Рекомбінантний аденовірусний вектор, фармацевтична композиція, що його містить, та набір для зменшення проліферації пухлинних клітин

1. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный аденовирусный вектор экспрессии, который имеет делецию последовательностей, кодирующих Е1а, E1b и белок IX, причем делеция расположена от нуклеотида 357 до нуклеотида 4020 и содержит ген, кодирующий чужеродный белок. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что аденовирусный вектор дополнительно содержит делецию несущественной последовательности ДНК ранней области 3 и/или ранней области 4. 3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что аденовирусный вектор дополнительно содержит делецию размером до 40 нуклеотидов в сигнале полиаденилирования белка IX, расположенную в сторону 3'-конца от делеций нуклеотидов с 357 по 4020, а также содержит чужеродную молекулу ДНК, кодирующую сигнал полиаденилирования. 4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что аденовирус относится к группе С и выбран из серотипов 1, 2, 5 или 6. 5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что ген, кодирующий чужеродный белок, представляет собой молекулу ДНК размером до 2,6 килобаз. 2 (19) 1 3 70909 4 мочевого пузыря, опухоли ретикулоэндотелиальлеотида 4020 и содержит ген, кодирующий чуженых тканей, опухоли Вилма, астроцитомы, глиобродный белок. ластомы, нейробластомы, карциномы яичников, 21. Вектор по п.20, отличающийся тем, что дополостеосаркомы, рака почки. нительно содержит делецию несущественной по15. Фармацевтическая композиция по любому из следовательности ДНК ранней области 3 и/или пп.1-9, отличающаяся тем, что она дополнительранней области 4. но содержит один или более фармацевтически 22. Вектор по п.20 или 21, отличающийся тем, что приемлемых носителей и предназначена для индополнительно содержит делецию размером до гибирования пролиферации опухоли у животных. 40 нуклеотидов, расположенную в сторону 3'16. Фармацевтическая композиция по любому из конца от делеции с 357 по 4020 нуклеотид, а такпп.1-9, отличающаяся тем, что она дополнительже содержит чужеродную молекулу ДНК, кодино содержит один или более фармацевтически рующую сигнал полиаденилирования. приемлемых носителей и эффективное количест23. Вектор по любому из пп.20-22, отличающийся во метаболита тимидинкиназы или его функциотем, что аденовирус относится к группе С и вынального эквивалента и предназначена для умебран из серотипов 1, 2, 5 или 6. ньшения пролиферации опухолевых клеток. 24. Вектор по любому из пп.20-23, отличающийся 17. Фармацевтическая композиция по п.16, отлитем, что ген, кодирующий чужеродный белок, чающаяся тем, что метаболит тимидинкиназы представляет собой молекулу ДНК размером до представляет собой ганцикловир или 62,6 килобаз. метоксипурин арабинонуклеозид или их функцио25. Вектор по любому из пп.21-23, отличающийся нальный эквивалент. тем, что ген, кодирующий чужеродный белок, 18. Фармацевтическая композиция по п.16 или 17, представляет собой молекулу ДНК размером до отличающаяся тем, что опухолевые клетки пред4,5 килобаз. ставляют собой гепатоцеллюлярную карциному. 26. Вектор по любому из пп.20-25, отличающийся 19. Набор для уменьшения пролиферации опухотем, что ген кодирует чужеродный белок, выбранлевых клеток, содержащий фармацевтическую ный из группы, состоящей из функционального композицию по любому из пп.1-9, метаболит тибелка или его биологически активного фрагмента. мидинкиназы или его функциональный эквива27. Вектор по п.26, отличающийся тем, что чужелент, один или более фармацевтически приемлеродный белок представляет собой белок супресмых носителей. сии опухолей или его биологически активный фра20. Рекомбинантный аденовирусный вектор эксгмент. прессии, который имеет делецию последователь28. Вектор по п.26, отличающийся тем, что чуженостей, кодирующих Е1а, E1b и белок IX, причем родный белок представляет собой суицидный беделеция расположена от нуклеотида 357 до нуклок или его функциональный эквивалент. Для образования рекомбинантных аденовирусов, применимых в генотерапии, необходимо использовать клеточную линию, в которой по "транс" типу синтезируются продукты вирусных генов Е1 области, делетированных у исходных вирусов. В настоящее время доступна единственная клеточная линия 293, первоначально описанная в 1977 Graham с соавт. Клетки линии 293 содержат приблизительно 12% (4,3кб) левой части генома аденовируса типа 5 (Aiello,1979; Spector, 1983). Аденовирусные векторы, исследованные на настоящий момент для целей генной терапии, обычно имеют делеции генов Ad2 или Ad5, расположенные от точки, отстоящей на 400кб от 5'конца вирусного генома до точки, отстоящей приблизительно на 63,3кб от 5'-конца, с общей делецией области Е1 (2,9кб). Таким образом, существуе т ограниченная область гомологии приблизительно в 1кб между последовательностями ДНК рекомбинантного вируса и ДНК Ad5 в клеточной линии. Данная гомология определяет область потенциальной рекомбинации между вирусными и клеточными аденовирусными последовательностями. Такая рекомбинация приводит к образованию вируса фенотипически дикого типа, несущего область Ad5 E1 из клеток 293. Повидимому, именно такое рекомбинационное собы тие обусловливает частое обнаружение аденовируса дикого типа в препаратах рекомбинантного вируса. Кроме того, было прямо показано, что такая рекомбинация является причиной контаминации вирусом дикого типа рекомбинантного вируса Ad2/CFTR-1, созданного на основе Ad2 (Rich et al.,1993). В силу высокой степени гомологии последовательностей в подгруппе аденовирусов типа С, подобная рекомбинация более вероятна, если для создания вектора использован любой аденовирус группы С (типы 1, 2, 5, 6). При мелкомасштабном производстве рекомбинантных аденовирусов проблема контаминации вирусом дикого типа может быть решена процедурой отбора, при которой контаминированные партии вируса просто отбрасываются. При увеличении масштабов культивирования для нужд генотерапии повышается вероятность загрязнения каждой отдельной партии вируса вирусом дикого типа и возрастают трудности получения неконтаминированных препаратов рекомбинантного вируса. В текущем году будет диагностировано более миллиона случаев первичного рака, а количество смертей, обусловленных онкологическими заболеваниями, достигнет полумиллиона (Американ 5 70909 6 ское Противораковое Общество, 1993). Мутации ласти Е1, необходимой для репликации, на ген, гена р53 являются наиболее частым генетическим предназначенный для переноса. Аденовирус не повреждением, ассоциированным с опухолями интегрирует с геномом клеток человека и тем сачеловека, они встречаются в 50-60% опухолей мым значительно снижается риск инсерционного человека (Hollstein et al.,1991; Bartek et al., 1991; мутагенеза, возможного при использовании ретLevine, 1993). Целью генотерапии р53ровирусных и аденоассоциированных (AAV) векдефицитных опухолей является, например, вветоров. Отсутствие стабильной интеграции повыдение нормальной функциональной копии гена шает безопасность еще и за счет того, что эффект р53 дикого типа для восстановления контроля перенесенного гена является временным, поклеточной пролиферации. Р53 играет ключевую скольку экстрахромосомная ДНК будет утрачироль в клеточном цикле, останавливая рост с тем, ваться по мере деления нормальных клеток. Стачтобы могли произойти репарация или апоптоз в бильный рекомбинантный аденовирус с высоким ответ на повреждение ДНК. Недавно было покатитром может быть получен в количествах, недосзано, что р53 дикого типа является необходимым тижимых в случае ретровирусных или AAV вектокомпонентом системы апоптоза, индуцируемого ров, что создает возможность для лечения больоблучением или лечением некоторыми химиотешого числа больных. Кроме того, аденовирусные рапевтическими препаратами (Lowe et al.,1993, А векторы обеспечивают высокоэффективный переи В). Поскольку мутации р53 с высокой частотой нос генов in vivo в разнообразные опухолевые обнаруживаются в опухолях человека, вероятно, клетки и ткани. Так, например, было показано, что что эти опухоли стали устойчивыми к химио и раперенос генов при помощи аденовирусов имеет диотерапии в силу утраты р53 дикого типа. "Доссущественное значение при генотерапии таких тавка" функционального р53 в эти опухоли с высозаболеваний как цистофиброз (Rosenfeld et кой вероятностью сделает их чувствительными к al.,1992; Rich et al., 1993) и дефицит альфа-1апоптозу, обычно связанному с повреждением антитрипсина (Lemarchand et al.,1992). Хотя в наДНК, индуцированным облучением или химиотестоящее время используются и альтернативные рапией. методы переноса генов, например катионные комОдним из критических моментов в успешной плексы липосомы/ДНК, ни один из этих методов терапии заболеваний человека при помощи геновпока не является столь же эффективным, как песупрессоров опухолей является возможность возренос генов с помощью аденовирусов. действия на значительную долю опухолевы х клеКак и в случае дефектных по р53 опухолей, ток. С этой целью на различных опухолевых моцелью генотерапии других опухолей является делях широко применяли ретровирусные векторы. восстановление контроля над пролиферацией Например, для лечения опухолей печени примеклеток. При дефиците р53 введение функционение ретровирусных векторов оказалось малонального гена восстанавливает контроль над клеэффективным, поскольку с и х помощью не удаваточным циклом и делает возможной гибель клеток лось достигуть высокого уровня переноса генов, путем апоптоза под действием терапевтических необходимого для генотерапии in vivo (Huber, B.E. препаратов. Аналогично, генотерапия в равной et al., 1991; Caruso Μ. et al., 1993). степени может быть основана на манипуляциях с С целью создания более длительного источдругими генами - супрессорами опухолей, которые ника продукции вируса исследователи попытались могут применяться независимо или в сочетании с преодолеть проблему низкой частоты переноса терапевтическими препаратами для контроля клегенов с помощью прямой инъекции в солидные точного цикла опухолевы х клеток и/или индукции опухоли упаковочных клеток, продуцирующих ретгибели клеток. Кроме того, гены, которые не кодировирусные векторы (Caruso, Μ. et al., 1993; Ezруют белки - регуляторы клеточного цикла, но неzidine, Z.D. et al., 1991; Culver, K.W. et al., 1992). посредственно вызывают гибель клеток, например Однако, данный подход оказался неприемлемым "суицидные" гены или гены, кодирующие токсичдля лечения больных, поскольку в ответ на ввеные для клетки белки, также могут быть использодение упаковочных клеток развивалась воспаливаны в генотерапевтических процедурах для остельная реакция. тановки клеточного цикла в опухолевых клетках. Другим недостатком ретровирусных векторов Независимо от того, какой ген использован является их потребность в делящихся клетках для для восстановления контроля над клеточный цикэффективной интеграции и экспрессии перенелом, теоретические предпосылки и практическая сенного рекомбинантного гена (Hubner, В.