к усеченному CaMV-промотору 35S в рВИ 20 Ha-G3-A-B2/F-B2/R 0,66кв - Ball- Sail- фрагмент из pHaG3-A-2,3, клонированный в прямой и обратной ориентации по отношению к усеченному CaMV-промотору 35S в PBII20 HaG3-A-H2 2,3кв - вставка из pHaG3-A-2 3, клонированная в прямой ориентации по отношению к усеченному CaMV - 35S рВП20 HaG3-A-S1 HaG3-D-404N-404l 1,5кв Sail - фрагмент из pHaG3-A-2,4, клонированный в прямой ориентации по отношению к рВІЮІ I 0,4кв Sall-Hpal - фрагмент из HaG3-3D, клонированный в прямой и обратной ориентации по отношению к усеченному CaMV-промотору 35S в PBII20 На G3-A/GUS -конструкции представляют большие перекрывающиеся фрагменты, которые расположены по всей длине регуляторной области (-2377- + 24, рис I) 3* -концы нескольких конструкций были получены в результате переваривания 2,8кв - На GS-A-фрагмента в pbluescnpt (Stratagene) [pHaG3-A-2 8 (Bam H1 - Pst) Табл 1] эндонуклеазой 111 Эти делеций показаны в верхней части рис 4 Первая делеция, pHaG3-A-2,4, содержит СААТ- и ТАТА-блоки HaG3-A, где ее 3конец находится у -75 Фрагменты, содержащие HaG3-CAAT2 и ТАТА-блоки, лигировали в прямой ориентации в GUS-кассету, не содержащую промотора рВ1101 1 Фрагменты, которые не содержали Ha-G3-A-TATA-6noK, лигировали в обеих ориентациях выше усеченного промотора 35S CAMV рВ1120 Эти фрагменты субклонировали в соответствующую GUS-кассету Полученные конструкции обозначали в соответствии с их концевыми сайтами, причем, последующая бувка F означает прямую ориентацию, а буква R- обратную ориентацию Стрелками показана ориентация фрагмента по отношению к кодирующей области GUS (рис 4) HaGS-D/GUS-конструкции содержат 404 п о фрагмент (Sail - Hpal) в обеих ориентациях нормальной (N) и обратной (I) Точность и ориентация каждой конструкции была подтверждена с помощью двух нитевого дидезоксисеквенирования (Chen и Seeburg, 1985) и с использованием праймеров к областям в GUS-кассетах (Advanced DNA Technologies Lab, Texas ASM University) Трансформация растений Плазмидные конструкции на основе BIN-19 использовали для трансформации табака (Nicotiana tabacum cv Xanthi) в соответствии со стандартными процедурами (Horsch и и др 1985) за исключением того, что исходные трансформанты подвергали селекции на 50мкг канамицина/мл, а затем переносили на 100мкг/мл канамицина Растения подвергали самоопылению, семена проращивали на канамицине (400г/мл) для идентификации трансформантов, поскольку конструкции на основе BIN-I9 содержат ген неомицинфосотранс 28 27 44217 феразы (NPT11), который сообщает резистентдержащих различные элементы ность к токсичному антибиотику канамицину Чиспоследовательности HaG3-A (систематизированло копий каждой GUS-конструкции, интегрированные на рис 4), которые индуцируют GUS ной в геном табака, оценивали для каждого экспрессию Результаты представлены в Таблице трансформанта путем определения частоты сег2 Все конструкции, содержащие некоторую часть регации гена NPT11 Большинство трансформанURE от генов HaG3-A и HaG3-D гелиантинина, тов содержали лишь один локус сегрегации констпродуцировали GUS-активность в семенах трансрукции Дочерние гомозиготные растения генного табака Полная регуляторная область (FL) использовались там, где это указано Трансгенные и фрагменты, происходящие от этой