Визначення ефективності антимікобактеріальної вакцинації

Реферат: Винахід стосується способу визначення ефективності рекомбінантної мікобактеріальної живої вакцини, зокрема протитуберкульозної вакцини, а також застосування набору реагентів для використання в способі. UA 112067 C2 (12) UA 112067 C2 UA 112067 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується способів та реагентів для визначення ефективності вакцини, зокрема протитуберкульозної вакцини. Щороку від туберкульозу (TB) помирає до 2 мільйонів людей [1]. Єдиною доступною протитуберкульозною вакциною є вакцинний штам Mycobacterium bovis (бацила КальметтаГерена (BCG)), яка була використана в організмі людини в перший раз в 1921 році [2]. До теперішнього часу було введено 4 мільярди доз БЦЖ, що робить її найбільш широко застосовуваною вакциною для людини в усьому світі [3]. Тим не менш, ми все ще далекі від досягнення викорінення туберкульозу. Вакцинація БЦЖ запобігає захворюванню немовлят на туберкульозний менінгіт та міліарний туберкульоз [4]. Проте захист від інших форм туберкульозу, зокрема, туберкульозу легень у підлітків і дорослих, є неповним, що підкреслюється мета-аналізом, який показує ефективність захисту у дорослих на рівні 0-80% [5]. Таким чином, вкрай необхідними є нові протитуберкульозні вакцини. Наразі, нові стратегії вакцинації проти туберкульозу в клінічних випробуваннях передбачають використання рекомбінантної БЦЖ, що замінює канонічну БЦЖ, та субодиничних вакцин і вакцин на основі вірусних векторів, що не розмножуються, для бустингу праймування БЦЖ [6, 7]. Ідентифікування імунологічних механізмів, що лежать в основі захисту, може полегшити раціональну розробку нових стратегій вакцинації для профілактики туберкульозу. Більше того, ця стратегія може виявити біомаркери, що є показовими для захисного імунітету, які могли б виявити сурогатні кінцеві точки клінічного результату в клінічних випробуваннях ефективності протитуберкульозної вакцини і тим самим знизити їх тривалість, а також полегшити випробування більшої кількості вакцин-кандидатів у паралельних випробуваннях. Для визначення таких біомаркерів були розпочаті спостережні дослідження із зосередженням уваги на новоінфікованих здорових контактерах із хворими на туберкульоз і на БЦЖ-вакцинованих немовлятах [8]. Незважаючи на широкомасштабні дослідження імунної реакції проти туберкульозу, головні елементи захисної імунологічної пам'яті досі залишаються нез'ясованими. Після вакцинації БЦЖ антиген-специфічні CD4 Т-клітини пам'яті важко виявити унаслідок малої кількості імунодомінантних антигенів. Наразі, основу найбільш широко застосовуваних біомаркерів становить підвищена частота CD4 Т-клітин, що продукують IFN-. З'являється все більше даних, що ставлять під сумнів значення IFN- як кореляту захисту при туберкульозі [9, 10]. Безсумнівно, IFN- відіграє важливу роль у захисті від MTB (мікобактерії туберкульозу) [11], але визначення лише IFN- більше не може вважатись надійним маркером захисного імунітету. Опис рекомбінантного штаму БЦЖ, що експресує домен виходу з фаголізосоми, наведений у WO99/101496, вміст якої включений до цього опису шляхом посилання. Згаданий домен виходу з фаголізосоми надає штаму можливості уникнення фагосоми інфікованих клітин-хазяїв шляхом перфорації мембрани фагосоми. Для того, щоб забезпечити кислий діапазон рН для фагосом з метою оптимальної активності уникнення фаголізосом, був розроблений рекомбінантний штам, дефіцитний з уреази. Цей штам є розкритим в заявці WO2004/094469, зміст якої включений до цього опису. + Рекомбінантний штам ureC HIy rBCG (rBCG), що експресує мембрано-перфорувальний лістеріолізин (HIy) Listeria monocytogenes і є позбавленим уреази C, індукує чудовий захист від аерогенного інфікування MTB порівняно з батьківським BCG (pBCG) в доклінічній моделі [12]. Ця генно-інженерна вакцинна конструкція успішно довела безпечність і імуногенність у фазі І клінічних випробувань (заявка на патент США № 61/384,375, зміст якої включений до цього опису шляхом посилання). У цьому дослідженні показано, що rBCG і pBCG індукують явно виражену Th1-імунну відповідь, тоді як лише rBCG додатково викликає глибоку Th17-відповідь. Спостерігався також більш ранній рекрутинг антиген-специфічних Т-лімфоцитів до легень при МТВ-інфікуванні rBCGвакцинованих мишей. Ці Т-клітини продукували велику кількість Th1 цитокінів після повторної стимуляції. Набагато краща захисна ефективність rBCG явно залежала від IL-17. Підвищене продукування IL-17 після rBCG-, але не pBCG-вакцинації, було також виявлено у здорових волонтерів на фазі І клінічних випробувань. Результати, одержані винахідниками, визначають загальний імунологічний шлях як маркер для поліпшених стратегій вакцинації проти туберкульозу, який також можна досліджувати субодиничними вакцинами-кандидатами. Предметом цього винаходу є спосіб визначення ефективності вакцини, який включає визначення Th17-імунної відповіді у вакцинованого суб'єкта, де присутність Th17-імунної відповіді є показовою для захисного імунітету у згаданого суб'єкта. Іншим аспектом цього винаходу є набір реагентів для визначення ефективності вакцини, який включає в себе щонайменше один реагент для виявлення Th17-імунної відповіді. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, згаданою вакциною є жива вакцина, зокрема клітина Mycobacterium. За варіантом здійснення цього винаходу, якому 1 UA 112067 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 віддають ще більшу перевагу, згаданою вакциною є рекомбінантна клітина Mycobacterium, яка містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує гібридний поліпептид, що містить (а) домен, здатний викликати імунну відповідь, та (b) домен виходу з фаголізосоми. Згаданий домен, здатний викликати імунну відповідь, за варіантом, якому віддається перевага, являє собою імуногенний пептид або поліпептид патогену чи його імуногенний фрагмент. За іншим варіантом здійснення цього винаходу згадана вакцина являє собою субодиничну вакцину, тобто вакцину, яка містить очищений антиген патогену або його імуногенний фрагмент, зокрема рекомбінантний антиген або його імуногенний фрагмент. За ще одним варіантом здійснення цього винаходу згаданою вакциною є вакцина, основу якої становить інактивована не піддана обробці клітина патогену або клітинна фракція. Згаданою клітиною Mycobacterium за варіантом, якому віддається перевага, є клітина M. bovis, клітина M. tuberculosis, зокрема атенуйована клітина M. tuberculosis або інших Mycobacteria, наприклад, M. microti, M. smegmatis, M. canettii, M. marinum або M. fortuitum. За варіантом, якому віддається більша перевага, згадана клітина являє собою рекомбінантну клітину M. bovis (BCG), зокрема, рекомбінантну клітину M. bovis штаму Danish підтипу Prague [43]. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається особлива перевага, згадана вакцина являє собою рекомбінантну клітину Mycobacterium, дефіцитну з уреази. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається особлива перевага, послідовність ureC клітини Mycobacterium є інактивованою (UreC), наприклад, шляхом конструювання вектора-самогубця, який містить ген ureC, зруйнований геном селекційного маркера, трансформування клітинимішені згаданим вектором і скринінгу для віднаходження позитивних на селекційний маркер клітин, які мають негативний з уреази фенотип. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, згадана клітина являє собою рекомбінантну клітину BCG штаму Danish підтипу + + Prague, яка характеризується як rBCG UreC::Hly ::Hyg . Згаданий домен, здатний викликати імунну відповідь, за варіантом, якому віддається перевага, вибраний з-посеред імуногенних пептидів або поліпептидів від M. bovis або M. tuberculosis чи їх імуногенних фрагментів, які мають довжину щонайменше 6 амінокислот, за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше 8 амінокислот, за варіантом, якому віддається найбільша перевага, щонайменше 9 амінокислот і, наприклад, до 20 амінокислот. Конкретними прикладами прийнятних антигенів є Ag85B (р30) від M. tuberculosis, Ag85B (антиген) від M. bovis БЦЖ, Ag85A від M. tuberculosis та ESAT-6 від M. tuberculosis та їх фрагменти. Згадана вакцина за варіантом, якому віддається перевага, являє собою вакцину проти мікобактеріальних інфекційних захворювань, зокрема, легеневих мікобактеріальних інфекційних захворювань, конкретніше, туберкульозу. Відповідно до способу за цим винаходом визначають Th17-імунну відповідь у вакцинованого суб'єкта. Згаданим суб'єктом за варіантом, якому віддають перевагу, є ссавець, наприклад, людина. Визначення за варіантом, якому віддають перевагу, здійснюють на біологічному зразку, який одержують від згаданого суб'єкта, при цьому цей зразок містить імунокомпетентні клітини, зокрема Т-клітини та/або NK-клітини, конкретніше, антиген-специфічні Т-клітини, наприклад, CD4 Т-клітини. Згаданим зразком може бути біологічна рідина організму або зразок тканини, наприклад, зразок крові, сироватки або плазми чи зразок легень або селезінки. Способи збирання зразків є добре відомими у цій галузі. Спосіб за цим винаходом вимагає визначення ТМ7-імунної відповіді. З цією метою перевага віддається