Ε., значимость такого подхода остаются неизменны1991). Стабильная интеграция ретровирусного ми. А именно: необходимо получить высокую эфгенома в существенный ген клетки-хозяина может фективность переноса генов для экспрессии терапривести к возникновению и наследованию разпевтических количеств рекомбинантного продукта. личных патологий. Для успеха генотерапевтического подхода важен Рекомбинантные аденовирусы имеют сущестправильный выбор вектора, обеспечивающего венные преимущества по сравнению с ретровивысокую эффективность переноса генов с минирусными векторами и с другими методами перемальным риском для пациента. носа генов (см. обзор Siegfried, 1993). Никогда не Таким образом, существует потребность в было показано, что аденовирусы способны вызывекторах и методах, обеспечивающих высокую вать опухоли у человека и их вполне безопасно эффективность переноса генов и высокий уровень использовали в качестве живых вакцин (Straus, экспрессии белков, которые были бы достаточно 1984). Дефектные по репликации рекомбинантные безопасны для генотерапевтических процедур. аденовирусы могут быть получены заменой обНастоящее изобретение отвечает указанным це 7 70909 8 лям и, кроме того, предоставляет ряд дополнилиниях человека, инфицированных вирусами тельных преимуществ. A/M/N/53 и A/C/N/53. Клетки девяти различных На Фиг.1(A, B) представлен заявленный в наопухолевы х линий инфицировали или контрольстоящем изобретении аденовирусный вектор. ным аденовирусом А/М (-х-х-), или экспрессируюСборку конструкта производили, как показано на щими р53 A/M/N/53 (- - -) или A/C/N/53 (-о-о-) с Фиг.1. Полученный вирус имеет 5'-концевую делевозрастающей множественностью инфекции, как цию аденовирусных последовательностей, пропоказано на фигуре. Для каждой клеточной линии стирающуюся от н уклеотида 356 до нуклеотида приведен тип опухоли и статус р53 (wt - дикий тип; 4020 и устраняющую гены Е1а и Е1b, а также все null- белок не экспрессируется; mut - экспрессирукодирующие последовательности белка IX, оставется мутантный белок). Спустя 72 часа после заляя интактным общий сайт полиаденилирования ражения определяли синтез ДНК, как это описано генов E1d и pIX, что позволяет использовать его ниже в Эксперименте No.ll. Результаты приведены для терминации транскрипции любого желаемого для трех измерений для каждой дозы (среднее +/гена. стандартное отклонение) и представлены как проНа Фиг.2(A, B, C, D) приведена аминокислотцент контроля со средой в зависимости от множеная последовательность р110RB. ственности инфекции. Клетки Н69 тестировали На Фиг.3(A, B, C, D) представлена последоватолько с вирусами А/М и A/M/N/53. тельность ДНК, кодирующей белок-супрессор реНа Фиг.8 представлена туморогенность клеток тинобластомы. Saos-2, инфицированных р53, для голых мышей. На Фиг.4 схематически представлены рекомКлетки Saos-2 инфицировали или контрольным бинантные конструкты р53/аденовирус, заявленвирусом А/М или р53-рекомбинантом A/M/N/53 с ные в настоящем изобретении. Р53-рекомбинанты множественностью инфекции 30. Обработанные основаны на Ad5, у которого область E1 (нуклеоклетки вводили подкожно в бок голым мышам и тиды 360-3325) была заменена на полноразмердважды в неделю в течение 8 недель определяли ную (1.4кб) кДНК р53. При этом экспрессиия р53 размеры опухолей (как описано в Эксперименте направлялась промотором Ad2 MLP (А/М/53) или II). Результаты выражали как зависимость размепромотором цитомегаловируса человека (CMV) ра опухоли от дней, прошедших с момента им(А/С/53), за которыми следовала трехчленная липлантации опухолевых клеток как для контрольдерная кДНК Ad2. Контрольный вирус А/М имел те ных А/М-инфицированных (-х-х-) клеток, так и для же делеции генома Ad5, что и вирус А/М/53, но не A/M/N/53-инфицированных клеток (- - -). Границы имел 1.4кб-вставки кДНК р53. Оставшиеся послеошибок отражают средний размер опухолей (+/довательности Е1b (705 нуклеотидов) делетиростандартное отклонение) для каждой группы из 4вали для получения конструктов A/M/N/53 и х животных для каждой временной точки. A/C/N/53 с делецией по белку IX. Данные констФиг.9 иллюстрирует экспрессию rAd/p53 РНК в рукты также имели 1.9кб Хbа l-делецию в области опухолях. Голым мышам подкожно вводили клетки Е3 аденовируса типа 5. Н69 (SCLC) и в течение 32 дней позволяли разФиг.5А и 5В иллюстрируют экспрессию белка виться опухолям, которые к этому времени достир53 в опухолевых клетках, инфицированных виругали размеров около 25-50мм 3. Затем случайно сами А/М/53 и А/С/53. Фиг.5 А: клетки Saos-2 (осотобранным мышам вводили перитуморально по теосаркома) были заражены с указанной множе2x109 бляшко-образующи х единиц или контрольственностью инфекции вирусом А/М/53 или ного вируса А/С/бетагал или вируса А/С/53. На 2-й вирусом А/С/53 и подвергнуты анализу спустя 24 и 7-й дни после инъекции опухоли вырезали и из часа после заражения. Анти тела рАЬ 1801 к р53 каждого образца опухоли выделяли полиА РНК. использовали для окраски иммуноблотов образПроводили РТ-ПЦР с равными количествами РНК цов, уравненных по общей концентрации белка. В и с праймерами, специфичными к мРНК рекомбикачестве маркера использовали эквивалентные по нантного р53. ПЦР-амплификацию проводили в белку образцы экстракта клеток SW480, которые течение 30 циклов при 94°С 1мин., 55°С 1.5мин., экспрессируют мутантный р53 в больших количе72°С 2мин., и окончательное наращивание заниства х. "О" под заголовком "А/С/53" означает псевмало 10мин. при 72°С. Использовали термосайкдоинфекцию, и данный трек содержит лизат необлер Omnigen (Hybaid). Для ПЦР использовали работанных клеток Saos-2. Фиг.5В: клетки следующие праймеры: 5'трехчленная лидерная гепатоцеллюлярной карциномы Hep B3 заражали кДНК (5'-CGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTC-3') вирусом А/М/53 или вирусом А/С/53 с указанной и 3'р53 праймер (5'-TTCTGGGAAGGGAC AGAAGAмножественностью инфекции и анализировали, 3'). На линиях 1, 2, 4 и 5 представлены образцы из как описано в разделе "А". Стрелка указывает по- обработанных р53 опухолей, полученные, как ложение белка р53. показано, на 2-й или 7-й дни. На линии 3 и 8 были На Фигурах 6А-6С показано зависимое от р53 нанесены образцы из опухолей, обработанных изменение морфологии клеток Saos-2. Субконбета-гал. Линии 7, 8 и 9 являются соответственфлюэнтные клетки Saos-2 (1x105 клеток/10см чашными повторами линий 4, 5 и 6, но амплификацию ку) оставляли неинфицированными (А), инфиципроводили с праймерами актина, чтобы удостоверовали с множественностью 50 контрольным риться в одинаковой загрузке. На линии 10 привевирусом А/М (В) или вирусом А/С/53 (С). Клетки ден положительный контроль с плазмидой, софотографировали спустя 72 часа после заражедержащей трехчленник/р53. ния. На Фиг.10А и 10В показаны подавление опуНа Фиг.7(A-I) показано зависимое от р53 ингихолей in vivo и увеличение времени выживания бирование синтеза ДНК в опухолевых клеточных под действием A/M/N/53. Голым мышам подкожно 9 70909 10 вводили клетки Н69 (SCLC) и в течение 2-х недель gal), содержащего делецию области Е3 (Wills et давали возможность развиться опухолям. Дважды al., 1994). В полученных вирусах нуклеотиды 360в неделю мышам перитуморально вводили или 4021 вируса Ad5 заменены или промотором CMV просто буфер (—), или контрольный аденовирус и трехчленной лидерной кДНК (TPL) или промотоА/М (-х-х-), или вирус A/M/N/53 (- - -) (доза обоих ром/энхансером АФП, направляющими экспресвирусов составляла 2 χ 109 бое на инъекцию, всесию гена HSV-1 ТК или гена CAT. Полученные го 8 доз). Размеры опухолей определяли дважды рекомбинантные аденовирусы обозначены соотв неделю и объем опухолей оценивали, как это ветственно ACNTK, AANTK и AANC AT.описано в Эксперименте No.II. А) Размер опухолей Фиг.13(A, B) демонстрирует специфичность в случае введения каждого вируса ставили в завипромотора при экспрессии CAT в составе рекомсимость от времени (число дней), прошедшего с бинантных аденовирусных векторов. Два миллиовведения клеток Н69. Границы ошибок отражают на клеток (2´106) указанной линии инфицировали средний размер опухолей (+/- стандартное отклос множественностью инфекции 30 или 100 рекомнение) для каждой группы из 5-ти животных. бинантным аденовирусом AANC AT или оставляли Стрелки указывают дни введения вируса. В) Принеинфицированными (UN). Клетки Hep G2 и Hep ведена доля выживших мышей для каждой группы 3B экспрессировали АФП, тогда как остальные в зависимости от времени, прошедшего после клетки - не экспрессировали. Через три дня клетки введения клеток Н69, обработанных только буфесобирали, концентрацию белка в клеточных лизаром (—), контрольным вирусом А/М (.. ... ...) или тах выравнивали, и определяли активность CAT, вирусом A/M/N/53 (____). как это описано ниже в разделе "Методы". Равное На Фиг.11А - 11С приведены карты рекомбичисло неинфицированных клеток служило контронантных плазмидных конструктов. Конструировалем фоновой активности CAT, при том что 14Сние плазмид проводили как описано ниже. Жирхлорамфеникол (только 14С) и экстракт стабильными линиями в конструктах обозначены ной клеточной линии В21, экспрессирующей CAT, представляющие интерес гены, а жирным шрифслужили отрицательным и положительным контом обозначены сайты рестрикции, которые истролями соответственно. Указан процент конверпользованы для соединения фрагментов с полусии ацетил-СоА, при этом видно, что экспрессия чением плазмид, как это указано стрелками. На CAT ограничена клетками, экспрессирующими Фиг.11А показано конструирование плазмиды АФП. pACNTK путем субклонирования гена HSV-TK в На Фиг.14(A, B) показан эффект обработки полилинкер вектора клонирования, с последуюTK/GC V клеток гепатоцеллюлярных линий и завищим выделением гена ТК с желаемыми концами симость данного эффекта от специфичности продля клонирования в вектор pACN. Вектор pACN мотора. Клетки линий Hep-G2 (АФПсодержит аденовирусные последовательности, положительная) и HLF (АФП-отрицательная) иннеобходимые для рекомбинации in vivo, приводяфицировали в течение ночи одним из следующих щей к образованию рекомбинантного аденовируса вирусов: ACNTK [- -], AANTK [- -] или контрольным (см. Фиг.12). На Фиг.11В приведено конструироваACN [--] с множественностью инфекции, равной ние плазмиды pAANTK, начинающееся с ПЦР30, а затем обрабатывали единичной дозой ганамплификации фрагментов, кодирующих эн хансер цикловира в указанной концентрации. Пролифе(AFP-E) и промотор (AFP-P) гена альфарацию клеток контролировали, добавляя 3Нфетопротеина (АФП), с последующим субклонитимидин приблизительно за 18 часов до сбора рованием их в несколько этапов в конечную плазклеток. Включение 3Н-тимидина в клеточные нукмиду, где промотор и энхансер АФП находятся леиновые кислоты измеряли через 72 часа после "выше" гена HSV-TK, за которым следуют аденозаражения (TopCount, Packard) и выражали в провирусные (Ad2) последовательности, необходицентах (среднее +/- среднее отклонение) по отномые для рекомбинации in vivo, приводящей к обшению к необработанному контролю. Результаты разованию рекомбинантного аденовируса. На указывают на неизбирательное дозозависимое Фиг.11С показано конструирование плазмиды подавление пролиферации под действием констpAANCAT, начинающееся с выделения из комрукта с CMV-промотором, притом, что ген ТК под мерчески доступной плазмиды гена хлорамфениконтролем АФП-промотора избирательно подавколацетилтрансферазы (CAT) с последующим ляет клетки Hep-G2. субклонированием его в плазмиду pAAN Фиг.15 иллюстрирует цитотоксичность ACNTK (см.