области, а растения, представляющие все испытуемые контакже На G3-D /GUS -конструкции, все индуцирострукции, были получены для всех случаев, за вали значительную GUS -активность в зрелых исключением обратной конструкции Н- 2 Транссеменах по сравнению GUS -экспрессией, индугенные растения выдерживали в камерах Конвицированной интактным CaMV-35S -промоторным рона с циклом день ночь = 16ч 8ч , температукомплексом (рВН21) Однако хорошо выраженная рой 24°С, относительной влажностью 70 - 80% семя-пецифическая экспрессия была получена Для предупреждения десикации до проведения лишь с использованием конструкций, содержащих испытаний придерживались строгого режима оро5 -проксимальные области между -75 и +24 (см FL шения растений и S-I) Эти две конструкции, содержащие нуклеотиды -2377 -+24 или -1527 - +24, демонстрироваПример 2 ли тканеспецифическую GUS -экспрессию с не Биохимическая оценка G US-акти в ноети семяобнаруживаемой SUS -активностью во всех тканях специфическая и корне-специфическая экспрестрансгенных проростков Однако, уровень экссия прессии FL -конструкции в зрелых зернах в шесть GUS-активность определяли в эмбриональных раз превышает уровень экспрессии S-I Для срави неэмбриональных тканях трансгенных растений нения, -GUS-активность в тканях проростков, сотабака, содержащих каждую из конструкций, опидержащих интактный СаМ\Л35Э-промоторный санных в Таблице I При этом были использованы комплекс (рВ1121), используется так же, как негастандартные процедуры Tefferson и др (1987) тивный контроль содержащие усеченный CaMV Растительную ткань измельчали в экстраци35S -промотор (рВ1120) или не содержащие проонном буфере (50мМ, NaP04, ЮмМ ЭДТК, 0 1% мотор (рВІЮІ) По сравнению с экспрессией в сеSorkosyl, 0,1% Тритон Х-ЮО и ЮмМ рменах, в листьях, содержащих ту же самую констмеркаптоэтанола) После центрифугирования лирукцию, наблюдалась незначительная экспрессия, зата супернатант удаляли в свежую пробирку, и но, с другой стороны, большинство конструкций распределяли на ЮОмкл, аликвоты Затем в экс(кроме FL и S-I) обнаруживали значительную экстракционный буфер добавляли равный объем прессию в трансгенных проростках 2мМ 4-метилумбеллиферил-р-О-глюкуронида и инкубировали в течение I часа при 37С После В соматических тканях, за исключением корэтого реакцию прекращали путем добавления ней, полная активность, индуцированная интакт0,8мл ЫагСОз (0,2 М) Флуоресценцию полученноным СаМ\/-353-промоторным комплексом, прего 4-метилумбеллиферона (4-МУ) определяли с вышает активность, индуцированную другими помощью минифлуориметра Hoeffer TKO-IOO, как конструкциями В частности, уровни GUSописано (Tefferson и др , 1987) GUS -активность активности в корнях проростков, содержащих конвыражали в пикомолях 4-МУ на единицу массы струкции HB/R (-2377- -739 ) и SB/R (-1527- -739), в всего образца белка в минуту 7 - 8 раз превышают уровни GUS-экспрессии в корнях под контролем интактного промотора 35S На (GUS -активность оценивали семядоли, гиCaMV покотили, листья и корни от трансгенных проростков от 18 до 20 дней после набухания(ДПН), соТаблица 2 Суммарная оценка GUS-экспреесии в эмбриональных и не эмбриональных тканях трансгенных растений табака GUS-активность (пмоль 4Му/мкг/мин) ABAПрофиль Конструкция восприразвития