повторному стимулюванню імуногеном імунних клітин, присутніх у зразку суб'єкта, призначеному для аналізу, та визначенню експресії цитокінів згаданими клітинами. Клітинами, призначеними для аналізу, за варіантом, якому віддається перевага, є антиген-специфічні Тклітини, за варіантом, якому віддається більша перевага, CD4 Т-клітини. Згаданий імуноген для повторного стимулювання відповідає імуногену, присутньому у вакцині (ефективність якого має бути визначена). Імуноген може бути присутнім або у формі, ідентичній формі, присутній у вакцині, або в іншій формі. Наприклад, у разі, коли вакцина містить імуногенний поліпептид, імуноген на етапі повторного стимулювання може включати імуногенний фрагмент згаданого поліпептиду або навпаки. За варіантом, якому віддається перевага, імуноген, який застосовують на етапі повторного стимулювання, являє собою очищений поліпептид або пептид. Для того, щоб перевірити ефективність протитуберкульозних вакцин, зокрема, живої протитуберкульозної вакцини, як описано вище, згаданим імуногеном, за варіантом, якому віддається перевага, може бути мікобактеріальний антиген, вибраний, наприклад, з-посеред PPD (Очищений протеїновий дериват), який являє собою гліцериновий екстракт мікобактерій, або Ag85A і Ag85B, а також інших мікобактеріальних антигенів та їх імуногенних фрагментів (наприклад, як описано вище). 2 UA 112067 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Визначення Th17-відповіді за цим винаходом може включати в себе визначення клітин, пов'язаних із Th17-відповіддю, наприклад, клітин, що продукують IL-17, за допомогою поверхневих маркерів і цитокінів, присутніх в та/або секретованих згаданими клітинами. Прикладами поверхневих маркерів є CD4, CD8, EL-23R, CCR4 та/або CCR6. Прикладами цитокінів, присутніх в та/або секретованих такими клітинами, є IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IFN- та їх комбінації. За варіантом, якому віддається перевага, згаданим цитокіном є IL-17. Такі клітини можуть бути визначені цитологічними методами, наприклад, методом сортування клітин із використанням імунологічних реагентів виявлення, таких як антитіла, специфічні до поверхневоклітинних маркерів та/або цитокіни, які можуть нести маркування, наприклад, флуоресцентну групу. За варіантом, якому віддається більша перевага, клітинами, пов'язаними з Тh17-імунною відповіддю є, наприклад, CD4 Т-клітини, які продукують і, можливо, секретують IL-17. За іншим варіантом здійснення цього винаходу визначення Тh17-імунної відповіді включає в себе визначення цитокіну, який секретується клітинами, пов'язаними з Th17-імунною відповіддю, наприклад, IL-17. Згаданий цитокін може бути визначений імунологічними методами з використанням відповідних антитіл, наприклад, антитіл проти IL-17. За способом за цим винаходом Th17-імунну відповідь визначають у відповідний час після вакцинації. Наприклад, імунну відповідь можна визначати через 20-50 днів, зокрема через 25-35 днів після вакцинації. Цей винахід також стосується набору реагентів для визначення ефективності вакцини, зокрема для застосування за способом, як описано вище. Згаданий набір реактивів включає в себе імуноген, прийнятний для повторної стимуляції імунокомпетентних клітин, присутніх у зразку від вакцинованого суб'єкта. Окрім того, набір реактивів включає в себе щонайменше один реагент, прийнятний для виявлення маркера Th17-імунної відповіді, як описано вище. Згадані реагенти можуть, наприклад, бути вибрані з-посеред реактивів для цитологічного та/або імунологічного виявлення, наприклад, антитіл проти клітинних маркерів, характерних для клітин, пов'язаних з Th17-імунною відповіддю та/або імунологічного реагенту, специфічного для цитокінів, пов'язаних з Тh17-імунною відповіддю, зокрема IL-17 та/або IL-22. Згадані ділянки для виявлення можуть нести виявлювані групи, наприклад, групи флуоресцентного мічення. Нижче цей винахід докладніше описаний за допомогою наведених нижче Фігур і Прикладів. Підписи до Фігур Фіг. 1: МТВ-навантаження у мишей дикого типу. Підшкірна імунізація захищає від інфікування MTB впродовж 90 днів після імунізації. (А). Бактеріальні навантаження на вакциновані і невакциновані групи на 7 день після інфікування. (В) є порівнянними. Визначення КУО (CFU) в легенях і селезінці після аерозольного інфікування у дозі 400 КУО MTB. Серцева частка легень (приблизно 71/10 цілого органа) або половина селезінки була гомогенізована; решта матеріалу була використана для in vitro рестимуляційних аналізів. Статистичну значущість визначали за критерієм Манна-Уітні з двосторонніми значеннями P. *, P