выше) с получением конечной плазмиды в комплексе с ганцикловиром для клеток гепатоpAANCAT, в которой транскрипция гена CAT, нацеллюлярной карциномы (НСС). Клетки HLF заходящегося в окружении аденовирусных последоражали с множественностью инфекции 30 вирувательностей, направляется промотосом ACNTK [-×-] или контрольным вирусом ACN [ром/энхансером АФП. -], а затем обрабатывали ганцикловиром в укаНа Фиг.12 приведены схематические карты занных дозах. Спустя 72 часа после обработки рекомбинантных аденовирусов ACNTK, AANTK и анцикловиром колориметрически определяли коAANCAT. Для получения рекомбинантных аденоличество лактатдегидрогеназы (LDH), высвобожвирусов из плазмид, приведенных на Фиг.11, 4 денной в клеточный супернатант. Приведен грачасти (20мкг) каждой из плазмид pACNTK, фик зависимости количества LDH (среднее +/pAANTK или pAANCAT были линеаризованы рестандартная ошибка) в зависимости от концентрастриктазой EcoRI и котрансфицированы с 1-й чации ганцикловира для двух обработанных вирусом стью (5мкг) большого фрагмента рестрицировангрупп. ного СІаІ рекомбинантного аденовируса (rACbetaНа Фиг.16А и 16В показан эффект ACNTK в 11 70909 12 комплексе с ганцикловиром на сформировавшиения основных методик, используемых в ся гепатоцеллюлярные опухоли (НСС) у голых настоящем изобретении. См., например, Sambrook мышей. Самкам голых мышей подкожно в бок et al., (1989), а также приведенные в этой книге ссылки. Эта книга и другие цитированные публивводили десять миллионов (1´107) клеток Hep 3В кации включены в текст настоящего описания в и в течение 27 дней давали возможность сформикачестве ссылок. роваться опухолям. Затем мышам интратумоВ противоположность известному из уровня рально или перитуморально вводили вирус техники, в настоящем изобретении заявлено исACNTK [-·-] или контрольный вирус ACN [--] пользование рекомбинантных аденовирусов, (1´109 инфекционных единиц в объеме 100мкл) имеющих делеции в гене белка IX, что приводит к через день, всего три дозы (указаны стрелками). снижению риска контаминации вирусом дикого Инъекции ганцикловира (100мг/кг, интраперитонетипа при получении вирусных препаратов для диально) начинались 24 часа спустя после первого агностических и терапевтических целей, таких как введения вируса и продолжались в течение 10 генотерапия. Термин "рекомбинант" означает видней. русное потомство, сформированное в результате На Фиг.6А приведен график зависимости разгенно-инженерных манипуляций. Данные делеции мера опухолей в случае каждого вируса от колимогут удалять дополнительно 500-700 пар осночества дней, прошедших после заражения (средваний из последовательностей ДНК, в норме принее +/- средняя обшибка). На Фиг.6В - показан сутствующи х в обычных Е1-делетированных вируграфик зависимости среднего веса тела для кажсах (возможны меньшие, не столь желательные дой группы животных, обработанных вирусом, в делеции частей гена pIX, которые также включены зависимости от числа дней, прошедших с момента в объем настоящего изобретения) и доступны для заражения. рекомбинации с последовательностями Ad5, инДля уменьшения частоты контаминации адетегрированными в геном клеток 293. Рекомбиновирусом дикого типа желательно понизить спонантные аденовирусы, основанные на любом собность аденовируса или клеточной линии к репредставителе группы С, серотипа 1, 2, 5 и 6, комбинации. Например, аденовирус из группы, включены в объем настоящего изобретения. Данобладающей низкой гомологией с вирусами групным изобретением также защищен рекомбинантпы С, может быть использован для конструированый вирус, основанный на гибриде Ad2/Ad5, котония рекомбинантных вирусов с незначительной рый обеспечивает экспрессию кДНК р53 человека предрасположенностью к рекомбинации с Аd5под контролем главного позднего промотора адепоследовательностями в клетках 293. Однако, новируса типа 2. Этот конструкт был собран, как альтернативно, снижение частоты рекомбинации показано на Фиг.1. Полученный вирус несет 5'между вирусными и клеточными последовательделецию аденовирусных последовательностей с ностями может быть достигнуто за счет увеличе357-го по 4020-й нуклеотиды, и в нем удалены ния размера делеции в рекомбинантном вирусе и, гены Е1а и Е1b, также как и все кодирующие последовательно, уменьшения протяженности обследовательности белка IX. При этом оставлен щей последовательности между ним и Аd5-генами интактным сайт полиаденилирования, общий для клеток 293. генов Е1b и белка IX, что позволяет терминироДелеции, лежащие на расстоянии 3,5кб от 5'вать транскрипцию любого желаемого гена. Альконца аденовирусного генома, могут затрагивать тернативно, делеция может быть увеличена на 30ген аденовирусного белка IX и их присутствие в 40 пар оснований, что не влияет на соседний ген аденовирусном векторе не может считаться желабелка IVa2, хо тя в данном случае требуется экзотельным. генный сигнал полиаденилирования для терминаУ аденовирусов ген белка IX кодирует минорции транскрипции генов, введенных в рекомбиный компонент наружного аденовирусного капсинантный вирус. Исходный вирус с данной да, который стабилизирует девятичленные гексоделецией легко размножается в клетках 293 без ны, составляющие в основном вирусный капсид признаков контаминации вирусом дикого типа и (Stewart, 1993). Исследования делеционных мунаправляет сильную экспрессию р53 с транкриптантов аденовирусов первоначально дали осноционного блока, введенного в сайт делеции. вания считать белок IX не-необходимым компоЕмкость рекомбинантных вирусов, имеющих нентом аденовируса, хотя его отсутствие было описанную выше делецию гена белка IX, составассоциировано с увеличенной по сравнению с ляет около 2,6килобаз. Это достаточно для больвирусом дикого типа термолабильностью (Colby шинства генов, включая кДНК р53. Емкость вектоand Shenk, 1981). Недавно было обнаружено, что ров может быть повышена путем введения в белок IX необходим для упаковки полноразмерной аденовирусный "скелет" других делеции, напривирусной ДНК в капсиды и что в отсутствие этого мер, делеции в ранних областях 3 или 4 белка в качестве рекомбинантных вирусов могут (см.Graham and Prevec, 1991). Например, может размножаться только те, которые содержат геном быть использован аденовирусный "скелет" с депо меньшей мере на 1кб меньше, чем у вир уса лецией 1,9кб не-необходимых - последовательнодикого типа (Ghosh-Chooudhury et al.,1987). С учестей в ранней области 3. С такой дополнительной том указанных ограничений делеции белка IX не делецией емкость вектора возрастает приблизирассматривались при конструировании аденовительно до 4,5килобаз, что достаточно для больрусных векторов. шинства крупных кДНК, включая кДНК генаВ данной заявке приведены ссылки на стансупрессора ретинобластомы. дартные учебники молекулярной биологии, котоВ настоящем изобретении описан рекомбирые содержат определения и способы выполне 13 70909 14 нантный аденовирусный вектор, характеризуюпримерно на 4000 пар оснований от 5'-конца. В щийся полной или частичной делецией ДНК адедругом, отдельном воплощении изобретения реновирусного белка IX, и имеющий ген, кодируюкомбинантный аденовирусный вектор экспрессии щий чужеродный белок, или его функциональный может иметь также дополнительную делецию нефрагмент или мутант. Данные векторы применинеобходимых последовательностей ДНК аденовимы для безопасного рекомбинантного получения руса в ранней области 3 и/или 4 и/или делецию диагностических и терапевтических полипептидов последовательностей ДНК аденовируса, обознаи белков, и, что более важно, для введения генов чаемых как Е1а и Е1b. В данном случае чужеродпри генотерапии. Так, например, представленный ный ген может представлять молекулу ДНК разв настоящем изобретении аденовирусный вектор, мером до 4.6килобаз. может содержать чужеродный ген, направляющий В другом воплощении изобретения вектор экспрессию белка, который участвует в регуляции имеет делецию размером до сорока нуклеотидов, клеточного цикла, такого как р53, Rb, или митозин, расположенную к 3'- концу по отношению к делеили белка, индуцирующего гибель клеток, такого ции Е1а и Ε1b и pIX, а также в состав вектора как кодируемый обычным "суицидным" геном тивключена чужеродная молекула ДНК, кодирующая мидинкиназы. (Последний должен использоваться сигнал полиадефилирования, расположенная тав сочетании с метаболитом тимидинкиназы для ким образом по отношению к чужеродному гену, достижения эффекта). В представленных в начтобы регулировать его экспрессию. стоящем изобретении векторах могут быть исСогласно целям настоящего изобретения репользованы любые кассеты экспрессии. Под "каскомбинантный аденовирусный вектор может быть сетой экспрессии" подразумевается молекула получен из группы аденовирусов дикого типа, сеДНК, включающая промотор/энхансер транскрипротипов 1, 2, 5 или 6. ции, например, такой, как промотор/энхансер циВ одном из воплощений изобретения рекомтомегаловируса (CMV), чужеродный ген, и, как в бинантный аденовирусный вектор экспрессии некоторых описанных ниже случаях, сигнал полиимеет в качестве чужеродного гена ген, кодируюаденилирования. Термином "чужеродный ген" щий функциональный белок-супрессор опухолей обозначена молекула ДНК, не представленная в или его биологически активный фрагмент. Термин нужной ориентации и в нужном положении в ге"функциональный" по отношению к генамномной ДНК аденовируса дикого типа. Чужеродсупрессорам опухолей означает гены-супрессоры ный ген может представлять собой молекулу ДНК опухолей, которые кодируют белки-супрессоры размером до 4,5килобаз. "Вектор экспрессии" озопухолей, которые в свою очередь эффективно начает вектор, обеспечивающий экспрессию подавляют превращение нормальных клеток в вставленных последовательностей ДНК при наопухолевые. Функциональные гены могут вклюращивании в подходящих клетках-хозяевах, дручать, например, обычные гены дикого типа и могими словами, белок или полипептид, кодируемый дифицированные нормальные гены, которые соданной ДНК синтезируется в данных клетках. Рехраняют свою способность кодировать комбинантный аденовирусный вектор экспрессии эффективные белки-супрессоры опухолей, а такможет содержать часть гена, кодирующего, адеже другие противоопухолевые гены, такие как коновирусный белок IX, притом, что биологически дирующие "суицидный" белок или токсин. активный белок IX или его фрагмент не продуциАналогично, термин "нефункциональный" исруются. Примером такого вектора является вектор пользуется в данном контексте как синоним терэкспрессии, рестрикционная карта которого примина "инактивированный". Нефункциональные ведена на Фиг.1 или 4. или дефектные гены могут возникнуть в результаВ заявленном в настоящем изобретении векте различных событий, включая, например, точечторе могут быть также использованы индуцибельные мутации, делеции, метилирование и другие ные промоторы. Данные промоторы инициируют явления, хорошо известные из уровня техники. транскрипцию только в присутствии дополнительВ контексте данного изобретения под "активной молекулы. Примерами индуцибельных промоным фрагментом" гена подразумеваются меньшие торов служат промоторы генов бета-интерферона, участки гена, которые сохраняют способность когенов теплового шока, гена металлотионеина, а дировать белки с антиопухолевой активностью. также промоторы