зерна листья корни имчивость HaG3-A FL I 187±87 0 0 + 10 S-1 I 34±1 1 0 0 ND F III 171 ±15 0 45 ± 0 05 36 6 ± 2 2 HS R ND 0 23 ± 0 05 62±1 0 89±1 8 F II 14 8 ±5 2 0 95 ± 0 13 29 9 ± 2 2 + 15 HB R ND 131 ± 6 9 0 25 ± 0 05 754±3 F II 11 1 ± 5 8 0 139±68 20 SB R F ND II 44217 121 ± 5 8 35 7 ±4 2 0 34 ± 0 05 0 30 90 5 ± 9 9 20 6 ±10 2 + ND R F ND III 21 0 ± 1 5 11 2 ± 3 9 0 45 ± 0 08 2 03 ±0 08 38 8 ± 1 2 8 0 ± 0 62 + + R F ND III 72±23 1 8±1 0 4 05 ± 0 10 ND 39±03 1 8±03 + ND N III 92±29 0 07 ± 0 01 68±05 + ND 92±39 2 03 ± 0 05 129±28 + ND ND ND 0 0 43±1 0 0 0 22 0 ± 7 9 0 0 99±40 29 S-2 B-2 25 H-2 HaG3-D 404 ЗО 35 а) Ь) с) d) є) f) g) h) Контрольные trohs РВІ 101 РВІ 120 РВІ 121 I con Зрелые семена и ткани саженцев трансгенных растений табака, содержащих конструкции, изображенные на рис I, анализировали на GUS-активность Конструкции показаны на рис I Прямая (F) и обратная (R), нормальная (N) и обращенная (I) ориентация каждого фрагмента гелиантинина дана по отношению к усеченному промотору 35S CaMV Развивающиеся зерна трансгенного табака, содержащего прямые конструкции, изображенные на рис I, анализировали на GUS-активность от 8 до 24 ДПЦ с интервалами приблизительно в два дня Профили типа I, II и III определены в Примере 3 ND - не определяли в этой серии экспериментов Во всех экспериментах GUS-активности представляют собой средние значения по 4 - 10 независимо трансформированным растениям для каждой конструкции Были внесены поправки на ср кв погрешности GUS-активность в зрелых (30 ДПЦ) семенах трансгенного табака Трансгенные проростки табака аксенически культивировали на твердой среде Ткани от проростков (18 - 20ДПН) собирали и анализировали на -SUS-активность Для FL АВА-восприимчивость наблюдалась только в развивающихся семенах 12 - 18ДПЦ (см текст и Таблицу 3) Для всех других конструкций АВА-ответ предварительно определяли по GUS-экспрессии высушенных листьев с последующей иллюстрацией того, что проростки указанных растений реагируют непосредственно на экзогенную ABA Знак " + " означает индуцирование GUS-активности сверх базального уровня Знак " - " означает отсутствие GUSактивности Пример 3 Биохимическое обнаружение GUS-активности экспрессия, регулируемая в процессе развития Определяли временной профиль, сообщаемый каждой прямой конструкцией, и результаты этого определения представлены в Таблице 2 Дочерние гомозиготные растения культивировали, доводили до цветения, и семена из стручков на соответствующих стадиях анализировали на GUSэкспрессию, как описано в Примере 2 Исходя из времени начального выявления GUS-активности в развивающихся эмбрионах и количественных и качественных характеристик полученных картин экспрессии, были идентифицированы три типа профилей развития Профили Типа I обнаруживают правильную временную регуляцию, где аккумуляция GUS-начинается через 12 дней после цветения (ДПЦ) В растениях, обнаруживающих профили Типа II, GUS-активность также начинает аккумулироваться примерно через 12 ДПЦ, но достигает пика примерно через 14 ДПЦ, а затем уровни GUS-активности значительно снижаются Растения Типа N обнаруживают GUS-активность N ранее, чем через 10 дней после цветения ДПЦ, при этом пик активности достигается приблизительно через 12 ДПЦ Этот более ранний временной профиль сообщают конструкции, содержащие области URE HaG3-A, соответствующие нуклеотидам -2377- -1527 или -739- -75 Пример 4 Гистохимическая локализация GUSактивности Гистохимическое определение локализации GUS-активности осуществляли для проростков, содержащих HaG3-A- SB/R и HaG3-D-404N Образцы промывали в 50 мМ NaPO4, и инкубировали 24 часа при 37°С в ЮОмкл реакционного буфера [50мМ NaP04, pH 7,0, 2мМ 5-бромо-4-хлоро-3индолил-глюкуродида (Х- Glue), 0,1 мМ железосинеродистого калия, и 0,1 мМ железосинеродис-того калия, и 0,1 мМ железосинеродистого калия] Затем образцы наносили на предметные стекла микроскопа с 80% глицерина Проростки с HaG3-D-404N (рис 7А) и HaG3-ASB/R (рис 7В), культивированные на базальных средах, содержащих 1% сахарозы, обнаруживали различный характер экспрессии Ha-G3-fl-Nиндуцированная GUS-экспрессия обнаруживалась 31 32 от полива Растения, содержащие HaG3-D-404N и находящиеся в полном водном стрессе, быстро, за примерно 36 часов, индуцировали пик GUSактивности, который коррелировал со снижением водного потенциала (рис 8) Последующее определение GUS-активности через 24 часа выявило воспроизводимое снижение активности, даже, если растения продолжали находиться в условиях жесткого водного стресса с водным потенциалом, близким 4 бар Растения в условиях полного водного стресса восстанавливали путем орошения на 3-й день после завершения взятия проб После орошения растения быстро восстанавливали водный потенциал, который возвращался до своего дострессового уровня, а GUS-активность продолжала снижаться в течение всех последующих дней В растениях, находящихся в 1/3 стрессовых условиях (см выше) и содержащих HaG3-D-N, GUS-активность медленно увеличивалась в течение 3,5 дней по мере уменьшения водного потенциала (рис 8) Как и в случае растений в условиях полного стресса, GUS-активность начинала снижаться до восстановления водного дефицита При этом не наблюдалось ни одного случая, когда FLрастения экспрессировали GUS в неэмбриональных тканях 44217 на низких уровнях в семядолях, и на значительно более высоких уровнях в дистальних областях корней, при этом, активность вообще отсутствовала в гипокотилях На G3-A- SB /R-проростки также обнаруживали значительную GUSактивность в дистальных отделах корней и не обнаруживали активности в гипокотиле или семядолях GUS-активность гистохимически обнаруживалась на 14 день после цветения в саженцах, содержащих HaG3-D-404N, которые были культивированы в условиях водного дефицита окружающей среды на фильтровальной бумаге с неполным насыщением, при этом -GUS-активность наблюдалась, главным образом, в листьях и корнях указанных саженцев (рис 7С) Определяли характер -GUS-экспрессии саженцев, содержащих Ha-G3-A-SB/R Главная область GUS-активности в SB/R-саженцах наблюдалась в кончиках развивающихся корней (рис 7В, С) В 6 ДПЦ-саженцах, содержащих HaGS-A- SB /R, GUS экспрессировалась по всей длине удлиняющегося корня, причем максимальные уровни наблюдались в меристематическои области верхушек корней (рис 71) Гистохимическая оценка G US-активности в HaGS-A-SB/R-саженцах (14 ДПЦ) показала наличие активности во вновь образованных боковых корнях, а также сохраненную активность в меристематическои области главного корня (рис 7В) Проростки от 16 ДПЦ показывали ту же картину экспрессии (рис 7С), также высокая GUS-активность наблюдалась в корневых волосках и дистальных областях корней Пример 5 ABA - восприимчивая экспрессия В серии экспериментов, проведенных на трансгенных растениях табака, содержащих конструкции, показанные на рис 4, было идентифицировано несколько URE-областей Ha-G3-A и НаG3-D, которые оказались восприимчивыми к изменению в растениях водного потенциала (Таблица 2) Поскольку ABA, как известно, является медиатором ответа на водный дефицит, то определяли действие ABA на -GUS-экспрессию, индуцированную указанными элементами В HaG3-A были обнаружены две области (нуклеотиды от -1527 до -739 и от -739 до -75), которые индуцируют АВА-восприимчивую экспрессию в листьях зрелого трансгенного табака и в саженцах Другой АВА-чувствительный элемент был идентифицирован в URE HaG3-D (от -739 до -322) Корреляция GUS-активности в трансгенном табаке, содержащем HaG3-D-404N (прямая ориентация) с водным потенциалом, наблюдалась в течение прогрессирующей дисикации и при последующем выводе из водного стресса Поскольку HaG3-URE с полной длиной не экспрессируются ни при каких условиях за исключением периода развития семени, то растения, содержащие эти химерные GUS-конструкции, использовали в качестве негативного контроля Дочерние гомозиготные растения, содержащие каждую конструкцию, выращивали в почве Эти растения либо нормально поливали (контроль), либо содержали в условиях водного стресса, варьируя степень орошения от 1/3 количества воды, используемого для контрольного растения, вплоть до полного отказа Для того, чтобы определить является ли 404 п о - фрагмент из HaG3-D чувствительным к непосредственному воздействию ABA, диски листьев трансгенного табака, содержащего HaG3-D404N, обрабатывали ABA в течение увеличивающихся периодов времени, после чего эти диски анализировали на GUS-экспрессию После лагпериода, составляющего приблизительно 3,5 часа, обработка 10 мМ ABA давала быстрое увеличение GUS-экспрессии, аккумуляция GUS продолжалась на протяжении 8 часов, а после этого скорость аккумуляции GUS значительно снижалась (рис 9) При этом GUS-активность не наблюдалась в дисках листьев тех же растений, содержащихся в идентичных условиях, за исключением обработки ABA Аналогичным образом, диски листьев от растений, содержащих URE HaG3-A с полной длиной, не обнаруживали никакой активности на протяжении всего эксперимента Поскольку химерный ген, содержащий CaMV -35S промотор и репортерши ген [3-глюкуронидазы, является транскрипционально активным в листьях (Таблица I), то трансгенные растения, содержащие рВП21, использовали в качестве важного негативного контроля Диски листьев от растений, содержащих рВ1121, не показывали увеличения GUS-активности в ответ на воздействие экзогенной ABA на протяжении всего эксперимента (+АВА 12,6 + 3,3 пмоль 4-МУ/мкг/мин, -ABA 13,5 ± 3,6 пмоль 4-МУ/мкг/мин) Аналогичная серия экспериментов была проведена с трансгенными саженцами табака, содержащими HaG3-D-404N и Ha-G3-A-FL (рис 4) 18 ДПН-саженцы переносили на среды, содержащие 0-10 мМ ABA, и определяли GUS-активность на 1й, 2-ой и 3-ий день (Таблица 3) Саженцы, содержащие HaG3-D-404N , были восприимчивы к воздействию ABA на 1-й день при всех концентрациях