генов, экспрессирующихся под Р56 RB, более подробно описанный ниже, являетдействием стероидных гормонов. Тканеспецифися одним из примеров активного фрагмента функческая экспрессия достаточно изучена, и тканесционального генасупрессора опухолей. Моди фипецифические и индуцибельные промоторы хокации генов-супрессоров опухолей, такие как рошо известны из уровня техники. Указанные гены добавления, делеции или замены, также примеиспользуются для регулирования экспрессии чунимы по отношению к их активным фрагментам жеродного гена после его переноса в клеткупри том, чтобы последние сохраняли функциомишень. нальную активность немодифицированного гена. В объем настоящего изобретения включен Другим примером гена-супрессора опухолей также рекомбинантный аденовирусный вектор является ген ретинобластомы (RB). Полная нукэкспрессии, аналогичный описанным выше, но леотидная последовательность кДНК RB и предимеющий менее протяженные делеции последосказанная аминокислотная последовательность вательностей гена белка IX, в частности, в одном белка RB (обозначенного p110RB) были опубликоиз воплощений изобретения делеции расположеваны Lee et al.,(1987) и приведены на Фиг.3. Также ны от точки, отстоящей на 3500 пар оснований от полезной для экспрессии ретинобластомного бел5' конца вирусного генома до точки, отстоящей ка-супрессора опухолей является молекула ДНК, 15 70909 16 кодирующая аминокислотную последовательпрессировать эндогенную нуклеиновую кислоту, ность, приведенную на Фиг.2, или имеющая покодирующую функциональный белок-супрессор следовательность ДНК, приведенную на Фиг.3. опухолей. Усеченный вариант p110RB, p56RB, также может Примером заявленного в настоящем изобреоказаться полезным. Последовательность p56RB тении вектора является рекомбинантный аденоопубликована Huang et al.,(1991). В представленвирусный вектор экспрессии, содержащий в каченых в настоящем изобретении векторах могут стве чужеродного гена ген, кодирующий белок р53 быть использованы дополнительные геныили его активный фрагмент. Кодирующая послесупрессоры опухолей, кодирующие соответстдовательность гена р53 приведена ниже в Табливующие белки. Для иллюстрации можно назвать це 1. некоторые из них: белок р16 (Kamb et al.,1994), белок р21, белок WT1 опухоли Вилма, митозин, hТаблица 1 NUC или белок DCC карциномы прямой кишки. 50 Митозин описан X.Zhu и W- Η Lee в заявке на изоV*SHR PGSR* LLGSG DTLRS GWERA FHDGD бретение США No.08/141,239, поданной 22 октябTLPWI GSQTA FRVTA MEEPQ ря 1993г., и в дальнейшем частичном продолже100 нии указанной заявки тех же авторов, SDPSV EPPLS QETFS DLWKL LPENN VLSPL юридической выписке No.P-CJ 1191, выданной 24 PSQAM DDLML SPDD! EQWFT октября 1994 г. Оба документа приведены в на150 стоящей заявке в качестве ссылок. Аналогично, hEDPGP DEAPR MPEAA PPVAP APAAP TPAAP NUC описан W- Η Lee и P.L.Chen в заявке на изоAPAPS WPLSS SVPSQ KTYQG бретение США No.08/170,586, поданной 20 декаб200 ря 1993г. и приведенной здесь в качестве ссылки. SYGFR LGFLH SGTAK SVTCT YSPAL NKMFC Как известно из уровня техники, термин "проQLAKT CPVQL WVDST PPPGT теин" ("белок") означает линейный полимер ами250 нокислот, соединенных пептидными связями в RVRAM AIYKQ SQH MT EWRR CPHHE RCSDS специфическую последовательность. Термин DGLAP PQHLl RVEGN LRVEY "аминокислота" относится к D или L стереоизо300 мерным формам аминокислоты, если другое не LDDRN TFRHS VWPY EPPEV GSDCTTIHYN оговорено специально. В объем настоящего изоYMCNS SCMGG MNRRP ILTII бретения включены также эквивалентные белки 350 или эквивалентные пептиды, имеющие биологиTLEDS SGNLL GRNSF EVRVC ACPGR DRRTE ческую активность очищенного белка-супрессора EENLR KKGEP HHELP PGSTK опухолей дикого типа. "Эквивалентные белки" и 400 "эквивалентные полипептиды" означают соединеRALPN NTSSS PQPKK KPLDG EYFTL QIRGR ния, отличающиеся от линейной последовательERFEM FRELN EALEL KDAQA ности природных белков или полипептидов, но GKEPG GSR AH SSHLK SKKGQ STSRH KKLMF которые имеют аминокислотные замены, не измеKTEGP DSD* няющие их биологической активности. Данные эквиваленты могут отличаться от исходных по*=СТОП-КОДОН следовательностей заменой одной или более аминокислот сходными аминокислотами, например, сходно заряженными аминокислотами, или Любой из описанных здесь векторов экспресже заменой или модификацией боковых цепей или сии является применимым в качестве средства функциональных групп. диагностики или терапии. Векторы могут быть исОпределение функционального белкапользованы для скрининга многочисленных геновсупрессора опухолей распространяется на любой супрессоров опухолей в отношении их применибелок, чье присутствие снижает туморогенность, мости для генотерапии. Например, подозреваезлокачественность или гиперпролиферативный мые в неопластичности клетки могут быть взяты у фенотип клетки-хозяина. Согласно данному опрепациента или у животного. Затем в соответствуюделению примерами генов-супрессоров опухолей щи х условиях данные клетки могут быть обрабоявляются (но не ограничиваются указанными) таны эффективным количеством рекомбинантного р110RB, p56RB, митозин, h-NUC и р53. "Туморовектора, заявленного в настоящем изобретении и генность" означает способность образовывать несущего один из функциональных геновопухоли или способность вызывать образование супрессоров. Вызывает ли введение данного гена опухолей и является синонимом неопластического реверсию злокачественного фенотипа, можно опроста. "Злокачественность" характеризует споределить путем колониеобразования в мягком собность туморогенной клетки к метастазироваагаре или введением обработанных клеток голым нию и созданию угрозы для жизни хозяйского ормышам. ганизма. "Гиперпролиферативный фенотип" Если злокачественный фенотип ревертирохарактеризует рост и деление клеток, которые ван, то данный ген может рассматриваться как происходят со скоростью, превышающей норположительный кандидат для успешной генотерамальную для клеток данного типа. Понятие "непии данного пациента или животного. При фармаопластический" относится к клеткам, утратившим цевтическом применении такой ген может испольэндогенный функциональный белок-супрессор зоваться в сочетании с одним или несколькими опухолей, или означает неспособность клетки экс 17 70909 18 фармацевтически приемлемыми носителями. венное, внутримышечное или интраперитонеальДанные носители хорошо известны из уровня техное. Введение может быть постоянным или преники и включают такие водные растворы, как зарывистым и изменяться в зависимости от буференный физиологический раствор, или друсостояния больного, подвергаемого лечению, и гие растворители гликолы, глицерин, характера заболевания, точно также, как это прорастительные масла (например, оливковое масло) исходит в случае применения других терапевтичеили органические эфиры, пригодные для инъекских композиций (Landmann et al.,1992; Aulitzky et ций. Фармацевтически приемлемые носители моal.,1991; Lantz et al.,1990; Supersaxo et al.,1988; гут использоваться для доставки растворимых Demetri et al.,1989; LeMaistre et al., 1991). композиций в клетку in vitro или для введения Кроме того, в объем настоящего изобретения субъекту in vi vo. включены трансформированные прокариотичеФармацевтически приемлемые носители моские и эукариотические клетки-хозяева, например, гут содержать физиологически приемлемое вещеклетки млекопитающих или клетки других животство, которое, например, стабилизирует композиных, в которые введен описанный выше рекомбицию или же снижает или повышает абсорбцию нантный аденовирусный вектор экспрессии. К агента. Такие физиологически приемлемые вещеподходящим прокариотическим клеткам относятся ства могут включать, например, углеводы, такие (но не ограничиваются указанными) такие бактекак глюкоза, сахароза и декстраны, антиоксиданриальные клетки, как клетки E.coli. Методы трансты, такие как аскорбиновая кислота и глютатион, формации клеток-хозяев ретровирусными вектохелатирующие агенты, низкомолекулярные белки рами хорошо известны (cм.Sambrook et al., 1989) и или другие стабилизаторы. Иные физиологически включают (но не ограничиваются указанными) приемлемые вещества могут представлять собой трансфекцию, электропорацию и микроинъекцию. увлажняющие агенты, эмульгаторы, диспергиВ контексте настоящей заявки термин "животрующие агенты или консерванты, которые необное" считается синонимом понятия "млекопитаюходимы для предотвращения роста микрооргащее" и означает (но не ограничивается указаннынизмов. Известно множество консервантов, ми животными) корову, свинью, кошку, обезьяну, например, фенол и аскорбиновая кислота. Опытсобаку, ло шадь, мышь, крысу или человека. Кроме ный исследователь хорошо понимает, что выбор того, клетки-хозяева могут включать (но не ографармацевтически приемлемого носителя, вклюничиваться указанными) любые неопластические чая физиологически приемлемые соединения, или опухолевые клетки, такие как остеосаркома, зависит, например, от способа введения полипепкарцинома яичника, рак молочной железы, мелатида и конкретных физико-химических характеринома, гепатокарцинома, рак легких, рак мозга, рак стик отдельного полипептида. Например, такие толстой кишки, гематопоэтические клетки, рак физиологически приемлемые вещества, как монопростаты, цервикальная карцинома, ретинобластерат алюминия или желатин, особенно полезны стома, карцинома пищевода, рак мочевого пузыря, как замедляющие агенты, которые пролонгируют нейробластома или рак почек. абсорбцию введенной субъекту фармацевтичеКроме того, любая клеточная линия эукариот, ской композиции. Другие примеры носителей, стаспособная экспрессировать Е1а и Е1b или Е1а, билизаторов и адъювантов можно найти в книге Е1b и pIX, является подходящим хозяином для Martin, Remington's Pharm.Sci., 15th Ed. (Mack данного вектора. В одном из воплощений настояPubl.Co., Easton, 1975). Фармацевтические компощего изобретения в качестве клеток-хозяев исзиции могут быть при желании инкорпорированы в пользованы эукариотические клетки 293, доступлипосомы, микросферы или другой полимерный ные из Американской коллекции клеточных матрикс (Gregoriages, Liposome Technology, Vol.1 культур (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, (CRC Press, Boca Raton, Florida, 1984). Липосомы, U.S.A. 20231). состоящие из фосфолипидов или других липидов, Любые из описанных здесь трансформироявляются нетоксичными, физиологически приемваннных клеток-хозяев могут быть использованы лемыми и метаболизируемыми носителями, котодля целей диагностики или терапии. При фармарые сравнительно просто приготовить и ввести. цевтическом использовании они могут быть комВ контексте данного изобретения термин бинированы с различными фармацевтически при"фармацевтическая композиция" относится к люемлемыми носителями. Удобные бой композиции, упоминаемоей в данном изобрефармацевтически приемлемые носители хорошо тении, в сочетании с одним или более приведенизвестны из уровня техники и, например, некотоных выше фармацевтически приемлемых рые из них описаны выше. Композиции в эффекносителей. Данные композиции могут применятьтивных количествах могут быть применены терася в терапевтических или профилактических цепевтически или профилактически, как более лях. Они могут быть введены в контакт с клеткаподробно описано ниже. ми-хозяевами in vivo, e x vi vo или in vitro в Настоящее изобретение также относится к эффективных количествах. In vitro и ex vivo ознаспособу трансформации клетки-хозяина. Указанчает приведение в контакт с клетками-хозяевами, ный способ состоит в обеспечении контакта клеткак это описано ниже. В случае in vi vo способы ки-хозяина в соответствующи х условия х, т.е. провведения фармацевтического препарата, содеркариотической или эукариотической клеткижащего описанный в настоящем изобретении векхозяина, с одним из векторов экспрессии, описантор, хорошо известны из уровня техники и вклюных в данной заявке. Трансформированные сочают (но не ограничиваются указанными) гласно данному способу клетки-хозяева также оральное введение, интратуморальное, внутривключены в объем настоящего изобретения. Кон 19 70909 20 тактирование может быть достигнуто in vitro, in лечения субъекта и снижения у последнего числа vi vo или ex vivo с использованием методов, изгиперпролиферативных клеток, для подавления вестных из уровня техники (Sambrook et аl., 1989), пролиферации опухолевых клеток или облегчения притом, что векторы экспрессии применяются в конкретной специфической патологии. Патологиэффективных количествах. В настоящую заявку ческие гиперпролиферативные клетки являются также включен способ получения рекомбинантного характерными для следующи х заболеваний: гибелка или полипептида при выращивании трансперплазия щитовидной железы - болезнь Грэйва, формированной клетки-хозяина в соответствуюпсориаз, доброкачественная гипертрофия простащи х условия х, благоприятствующи х транскрипции ты, синдром Ли-Фраумени, включая рак молочной и трансляции введенного чужеродного гена. Межелезы, саркомы и другие неоплазии, рак мочевотоды экспрессии рекомбинантов в различных го пузыря, рак толстого кишечника, рак легких, клетках-хозяевах, таких как клетки млекопитаюразличные лейкозы и лимфомы. Примерами непащи х, дрожжей, насекомых или в бактериальных тологических гиперпролиферативных клеток слуклетках, широко известны и включают, например, жат эпителиальные клетки протоков молочной описанные Sambrook et al., supra. Транслированжелезы при лактации и клетки, ассоциированные с ный чужеродный белок может быть, затем выдезаживлением ран. Патологические гиперпролифелен обычными методами, такими как очистка на ративные клетки характеризуются потерей конколонках или очистка с помощью антител к дантактного ингибирования и сниженной способноному белку. Выделенный белок или полипептид стью к избирательному прикреплению, что также включен в объем настоящего изобретения. отражает изменения поверхностных свойств клетПрименительно к белку термины "очищенный" или ки и последующее нарушение межклеточных "выделенный" означают, что данный белок в знавзаимодействий. Данные нарушения включают чительной степени свободен от исходных белков стимуляцию деления и способность секретировать или нуклеиновых кислот, обычно связанных с данпротеолитические ферменты. ным белком или полипептидом в его естественном Кроме того, в настоящее изобретение включен окружении (в клетке-хозяине). способ истощения соответствующего образца паНастоящее изобретение также относится к тологических гиперпролиферативных клеток млеживотным, несущим введенные векторы экспрескопитающих, которые контаминируют гематопосии или трансформированные клетки-хозяева. этические предшественники в процессе пересадки Таких "трансгенных" животных получают при покостного мозга. Это достигается путем введения мощи способов, хорошо известных из уровня техгена-супрессора опухолей дикого типа в клетки ники, например, как описано в Патенте США соответствующего образца (полученные из аутоNo.5,175,384, или обычными методами терапии ex логичной периферической крови или костного мозvi vo, как описано Culver et al.,1991. га) посредством заявленного в настоящем изоКак более подробно описано ниже, рекомбибретении вектора. Термин "соответствующий нантные аденовирусы, экспрессирующие супресобразец" подразумевает гетерогенный клеточный сор опухолей - р53 дикого типа, могут эффективно препарат, полученный от пациента, т.е. смешанподавлять синтез ДНК и супрессировать рост шиную популяцию клеток, содержащую как фенотирокого спектра опухолевых клеток человека, пически нормальные, так и патологические клетки. включая и те, которые имеют клиническое значеТермин "введение" включает (но не ограничиваетние. Кроме того, рекомбинантные аденовирусы ся указанным ниже) введение в клетку или вн утмогут экспрессировать гены-супрессоры опухолей, ривенную инъекцию, прямое введение в опухоль, такие как р53, в развившихся in vivo оп ухолях без интратуморальное введение, интраперитонеальнеобходимости прямого введения в опухоль или ное введение, аэрозольное введение в легкие или предварительной обработки раковых клеток ex местное применение. Подобные процедуры могут vi vo. Экспрессируемый р53 является функциосочетаться с применением фармацевтически принальным и эффективно подавляет рост опухоли in емлемого носителя из числа описанных выше. vi vo и значительно увеличивает время выживания, Термин "сниженная туморогенность" введен как это показано на модели голых мышей, инокудля характеристики клеток, которые были прелированных клетками рака легкого человека. вращены в менее туморогенные или нетуморогенТаким образом, заявленные в настоящем изоные клетки. Клетки со сниженной туморогеннобретении векторы особенно подходят для генотестью или не образуют опухолей при введении in рапии. Соответственно, в объем настоящего изоvi vo, или же лагпериод до проявления опухолевобретения включены и способы генотерапии с го роста in vivo составляет недели или месяцы использованием указанных векторов. Вектор очии/или рост опухолевой массы, определяемый в щают и затем эффективное количество данного трех измерениях, происходит медленнее по сраввектора вводят субъекту in vi vo или ex vivo. Ме тонению с опухолями, в которых ген-супрессор опуды генотерапии хорошо известны из уровня теххолей инактивирован или нефукнционален. ники. См., например, Larrik,J.W и Burck,K.L (1991) Термин "эффективное количество" означает и Kreigler.M. (1990). такое количество вектора или антиракового белка, "Субъект" означает любое животное, млекопикоторое позволяет достигнуть положительного тающее (корову, свинью, кошку, собаку, лошадь, результата при контроле пролиферации клеток. мышь, крысу) или же человека. Притом, что ввеНапример, одна доза содержит от 108 до 1013 инденный в состав вектора чужеродый ген кодирует фекционных единиц вируса. Типичный курс лечебелок-супрессор опухолей или другой противония предусматривает введение одной такой дозы опухолевый белок, данный вектор применим для ежедневно в течение пяти дней. Эффективное 21 70909 22 количество может варьировать в зависимости от увеличенном сроке жизни пациента, уменьшении характера заболевания, состояния больного и опухолевой массы, апоптозе опухолевы х клеток други х факторов, хорошо известных из уровня или снижении числа циркулирующи х опухолевых техники. Эффективные количества легко опредеклеток. Способы оценки положительных эффектов ляются опытным исследователем. при таком терапевтическом подходе хорошо изВ объем настоящего изобретения включен вестны из уровня техники. также способ облегчения заболевания, для котоОбъектом настоящего изобретения является рого характерно наличие гиперпролиферативных рекомбинантный аденовирусный вектор экспресклеток или генетического дефекта, путем введесии, характеризующийся частичной или полной ния субъекту эффективного количества вектора, делецией ДНК аденовирусного белка IX, и несуописанного выше и содержащего чужеродный ген, щий чужеродный ген, кодирующий чужеродный продукт которого способен снижать тяжесть забобелок, притом, что чужеродный белок - является левания при соответствующи х условиях. Термин продуктом суицидного гена или его функциональ"генетический дефект" подразумевает любое заным агентом. Описанный выше антиопухолевый болевание или аномалию, возникшие в результаген ТК служит примером суицидного гена, поте наследуемых факторов, например, серповидноскольку продукт его экспрессии является или моклеточную анемию или болезнь Тэй-Сакса. жет являться летальным для клетки. Для ТК леНастоящее изобретение относится также к тальность индуцируется наличием GCV. Ген ТК способу снижения пролиферации опухолевы х клеполучен из вируса простого герпеса при помощи ток у субъекта путем введения в опухолевую масметодов, хорошо известных из уровня техники. су эффективного количества аденовирусного векДля целей настоящего изобретения источником тора экспрессии, содержащего антиопухолевый гена тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса ген, отличающийся от гена-супрессора опухолей. (HSV-1) служит плазмида pMLBKTK в клетках Антиопухолевый ген может кодировать, например, E.coli НВ101(изАТСС # 39369). Однако, имеются и тимидинкиназу (ТК). Затем субъекту вводят эфмногие другие источники. фективное количество терапевтического агента, Ген ТК может быть введен в опухолевую маскоторый в присутствии антиопухолевого гена явсу посредством аденовирусного вектора экспресляется токсичным для клетки. В конкретном слусии в сочетании с соответствующим фармацевтичае тимидинкиназы такими терапевтическими чески приемлемым носителем. Введение может агентами являются метаболиты тимидинкиназы, быть проведено, например, путем прямой инъекнапример, ганцикловир (GCV), 6-метоксипурин ции в опухолевую массу. При таких специфичеарабинонуклеозид (аrаМ) или их функциональные ских неоплазиях, как гепатоцеллюлярная карциэквиваленты. Для проявления токсического эфнома (НСС), можно использовать введение в фекта по отношению к клетке-хозяину ген тимипеченочную артерию, поскольку кровоснабжение динкиназы и метаболит тимидинкиназы должны большинства НСС осуществляется именно через использоваться конкурентно. Однако, в клетке эту артерию. Для контроля пролиферации клеток GCV фосфорилируется и становится мощным опухоли и снижения массы опухоли индуцируется ингибитором синтеза ДНК, а аrаМ превращается в гибель клеток путем введения пациентам метаботоксический анаболит аrаАТР. Для снижения пролита ТК, такого как ганцикловир (GCV). Метаболит лиферации опухолевых клеток могут быть испольТК может быть введен системно, локально в опузованы и другие антиопухолевые гены в сочетахоль или, в случае НСС, инъецирован в печеночнии с соответствующими терапевтическими ную артерию. Метаболит ТК предпочтительно агентами. Подобные сочетания генов и терапеввводить ежедневно, однако, в зависимости от обтических агентов хорошо известны из уровня техстоятельств, частота введений может быть повыники. Другим примером может служить заявленшена или снижена. Метаболит ТК может вводитьный в настоящем изобретении вектор, ся одновременно или последовательно с экспрессирующий фермент цитозиндезаминазу. введением ТК-содержащего вектора, Опытные Подобный вектор может быть использован в сочеисследователи могут определить дозы и продолтании с введением препарата 5-фторурацил жительность введения, которые являются тера(Austin and Huber,1993). Еще один пример - сочепевтически эффективными. тание недавно открытого гена Deo-дельта E.coli с Способ опухолеспецифической доставки гена6-метил-пурин-2'-дезоксинуклеозидом (Sorscher et супрессора опухолей может быть осуществлен al.,1994). при обеспечении контакта ткани-мишени данного Использование описанных выше геновживотного с эффективным количеством рекомбисупрессоров опухолей, а также использование нантного аденовирусного вектора экспрессии, задруги х антиопухолевых генов, как самих по себе, явленного в настоящем изобретении. Ген должен так и в сочетании с соответствующим терапевтикодировать антиопухолевый агент, такой как ческим агентом, позволяет оказывать влияние на функциональный ген-супрессор опухолей или суинеконтролируемый рост клеток и пролиферативцидный ген. "Обеспечение контакта" означает люные характеристики опухолей. Таким образом, в бой способ эффективной доставки вектора, нанастоящем изобретении заявлен способ терапии пример, внутритуморальное введение. для остановки неконтролируемого клеточного росИспользование заявленного в настоящем изота у пациента, что приводит к облегчению симбретении аденовирусного вектора для приготовптомов заболевания и смягчению имеющейся у ления медицинских препаратов, предназначенных больного кахексии. Результаты подобной терапии для терапии определенных заболеваний, также выражаются (но не ограничиваются указанным) в является предметом настоящего изобретения. 