ABA, тогда, как в параллельных экспериментах, HaG3-A-FL -саженцы не показали значительной 34 33 44217 индукции Индукция зависит от времени и конценобработки они были выше, чем уровни для 18 трации Максимальная индукция, 200-кратная, ДПЦ- и 24 ДПЦ-семян, обработанных или необраимела место на 2 и 3 дни при концентрации ABA ботанных ABA 18 ДПЦ-семена давали более 10 мМ (Таблица 3) Значительная индукция, 19медленный ответ на ABA, чем 14 ДПЦ-семена, кратяая и 70-кратная, наблюдалась на 3-й день однако, их уровни GUS-активности достигали знапри 0,1 мМ и 1,0 мМ ABA, соответственно чений, сравнимых с уровнями для 14 ДПЦ(+АВА)-семян, лишь на 5-й день после АВАURE HaG3-A гелиантинина с полной длиной обработки 24 ДПЦ-семена были менее восприим(FL) (от -2377 до +24) испытывали на их АВАчивы к ABA через 5 дней после АВА-обработки индуцибельноеть в развивающихся семенах СеУровни GUS-активности также варьировались в мена, содержащие регуляторную область с ползависимости от того были ли семена инкубированой длиной (FL), индуцирующую GUS-экспрессию ны лишь наодной базальной среде 14 ДПЦ(рис 4), доводили до стадии 11, 14, 18 и 24 дня семена на базальной среде обнаруживали постепосле цветения (ДПЦ) и анализировали на их спопенное увеличение GUS-активности, оцененной в собность к ответу на воздействие ABA АВА4 пМ 4-М У/семя/день индукция обнаруживалась посредством увеличения уровней GUS-активности по отношению к Полученные результаты проиллюстрировали уровням, полученным на базальной среде Полуиерархический принцип регулирования экспрессии ченные результаты систематизированы в Таблице гена гелиантинина, такой, что АВА3 АВА-восприимчивость варьировалась в зависичувствительные элементы, содержащиеся в мости от стадии развития Семена от 11 ДПЦ не HaG3-URE, функционируют только в условиях реагировали на ABA на протяжении всего экспесоответствующей программы развития Если АВАримента, тогда, как более зрелые семена обнаручувствительные элементы удалить из их соответживали чувствительность к воздействию ABA Сествующего окружения в HaG3-A- или HaG3-Dмена от 14 ДПЦ показывали быстрый ответ, URE, то это приведет к потере иерархического начиная уже с 1,5 часов, с уровнем индукции, преконтроля таким образом, что эти элементы будут вышающем базальные уровни Для 14 ДПЦ-семян, свободно реагировать на прямое воздействие обработанных ABA, эти уровни GUS-активности ABA и косвенно на дисикацию в листьях и проромонотонно увеличивались, и на 3-й день после стках трансгенного табака Таблица 3 ДПЦ DPF 10 15 20 11 14 16 17 18 19 21 23 24 27 29 35 АВА-индукция in vitro HaG3-A-FL в трансгенных семенах табака GUS-активность (пМ 4-МУ/мкг/мин) Нормальные 11 ДПЦ 18 ДПЦ 14 ДПЦ ABA 11 DPF 14DPF 18DPF ABA Normal + + + 0 0 0 ~ ~ 7±03 0 0 70 70 ~ 0 0 ~ ~ 33 15 ~ 15±03 ~ ~ 15 15 ~ ~ 57 24 ~ ~ ~ ~ 24 15 ~ ~ ~ 61 15 16±20 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 14±20 а) Трансгенные семена табака, содержащие HaG3-A-FL были собраны в указанные дни после цветения (ДПЦ), и инкубированы на лишь одной базальной среде или на базальной среде, содержащей 1 мкМ ABA GUS-активность определяли через О, 3 и 5 дней после обработки Для сравнения приводятся данные In vivo-экспрессии GUS, индуцированной HaG3 -A-FL, в развивающихся семенах (Нормальные) Пример 6 Введение признака резистентности к гербициду в растение табака 0,66 кв-ВаМ - Sail-фрагмент из родительской плазмиды pHaG3-A-2,3 (Таблица 1) сшивали его 5 -концом с Hind Ill-сайтом, а его 3 -концом с EcoRI 24 ДПЦ 24DPF + ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 16 21 24 16 16 16 сайтом Полученную кассету использовали для замены области двойного CaMV-промотора в pRPA-BL-410-конструкции (описанной во французской патентной заявке № 91 02872, поданной 5 марта 1991 ) путем переваривания указанной конструкции Hind III и EcoR I и субклонирования этой кассеты в вектор Полученная конструкция, обозначенная pRPA-ML -803, содержала в транскрипционной рамке следующие элементы регуляторний элемент гелиантинина, оптимизированный транзитный пептид (ОТП), агоА-ген, nosтерминатор Плазмиду pRPA-ML-80S переносили в штамм EHAIII robactenum tume faciens (Hood и др (1986) S Bactenol, I68, 1291) посредством тройного 36 35 44217 гектар При обработке указанной дозой глифосата скрещивания, и полученную Agrobatenum испольнетрансформированные контрольные растения зовали для трансформации дисков листьев табапогибали В противоположность этому трансфорка мированные растения оставались невредимыми и Регенерированные растения табака, высотой жизнеспособными, что свидетельствовало об их примерно 20 сантиметров, опрыскивали в условитолерантности к глифооату ях теплицы глифооатом в виде препарата ROUNDUP в дозе 0,6 кг активного ингредиента на (Xl) SEQUENCE DESCRIPTION; SCO I D К О - 1 GGATCCTCTA CCTATATATA TA1ATATATA TGAATTTTTT AAAAAAATCC СЗХЙССССТС 60 GAAAAAACGG GCCTTATGCG GAAGTCCTCC TCGCACACCT AAAGAGCCGC CCATGCTTTT 120 TAATCAAATA GATGTGCATC ATGTAGTGAT AGTTTTTACT AAAATCCATT AGTTTATAAA 180 TATTTTAAAT GTTTTTTTTT GTTTATATAA AA1ACTCCTG TATCAACTAT AATTTAACTA GCAAAAAGAC AAAAAGAAAA ГГААААААСА AAATGTCCAA 240 AAAAAAACCC TTTrGGTIRA CAAAGTCTTT 300 AGTTTGTCAT TTGAAGGAAA TTCAAACAAA AACGAACGTG GGGGCGCGGG GGTGCGGTGT TTGGTTACAA AAAGTTTT.AA 360 ATTGCCCAAA 4 20 CCTCAGGACA ^ххтГТАСАТ TTATAACTCA TTGTCTMAT ACTAAAATRC ACCAAGTCAA 4Э0 TGGGTGAAAG TTACTATCTT TTTTATTGCA ATTTCACATT АССЇТАЇТТА CTTTTGAGAA 540 AGTTATAGTC TGATCGGTrT GCGCTATTTT ТСЙ.Т&СТТАА 600 AGACGACATA AC.^ATTAAGG TTTTAGATTA AAGTATAAAA GGTCCAGGTT TGAATCTTTT ААЛ.САТТТТТ TTTTAACTTG АТСАТЛАСАД TATAACAATT 660 AAGGftGTTAT GATCTGATGG TTTGCGTTAT GTTTTCGTAC TAATTAAGGT CCCGGTTTGA 720 ATCTCTCAAA CAATATATTA TTTTTTCTTA AAAACGAATG TTGAACCGAC ACCTATTGGT TTAAAATTAA ATTTAAAAAT 78Г AACTGAGCTA САСАХГГПА 340 ATTTTGATTT GTTTTGTTAA 900 ATATTAGTAA TATTTTATTA P60 ATGCTTCAGG TTTTGTGTTA GTCTTCGTTT TTTATATGGT TTTATCAGTG 1020 TGTATTTTCT CCTAATTTAA ACATCAATAC AGCTATAACA GTCGACTATC TTAGTTAATC AAATAAATTT AGACATGCTC ACAATGGGAA AGTCG?,TGTG ТАТГТАТАТА GTGTGGTGTA CGATGACGAT TATTTAAATA ATGACGAACT TCTTGGTTGT TACTTATTGA 1030 TGTACGAAGC TGAGATGTAA CGAACCGAAC ACATATAAAT AACATTTTGG ATAAGATTAC 1140 GACTTTATTT ATCGGTTGCC ATGAAATTTA GAAGATTTGG GTTAAGACAC AACCACATAT 1200 AATGTGATGG TAAATAGCAT TTACAACTAA TGTTAATCTT TTGTTACAAA TGTTGTTAAC 3.260 TAGGCTTGAT ATGTAAAATT TTrAAAGACT ATCAGGTGTT CTTACGGTTT TACATCTAGT 1320 AAGAGJsTTAA AAAAAAAAAA GCAAGGAAAG TAAGTGTAAA GAGAGTAAAG AGAATGTAGC 1380 CftTGAXATGG CTGATTGTTC ATCACCATCC CATTTATACT TATCATCTTG ATGATGCATA 1ДЧ0 TAGACATGAT GTGTGCTACG TACCGAATTT TAACAGCTTC