23 70909 24 Ниже приведены примеры, чтобы проиллюстнант. Один из данных клонов был использован рировать, но не ограничить, объем настоящего для инокуляции 1-литровой культуры в среде LB и изобретения. последующего выделения больших количеств Эксперимент №I плазмидной ДНК. После инкубации в течение ночи Для указанных исследований в качестве исиз 1-литровой культуры была выделена ДНК с ходного материала была выбрана плазмида помощью колонок Qiagen согласно рекомендациpAd/MLP/p53/E1b-. Данная плазмида основана на ям производителя. Полученная плазмида была pML2, производной от pBR322 (pBR322 с делециобозначена Pad/MLP/p53/PIX-. Образцы данной ей оснований 1140-2490), и содержит последоваплазмиды были депонированы в Американской тельности аденовируса типа 5 с 1-й по 5788-ю Коллекции Культур Клеток (АТСС), 12301 Parkiawn пару оснований с делецией оснований 4357-3327. Drive, Rockville, Maryland, USA, 12301, 22 октября Вместо делеции Ad5 357-3327 введена транс1993. Депонирование произведено согласно услокрипционная кассета, состоящая из позднего провиям Будапештского соглашения о международмотора Ad2, трехчленной лидерной кДНК Ad2 и ном депонировании микроорганизмов для целей кДНК р53 человека. Таким образом, получен типатентования. Данный депозит получил номер пичный вектор с заменой последовательностей АТСС 75576. Е1, делецией генов Е1а и E1b Ad5, но содержаДля конструирования рекомбинантного аденощий ген белка IX Ad5 (см.обзор, посвященный вируса 10 мкг плазмиды Pad/MLP/p53/PIXаденовирусным векторам: Graham and Prevec линеаризовали 40 единицами рестриктазы EcoRI. (1992)). ДНК Ad2 была получена от Gibco BRL. ДНК аденовируса 5-го типа dl327 Эндонуклеазы рестрикции и Т4 ДНК-лигаза были (Thimmappaya,1982) рестрицировали эндонуклеаполучены от New England Biolabs. Компетентные зой Clal и большой фрагмент (приблизительно 33 клетки E.coli DН5-альфа были куплены у Gibco т.п.о.) очищали центрифугированием в градиенте BRL, а клетки 293 - получены из Американской сахарозы. Десять (10)мкг рестрицированной EcoRI Коллекции Клеточных Культур (АТСС). Смола для плазмиды Pad/MLP/p53/PIX- и 2.5мкг рестрицироочистки ДНК Рrер-А-Gene была куплена у фирмы ванной Clal ДНК Ad5 dl327 смешивали и использоBioRad. LB-бульон для выращивания бактерий вали для трансфекции приблизительно 106 клеток был куплен у фирмы Difco. Колонки Quagen для 293 с помощью набора MBS для трансфекции выделения ДНК были куплены у фирмы Quagen, клеток млекопитающих согласно рекомендациям Inc. Вирус Ad5 dl327 был получен от R.J.Schneider, производителя. Через восемь (8) дней после NYU. Набор для трансфекции ДНК MBS был куптрансфеции клетки 293 рассевали в соотношении лен у фирмы Stratagene. 1:3 в свежей среде и еще через 2 дня на трансфиОдин (1)мкг pAd/MLP/p53/E1b- рестрицировацированных клетках становился виден цитопатили 20 единицами каждого из ферментов Eel 13611 ческий эффект, индуцированный - аденовирусом. и NgoMI в соответствии с рекомендациями произНа 13-й день после трансфекции из клеток по водителя. Пять (5)мкг ДНК Ad2 рестрицировали 20 стандартной методике (Graham and Prevec,1991) единицами каждого из ферментов Dral и NgoMI в выделяли ДНК и проводили рестрикционный анасоответствии с рекомендациями производителя. лиз при помощи рестриктазы Xhol. Экспрессию Рестрикционные смеси были нанесены в раздельр53, обусловленную вирусом, верифицировали ные лунки 0.8%-ного агарозного геля и подвергнупоследующей инфекцией клеток остеосаркомы ты электрофорезу при 100 вольтах в течение 2 Saos-2 содержащим вирус лизатом и иммуноблотчасов. Рестрикционный фрагмент тингом с анти-р53 моноклональными антителами pAd/MLP/p53/E1b- 4268кб и рестрикционный 1801 (Novocasta Lab.Ltd.,UK). фрагмент 6437кб Ad2 были выделены из геля при Эксперимент №II помощи смолы для экстракции ДНК Prep-A-Gene в Материалы и методы соответствии с рекомендациями производителя. Линии клеток Рестрикционные фрагменты смешали и обрабоРекомбинантные аденовирусы выращивали и тали Т4 ДНК-лигазой в общем объеме 50мкл при накапливали на клетках 293 (эмбриональная поч16°С в течение 16 часов согласно рекомендациям ка человека) АТСС CRL 1573, выращиваемых на производителя. Вслед за лигированием 5мкл ресреде DME с 10% телячьей сыворотки (Hyclone). акционной смеси использовали для трансформаКлетки Saos-2 выращивали на среде Кайна с доции клеток E.coli DН5-альфа (отбор вели по усбавлением 15% эмбриональной телячьей сывотойчивости к ампициллину). Шесть бактериальных ротки. Клетки HeLa и Hep 3В выращивали на среколоний, полученных в результате данной процеде DME с добавлением 10% эмбриональной дуры, использовали для инокуляции 2-мл культур телячьей сыворотки. Все остальные клетки вырав ростовой среде LB, которые подращивали в тещивали на среде Каина с добавлением 10% эмчение ночи при 37°С при постоянном встряхивабриональной телячьей сыворотки. Клетки Saos-2 нии. По стандартной методике (Sambrook et были любезно предоставлены доктором Эриком al.,1989) из каждой бактериальной культуры была Станбриджем. Все остальные клеточные линии выделена плазмидная ДНК. Четвертая часть кажбыли получены из АТСС. дого образца плазмидной ДНК была подвергнута Конструирование рекомбинантных аденовирусов рестрикции 20-ю единицами эндонулкеазы Xhol Для конструирования Ad5/p53 вирусов 1.4 кидля отбора "правильного" рекомбинанта, содерлобазный Hindlll-Smal фрагмент, содержащий жащего рестрикционные фрагменты Xhol в 3627, полноразмерную кДНК р53 (Таблица I), был выде3167 и 1445 пар оснований. Пять из шести провелен из плазмиды pGEM1-p53-B-T (любезно преренных образцов содержали искомый рекомбидоставлена Dr.Wen Hwa Lee) и вставлен в сайт 25 70909 26 клонирования вектора экспрессии pSP72 Определение скорости синтеза ДНК (Promega) с использованием стандартных метоКлетки (5´103/лунку) засевали в ячейки 96дов клонирования (Sambrook et al., 1989). Вставка луночных планшетов (Costar) и позволяли им прир53 была выделена из данного вектора после рекрепиться в течение ночи (37°С, 7% СO2). Затем стрикции Xhol-Bglll и последующего гельклетки в течение 24 часов инфицировали частиэлектрофореза. Затем кодирующие последовацами очищенного рекомбинантного вируса с мнотельности р53 встраивали в аденовирусные векжественностью инфекции от 0,3 до 100. Спустя 24 торы для переноса генов pNL3C или pNL3CMV часа после заражения производили замену среды (любезно предоставлены Dr.Robert Schneider), и инкубацию продолжали до 72 часов. За 18 часов которые содержат инвертированный концевой до сбора клеток добавляли 3Н-тимидин (Amerповтор Ad5 5', вирусные сигналы упаковки, энханsham, 1мкКи/лунку). Клетки осаждали на стеклосер Е1а и главный промотор поздних белков Ad2 волоконные фильтры и определяли уровень свя(MPL) или промотор раннего гена цитомегаловизавшейся радиоактивности при помощи руса человека (CMV), за которыми следуют трехсцинтилляционного бета-счетчика. Включение 3Нчленная лидерная кДНК и последовательности тимидина выражали как процент (+/- среднее от3325-5525 Ad5 в основной части PML2. В эти х ноклонение) от контроля среды и ставили в зависивых конструктах область Е1 Ad5 (360-3325 пары мость от множественности инфекции. оснований) заменена р53 под контролем Ad2 MPL Туморогенность для голых мышей (A/M/53) или промотором CMV человека (А/С/53), Приблизительно 2.4´108 клеток Saos-2, распричем в обоих случаях за р53 следует тре хчлентущи х на флаконах Т225, обрабатывали буфером ная лидерная кДНК (см.Фиг.4). Вставки р53 ис(1% сахарозы в PBS), содержащим очищенный пользуют остающийся "ниже" сайт полиадениливирус A/M/N/53 или А/М с множественностью инрования Е1b. фекции от 3 до 30. После инкубации с вирусом в Были получены дополнительные рекомбинантечение ночи клетки вводили подкожно в левый и ты с р53 под контролем ΜPL или CMV (A/M/N/53, правый бок атимическим голым мышам BALB/c (по A/C/N/53), которые имели делецию 705 нуклеоти4 мыши в группе). В один бок вводили клетки, обдов последовательностей Ad5 для удаления коработанные вирусом A/M/N/53, а в др угой - вирудирующей области белка IX (PIX). В качестве консом А/М, таким образом каждая мышь служила и троля из исходной плазмиды pNL3C был получен для контроля, и для опыта. Животные получали рекомбинантный аденовирус без вставки р53 также двусторонние инъекции клеток, обработан(А/М). Другим контролем служил рекомбинантный ных буфером, что служило дополнительным конаденовирус, кодирующий ген бета-галактозидазы тролем. Размеры опухолей (длина, ширина и выпод контролем промотора CMV (А/С/бета-гал). сота), а также вес тела определяли дважды в Плазмиды линеаризовали рестрикцией Nrul или неделю в течение 8 недель. Объем опухолей опEcoRI и котрансфецировали с большим фрагменределяли для каждого животного исходя из сфетом Clal-рестрицированного мутантного Ad5 dl309 рической геометрии опухоли, притом, что за радиили dl327 с использованием набора для Са/РО4ус принимали одну втор ую от среднего значения трансфекции (Stratagene). Выделяли вирусные всех трех измерений опухоли. бляшки и рекомбинанты идентифицировали рестАнализ опухолевых РНК рикционным анализом и ПЦР с использованием Атимическим голым мышам BALB/c (приблирекомбинантных специфических праймеров к позительно 5-недельного возраста) вводили подкожследовательностям трехчленной лидерной ДНК, но в правый бок 1´107 клеток Н69 (мелкоклеточрасположенным "ниже" последовательностей ная карцинома легкого). Опухолям позволяли кДНК р53. Затем рекомбинантный вирус очищали сформироваться в течение 32-х дней, к этому методом конечных разведений, выделяли вирусвремени они достигали объема 25-50мм 3. Мышам ные частицы и титровали стандартными методами проводили перитуморальные инъекции рекомби(Graham and van der Eb, 1973; Graham and Prevec, нантных аденовирусов А/С/53 или А/С/бета-гал 1991). (2´109 бляшко-образующи х единиц, бое) в подОбнаружение белка p53 кожное пространство под опухолевой массой. (Слетки Saos-2 или НерЗВ (5´105) инфицироОпухоли вырезали на 2-й и 7-й дни после введевали указанными рекомбинантными аденовирусания аденовирусов и ополаскивали в PBS. Опухоли ми в течение 24 часов с возрастающей множестгомогенизировали и выделяли из них тотальную венностью инфекции (в бляшко-образующих РНК с помощью набора TriReagent - (Molecular единицах вируса на клетку). За тем клетки одноResearch Center, Inc.,). ПолиА РНК выделяли с кратно ополаскивали PBS и лизировали в буфере помощью системы выделения мРНК PolyATract следующего состава: 50мМ Tris-HCl, pH7.5, 250мМ (Promega) и приблизительно 10нг каждого образца NaCI, 0.1% NP4O, 50мМ NaF, 5мМ ЕДТА, 10мкг/мл РНК использовали для определения экспрессии апротинина, 10мкг/мл лейпептина и 1мМ PMSF. мРНК р53 с помощью РТ-ПЦР (Wang et al., 1989). Клеточные белки (приблизительно 30мкг) раздеПраймеры были сконструированы таким образом, ляли в 10% SDS-PAGE и переносили на нитрочтобы амлифицировать последовательности мецеллюлозу. Мембраны инкубировали с антижду аденовирусной трехчленной лидерной кДНК и альфа-р53 антителами РАb 1801 (Novocastro), а расположенной "ниже" кДНК р53. Тем самым досзатем с конъюгатом овечьих антимышиных IgG с тигалась амплификация только рекомбинантных, пероксидазой хрена. Белок р53 визуализировали но не эндогенных последовательностей р53. хемилюминесценцией (набор ECL, Amersham) с Генотерапия опухолей у голы х мышей посредстпленкой Kodak XAR-5. вом р53 27 70909 28 al.,1991). Однако очевидно, что р53 дикого типа Приблизительно 1´107 опухолевы х клеток Н69 легко выявляется после заражения вирусом (SCLC) в объеме 200мкл вводили подкожно самкам атимических голы х мышей BALB/c. Оп ухоли А/М/53 или А/С/53 с низкой множественностью инфекции (Фиг.5), что свидетельствует о том, что формировались в течение 2-х недель и затем жидаже небольшие дозы р53-рекомбинантных адевотных рандомизировали по размеру опухолей новирусов способны продуцировать потенциально (N=5/группа). Проводили перитуморальные инъэффективные количества р53. екции аденовируса A/M/N/53 или контрольного р53-зависимые изменения морфологии аденовируса А/М (2´109 бое/инъекция) или только Реинтродукция р53 дикого типа в р53буфера (1% сахароза в PBS) дважды в неделю, негативные клетки остеосаркомы линии Saos-2 всего 8 доз на группу. В течение 7 недель дважды приводила к характерному увеличению и уплощев неделю определяли размеры опухолей и вес нию этих обычно веретеновидных клеток (Chen et тела; объем опухолей оценивали как описано раal.,1990). Субконфлюэнтные клетки Saos-2 нее. Кроме того, определяли действие терапии на (1´105/10см чашку) инфицировали с множественвыживание мышей. ностью инфекции 50 вирусом А/С/53 или конРезультаты трольным вирусом А/М и инкубировали при 37°С в Конструирование рекомбинантного р53течение 72 часов. К этому времени контрольные аденовируса неинфицированные клетки образовывали моноСодержащие р53 аденовирусы конструироваслой. В это время ожидаемые морфологические ли путем замены части области Е1а и Е1b аденоизменения становились хорошо заметными в чашвируса типа 5 на кДНК р53 под контролем промоках с клетками, обработанными А/С/53 (Фиг.6, патора Ad2 MPL (А/М/53) или промотора CMV нель С), но не в чашках с неинфицированными (А/С/53) (схематически представлено на Фиг.4). клетками (Фиг.6, панель А) или в контрольных инТакая замена области Е1 резко нарушает способфицированных чашках - (Фиг.6, панель В). Данный ность рекомбинантных аденовирусов к репликаэффект не является функцией плотности клеток, ции, позволяя им размножаться лишь в клетках поскольку в контрольной чашке клетки, засеянные 293, которые служат источником продуктов гена с меньшей плотностью, сохраняли нормальную Е1 Ad5 по "транс" типу (Graham et al.,1977). После морфологию к 72-м часам инкубации, когда их идентификации рекомбинантных аденовирусов плотность была одинаковой с таковой для А/С/53как рестрикционным анализом, так и ПЦР, полная инфицированных клеток. Более ранние результакДНК р53 одного из рекомбинантных аденовируты указывают на высокие уровни экспрессии белсов (А/М/53) была просеквенирована для того, ка р53 в клетках Saos-2 при множественности инчтобы убедиться в отсутствии мутаций. Затем фекции 50 (Фиг.5А), а также подтверждают тот очищенные препараты р53-рекомбинантов были факт, что белок р53, экспрессируемый при помоиспользованы для инфекции клеток HeLa с целью щи рекомбинантных аденовирусов, является биообнаружения аденовируса дикого типа. Клетки логически активным. HeLa, которые являются непермиссивными для Ингибирование синтеза клеточной ДНК посредстрепликации Е1-делетированного аденовируса, вом р53 были инфицированы 1-4´109 инфекционных едиДля дальнейшего изучения р53ниц рекомбинантного аденовируса, затем их кульрекомбинантных аденовирусов проверяли путем тивировали в течение 3-х недель и наблюдали включения меченого 3Н-тимидина их способность появление цитопатического действия (ЦПД). При подавлять пролиферацию опухолевы х клеток чеэтом репликации рекомбинантного аденовируса ловека. Ранее было показано, что введение р53 или контаминации вирусом дикого типа обнаружедикого типа в клетки, которые не экспрессируют но не было. В культурах контрольных клеток, инэндогенного р53 дикого типа, может останавлифицированных аденовирусом дикого типа, ЦПД вать клетки при переходе из фазы G1 в фазу S было очевидным, и чувстви тельность данного клеточного цикла, что приводит к подавлению метода составляет приблизительно 1 из 109. включения меченого тимидина во вновь синтезиЭкспрессия белка р53 с помощью рекомбинантноруемую ДНК (Baker et al.,1990; Mercer et al.,1990; го аденовируса Diller et al.,1990). Различные опухолевые клеточДля того чтобы определить, экспрессируют ли ные линии, дефицитные по р53, инфицировали рекомбинантные р53-аденовирусы белок р53, аденовирусными векторами A/M/N/53, A/C/N/53 данными вирусами были инфицированы линии или не экспрессирующим р53 контрольным реклеток, которые не экспрессируют эндогенного комбинантным аденовирусом (А/М). Наблюдали р53. Опухолевые клеточные линии человеческого сильное дозозависимое подавление синтеза ДНК происхождения Saos-2 (остеосаркома) и Hep 3В при заражении рекомбинатными вирусами (гепатоцеллюлярная карцинома) инфицировали в A/M/N/53 и A/C/N/53 в случае семи из девяти протечение 24 часов р53-рекомбинантными аденовиверенных опухолевых клеточных линий (Фиг.7). русами А/М/53 или А/С/53 с множественностью Оба конструкта были способны подавлять синтез инфекции в пределах от 0.1 до 200бое/клетку. ДНК в этих опухолевых клетках человека, незавиВестерн-анализ лизатов, приготовленных из инсимо от того, экспрессировали ли они мутантный фицированных клеток, показал дозозависимую р53 или вовсе не экспрессировали р53. В данном экспрессию р53 в клетках обоих типов (Фиг.3). В эксперименте было также показано, что конструкт неинфицированных клетках р53 обнаружен не A/C/N/53 является значительно более эффективбыл. Уровни эндогенного р53 дикого типа в норме ным, нежели A/M/N/53. В клетках Saos-2 (остеовесьма низки и практически не обнаруживаются саркома) и MDA-MB468 (рак молочной железы) Вестерн-анализом клеточных лизатов (Bartek et 29 70909 30 при инфекции конструктом A/C/N/53 с множестстве положительного контроля для р53венностью не выше 10 удавалось достигнуть почспецифической полосы (Фиг.9, линия 10). Данный ти 100%-ного подавления синтеза ДНК. При тех эксперимент показывает, что р53-рекомбинантный дозах, когда подавление синтеза ДНК контрольаденовирус может специфически направлять эксным аденовирусом достигало только 10-30%, напрессию р53 мРНК в развившихся опухолях после блюдалось 50-100%-ное подавление синтеза ДНК однократного введения в перитуморальное пропри использовании любого р53-рекомбинантного странство. Он также демонстрирует персистенцию аденовируса. Напротив, ни с одним конструктом вируса in vi vo по меньшей мере в течение недели не наблюдалось какого-либо р53-специфического после инфекции р53-рекомбинантным аденовируэффекта в сравнении с контрольным вирусом в сом. случае клеток Hep G2 (клеточная линия гепатоЭффективность in vi vo карциномы, - экспрессирующая эндогенный р53 Для определения достоверности генотерапии дикого типа, Bressac et al., 1990) и лейкозной клеразвившихся опухолей была использована моточной линии К562 (р53-ноль). дель голых мышей - носителей опухоли. В правый Туморогенность для голых мышей бок голым мышам вводили подкожно клетки Н69 и В более строгом тесте на функционирование позволяли опухолям развиваться в течение 2-х рекомбинантных аденовирусов, содержащих р53, недель. Затем мышам дважды в неделю перитуопухолевые клетки инфицировали ex vivo и затем морально вводили буфер или рекомбинантный вводили голым мышам для проверки способности вирус (всего 8 инъекций). На протяжении всей рекомбинантов подавлять рост опухолей in vivo. обработки опухоли у мышей, получавши х буфер Клетки Saos-2, инфицированные вирусом или контрольный вирус А/М, продолжали быстро A/M/N/53 или контрольным вирусом А/М с множерасти, тогда как опухоли у мышей, обработанных ственностью инфекции от 3 до 30, вводили в развирусом A/M/N/53, росли гораздо медленнее ные бока голым мышам. Затем в течение 8 недель (Фиг.10А). После прекращения инъекций кондважды в неделю определяли размеры опухолей. трольные опухоли продолжали расти, а опухоли, При множественности инфекции, равной 30, ни у обработанные р53, росли незначительно или не одного из животных рост р53-обработанных опуросли совсем, по меньшей мере, в течение недехолей не наблюдался, притом, что рост контрольли в отсутствие дополнительного экзогенного р53 ных опухолей происходил нормально (Фиг.8). Про(Фиг.10А). Несмотря на то, что у контрольных жигрессирующее увеличение опухолей, вотных, получавши х только буфер, наблюдался обработанных контрольным вирусом, было сходускоренный рост опухолей в сравнении с любой ным с таковым, наблюдавшимся у животных, обгруппой животных, обработанных вирусом, значиработанных только буфером. Наблюдались явные тельной разницы в весе тела между тремя групразличия в росте опухолей в случае контрольного пами за все время обработки обнаружено не быаденовируса и р53-рекомбинантного аденовируса ло. Изъязвление опухолей у отдельных животных при множественности инфекции 3, хотя у 2-х из 4-х снижало достоверность определений размеров р53-обработанных мышей рост опухолей начался опухолей после 42-го дня. Однако, продолжение приблизительно через 6 недель. Таким образом, наблюдений за животными для определения вререкомбинантный аденовирус A/M/N/53 способен мени выживания, показало преимущество в выжиобусловливать р53-специфическую супрессию вании р53-обработанных животных (Фиг.10В). Поопухолей in vi vo. следнее из обработанных контрольным Экспрессия Ad/p53 in vivo аденовирусом животное умерло на 83-й день, тоПритом, что обработка опухолевы х клеток ex гда как все контрольные животные, получавшие vi vo с последующим введением их животным, явтолько буфер, умерли к 56-му дню. Напротив, все ляется важным тестом на подавление опухоли, пять животных, обработанных вирусом A/M/N/53, более важными в клиническом плане представлявыжили (130-й день после введения клеток) ются эксперименты по введению р53(Фиг.10В). Совокупность этих данных подтверждарекомбинантных аденовирусов и экспрессии р53 в ет специфическое влияние р53 на рост опухолей и опухолях, развившихся in vi