CCGGCGCAAC ACACGTGTAT 1500 АААТЛССАТА 1560 GATTATAAAC CAAATACGCT ACGTATAGGT GGTTATATGA TACCTATGAT GACTTGACCT TTCGTTACAC TTGAGCTGAA AAAAATAAAA TTTTTGTGTG GCCATATACA AAATGXGGCT ATAGGCGCAT ATTTTTGACG TAGCGTTftGT TAATCAGATA AATTTATTTT AGTAATATTT TATTAACATC 1680 GATTTGTTTT GTTAATGTAT TTTCTCCTAA TTTCAAGTAG ACGTGTATIT АТАТАЛТАТТ 1620 AATACATGCT TCATGTTTTG GGTT^GTCTT CGTTTTTTAT ATGGTTTTAT CAGTGGTGTA CGATGACGAT TATTTAAATA 1B0Q ATGACGGACT TCTTGGTTGT TACTTATTGA TGTACGAAGC TGAGATGTAA CGAACCGAAC ACATATAAAT 192П AACAtTTTGG ATAAGATTAC GACTTTATTT ATCGGTTGCC ATGAAATTTG GAAGACTTGG 1980 GTTAAGACAC AACCACATAT AATGTGATGG TAAATAGCAT 1TACAACTAA TGTTAATCTT 2040 TGTTGTTAAC TAGGCTTGAT ATGTA4AATT TTTAAAGACT ATATGGTGTT 2100 AAAAGCAAGG AAAGTAAGXG 2160 GTTCATCACC ATCCCA'iTTA 2220 TTATACAGAT GTAGCATGTC 5ЭВ0 GATGTCACTT CCTCCTTGAT 2340 CACCACATCA 2100 TTGTTACAAA CTTACGGOTT TACATCTAGT AAGAGATTAA TAAAGAGAGT AAAGAGAATG TACTTATCAT TAGCCATGAT CTTGATGATG CATATAGACA TCAGCTCCAA ATGGTGATCT TCTCCTGGCA CTTCTTCCAC ТАТААААССД GCTft.GTTCAC AAAAAAAAAA ATGGCTGATT AACACACTAC TAACCTCTTA AACACCTATT (2) Данные последовательности SEQ ID № 2 (1) Характеристики последовательности (A) Длина 732 пар оснований (B) Тип нуклеиновокислотный (C) Цепочечность двухцепочечная и одноце CATCCCATTC почечная (D) Топология линейная (XI) Описание послеловательности SEO ID № 2 37 38 44217 GGATCCTGTA AGAAGTGCCC AAAATGTGAG AAGTGTATT& TAACACTATA TATAATACTA 60 ЇАТААСАССА TATAAATACC GTATAACACT ATGTAACACC ATATAACACA ATATAACGCT 120 ATGTAACACT ATATAACATT ATATAACAAT ATATAACACT ATACATCTAT CAGAGACATG ISO CTATCAGACA ACCTATAGTG TTATATTTGT TATATAATGT TATATAGTGT TACATACCGT 240 TATATGGTAT TATATGGTG.T TACATATTGT TATACGTGTT TATATGGTOY TATATAGTAT 300 TATATATAGT GTTATAATAC ACTTCTCACA CTTTGGGCAC TTTTTACAGG ATCATCTACC 360 ТУГАТАТАТА TATATATATA TAAAGGATTA GGTTCAAACG TGAACAAATT CCCAAGAGTG 420 A4CTGCGTGA ACTGATCTCA GCCCTTGATT rYZ-xTGATCT 4B0 TGAGATTAAA GTGAGTGGCA TGATGGTAAT TATTTGGTTA АТТТТТТГГС ATTTAATTAA ATACAAAAAG GGTATATGTG 54С TAATTTCAAT CTTAAATTGA TTGCATAAAT CTCTCACAAA TCAAGTAATC ААТТАТСТТ*" £JO TTAAACTGAT TACATAAAXC ""CTCACAAAT CAAATCAAGG ATTAGGAAAG ATGTAACTTA 660 ATTCTAATTA CTAAAA1AAC TATTTGTTTA AATGCGATGT ACACATGTGT ATTCTGATTT 7 20 TGCCCTCTTT TTAATGTGAT GTACACATG3? GTATATCGTC TGTTTTTATG AGATCTCAGA 780 ATTTTTTTTG TATTGAATGT TGATGTACAC CTGTGAATTA CTGTACACAT ATGTACGATG B40 CTGATGCTGA GTACACATGT GTACTGTTCT ATTTATATCC AAGTACACAT GTGTAACCTT 900 GAAATATGAA AGTTACGTGG ATCTTAAAAA TCAAAATTTG AATTCI^GTG AXGAAATCTG 360 AAATAAAAAT TAAAATTGAA ATCTGGTGAT TTGTTGTTTG TTTTGATAAT TATCTTATTA 1020 ATAAATAAAC ATAATGTGGA TAATGAATTT AAATTAGGAA AGATGTAACT TAATTCAATT 1080 ATTAAAATAA TGATTTAAAT CTAATTTTTT ATATAATTAC AATCCTACCC TTAACAACTA 1140 AAAAGGAAAT CAAGGGTTCA TATCTGTTCA. CGCAGTTCAC TCTTGGSAGG TTGTTCACGC 1200 TGGAACCCTA CCCTATATAT АТАТАТДТАТ ATATATCAAA TTTTTTTAAA AAATCCCQTA 12S0 CCCCTCGAAA AAACGGGCCT TATGCGGAAG TCCTCCTCGC ACACCTAAAG AGCCGCCCAT 1320 GCTTTTGATC AAATAGTTGT AAATACTAAA ATACACCAAG TCAATGGGTG AAAGTTACTA 1380 TCTTTTTTAT TGCAATTTCA CATTACCTTA ТТГАСГГТШ AGAAAGACGA CATAACAATT 1440 AAGGAGTTAT AGTCTGATCG TTTGCGC2AT TTTTCATACT TAAGGTCCAG GTTTGAATAT 1500 TTTAAACATT ТТТТТГААСТ TGATCATAAC AATATAACAA TTAAGGAGTT ATGGTCTGAT 1560 GGTTTGCGTT AIGTrTTCGT ACTAATTAAG GTCCCGGTTT GAATCTCTCA AACAATATAT 162