vo. С этой целью клетвремя выживания у животных с развившимися ки Н69 (SCLC, p53-null) вводили подкожно голым р53-дефицитными опухолями. мышам и позволяли образовываться опухолям в Аденовирусные векторы, экспрессирующие р53 течение 32-х дней. В это время однократно ввоБыли сконструированы рекомбинантные аденовирусные векторы, способные к экспрессии выдили 2´109 бое вируса А/С/53 или А/С//бета-гал в соких уровней белка р53 дикого типа дозозависиперитуморальное пространство. На второй или мым образом. Каждый вектор содержал делеции седьмой день после введения вируса опухоли областей Ε1а и Е1b, что делало вирус дефектным вырезали и из каждой опухоли выделяли полиА по репликации (Challberg and Kelly, 1979; РНК. Для обнаружения мРНК р53 в р53обработанных опухоля х использовали РТ-ПЦР с Horowotz, 1991). Важно отметить, что данные делеции захватывали последовательности, кодипраймерами, специфичными относительно рекомрующие белки 19кд и 5кд Е1b. Показано, что белок бинантного р53. Сигнала р53 не было обнаружено 19кд участвует в ингибировании апоптоза (White et в опухолях, вырезанных у животных, обработанal.,1992; Rao et al., 1992), а белок 55кд способен ных вирусом с - бета-галактозидазой (Фиг.9, линии 3 и 6). Амплификация с актиновыми праймерами связываться с белком р53 дикого типа (Sarnow et al.,1982; Heuvel et al., 1990). При делеции данных служила контролем в реакции РТ-ПЦР (Фиг.9, лиаденовирусных последовательностей удаляются нии 7-9), а плазмида, содержащая последовапотенциальные ингибиторы функции р53, способтельности рекомбинантного р53, служила в каче 31 70909 32 ные действовать путем прямого связывания с р53 также могут иметь значение. или же посредством ингибирования р53Результаты, полученные с вирусом A/M/N/53 и опосредованного апоптоза. Были получены допредставленные на Фиг.8, показывают, что и в полнительные конструкты, в которых были делеусловиях in vi vo возможно полное подавление тированы остающиеся 3' Е1b последовательности, роста опухолей. Возобновление роста опухолей у включая все последовательности, кодирующие двух животных из четырех, обработанных р53 с белок IX. Хо тя, как показано, делеции в области низкой множественностью инфекции, объясняется Е3 приводят к снижению емкости вектора приблинизким процентом клеток, инфицированных р53 зительно на 3кб по сравнению с аденовирусом рекомбинантом при данной дозе. Полное подавдикого типа (Ghosh-Choudhury et al., 1987); подобление роста опухолей в случае вир уса A/M/N/53 в ные делеции были проведены в конструктах высокой дозе, однако, показывает, что способA/M/N/53 и A/C/N/53, так что емкость указанных ность к возобновлению роста опухоли может быть векторов укладывается в указанные рамки. Делепреодолена. тированием области plΧ содержание аденовирусЭффективность р53-аденовируса in vivo ных последовательностей, гомологичных таковым, Приведенные здесь эксперименты, а также содержащимся в клетках 293, было снижено до работы других гр упп (Chen et al., 19-90; Takahashi 300 пар оснований, что уменьшило вероятность et al.,1992) показывают, что опухолевые клетки возникновения путем рекомбинации компетентночеловека, в которых не происходит экспрессии р53 го по репликации аденовируса дикого типа. Констдикого типа, могут быть обработаны р53 ex vivo, рукты, утратившие кодирующую последовательчто приводит к супрессии роста опухолей при поность pΙΧ, имели одинаковую эффективность по следующем введении данных клеток животным. сравнению с конструктами, имеющими данную Авторы предоставили первое доказательство последовательность. возможности генотерапии опухолей посредством Эффективность р53-аденовируса in vitro переноса гена-супрессора в опухоли, развившиеся В соответствии со строгой дозозависимостью in vivo. Данный метод приводит к супрессии (поэкспрессии р53 в инфицированных клетках было давлению) роста опухолей и увеличению времени показано дозозависимое р53-специфическое повыживания. В системе, описанной авторами, досдавление роста опухолевых клеток. В опухолевых тавка агента в опухолевые клетки не основываетклетках различных типов, в которых не экспрессися на прямой инъекции в опухолевую массу. Наровался р53 дикого типа, подавлялось клеточное против, р53-рекомбинантный аденовирус вводили деление, что демонстрировалось снижением синв перитуморальное пространство и в опухоли обтеза ДНК. Недавно Bacchetti и Graham (1993) в наруживали экспрессию мРНК р53. Экспрессируеаналогичных экспериментах показали р53мый рекомбинантами р53 был функционален и в специфическое подавление синтеза ДНК в клезначительной степени подавлял рост опухоли в точной линии карциномы яичника SKOV-3 посредсравнении с контрольными опухолями, обрабоством рекомбинантного р53-аденовируса. Ингибитанными аденовирусами, не экспрессирующими рование роста с помощью заявленных в р53. Однако, подавление роста опухолей наблюнастоящем изобретении р53-рекомбинантов было далось в обоих группах -как обработанных р53показано не только на карциноме яичника, но и на содержащими, так и р53-несодержащими вирусаряде других опухолевы х клеточных линий человеми, в отличие от контроля (обработка только бука, представляющих клинически важные неоплафером). Было показано, что у голых мышей местзии человека, включая линии, в которых происхоная экспрессия фактора некроза опухолей (TNF), дит повышенная экспрессия мутантного белка гамма-интерферона, интерлейкина-2 (IL-2), интерр53. При той множественности инфекции, когда лейкинов 4 или 7 (IL-4, IL-7) может приводить к рекомбинант A/C/N/53 проявлял 90-100% эффеквременной супрессии опухолей, зависимой от Ттивность подавления синтеза ДНК в опухолях клеток (Hoch et al.,1992). Экспозиция моноцитов с данных типов, активность контрольного аденовиаденовирусом также является слабым индуктором руса составляла менее 20%. интерферонов альфа и бета (см. обзор Gooding Хотя Feinstein et al., (1992) показал, что реинand Wold, 1990). Таким образом, не удивительно, тродукция р53 дикого типа может вызывать дифчто некоторое подавление опухолей у голых мыференцировку и увеличение доли клеток в G1 по шей наблюдалось в случае контрольного аденоотношению к S+G2 для лейкозных клеток К562, вируса. Подобное вирус-обусловленное подавлеавторами изобретения р53-специфического эфние опухолей не наблюдалось в случае фекта на данных клетках не наблюдалось. Horvath опухолевы х клеток Saos-2, обработанных ex vi vo и Weber (1988) сообщали, что лимфоциты периконтрольным вирусом. Р53-специфическое подавферической крови человека в высокой степени ление опухолей in vi vo становится особенно оченепермиссивны для аденовирусной инфекции. В видно при продолжительном мониторинге живототдельных экспериментах рекомбинантный аденых (Фиг.10). Время выживания р53-обработанных новирус А/С/бета-гал с тр удом инфицировал немышей резко возрастало, так 5 из пяти опытных отвечающие клетки К562, в то время как другие животных были живы спустя 130 дней после ввеклеточные линии, в том числе контрольные клетки дения клеток в сравнении с 0 из пяти, обработанлинии Hep G2 и клетки с ярко выраженным эфных контрольным аденовирусом. У выживших жифектом р53, легко инфицировались. Таким обравотных рост опухолей продолжался, что, позом, по меньшей мере, частично вариации в эфвидимому, обусловлено тем фактом, что не все фективности обусловлены различиями в клетки были первоначально инфицированы р53инфекционности вируса, хотя и другие факторы рекомбинантным аденовирусом. Это обстоятель 33 70909 34 ство может быть преодолено более высокими доли", как это показано на Фиг.11 и 12, и они являзами вируса или более частыми его введениями. ются производными тех конструкции, которые Кроме того, выключение промотора (Palmer et были ранее описаны для экспрессии геновal.,1991) или дополнительные мутации могут обусупрессоров опухолей. словливать устойчивость данных клеток к обраДля экспрессии перенесенного гена была исботке р53- рекомбинантными аденовирусами. Напользована экспрессионная кассета, в которой пример, мутации в недавно описанном гене WAF1, для транскрипции гена ТК или гена хлорамфеникоторый индуцируется р53 дикого типа и затем колацетилтрансферазы (CAT) применялись ранподавляет переход клетки в S-фазу клеточного ний промотор/энхансер цитомегаловируса человецикла (El-Deiry et al.,1993; Hunter, 1993), могут ка (Boshart, Μ. et al., 1985) или энхансер/промотор приводить к образованию р53-устойчивых опухоальфа-фетопротеина человека (Watanabe, К. et лей. al., 1987; Nakabayashi, H. et al., 1989). Промотор эксперимент №III CMV способен направлять устойчивую экспрессию В настоящем Примере показано применение генов в клетках различных типов, а конструкты с "суицидных" генов и тканеспецифической экспреспромотором/энхансером АФП экспрессируются сии таких генов в генотерапевтических подходах, специфически в клетках гепатоцеллюлярной карописываемых в данном изобретении. В качестве циномы (НСС), в которых экспрессия АФП наблюмишени была выбрана гепатоцеллюлярная кардается у 70-80% больных с данным типом опухоцинома, поскольку она является одной из самых лей. В конструкте с промотором/энхансером CMV распространенных неоплазий человека и приводля усиления трансляции транскрипта ТК испольдит к гибели около 1250000 людей во всем мире зована трехчленная лидерная последовательежегодно. Частота этого вида рака особенно выность аденовируса типа 2 (Berkner, K.L and Sharp, сока в Юго-Восточной Азии и Африке, где он ас1985). В дополнение к делеции Е1, у обоих аденосоциирован с инфекцией гепатитом В и С и возвирусных векторов делетировано по 1.9кб ДНК в действием афлатоксина. Единственным методом области Е3. ДНК, делетированная в Е3 области, лечения гепатоцеллюлярной карциномы на сегоне является необходимой для репликации вируса дня является хирургический, хотя менее 20% и подобная делеция увеличивает на эквивалентбольных рассматриваются как кандидаты на опеную величину (1.9кб) емкость рекомбинантного рацию (Ravoet С. et al., 1993). Однако, представвируса в отношении чужеродной ДНК (Graham and ленные здесь способы снижения пролиферативPrevec, 1991). ного потенциала опухолей, применимы и к другим Для демонстрации специфичности промотонеоплазиям, отличным от гепатоцеллюлярной ра/энхансера АФП был сконструирован вирус карциномы. AANCAT, в котором маркерный ген хлорамфениЛинии клеток колацетилтрансферазы (CAT) поставлен под конВсе клеточные линии за исключением линии троль промотора /энхансера АФП. В вирусном HFL были получены из Американской Коллекции конструкте ACNTK трехчленная лидерная послеКлеточных Культур (АТСС), 12301 Parklawn Drive, довательность Ad2 помещена между геном ТК и Rockville, Maryland. Кодовые номера АТСС привепромотором/энхансером CMV. Показано, что такой дены в скобках. Клеточная линия эмбриональной трехчленный лидер усиливает трансляцию соедипечени человека 293 (CRL 1573) была использоненных с ним генов. Замены в области Е1 нарувана для получения и наращивания рекомбинантшают способность рекомбинантных вирусов к реных аденовирусов. Клетки выращивали на среде пликации, ограничивая их размножение только DME с добавлением 10% телячьей сыворотки (Hyклетками 293, которые предоставляют продукты clone). Клеточные линии гепатоцеллюлярной каргена Е1 Ad5 по "транс" типу (Graham et al., 1977). циномы Hep 3В (НВ 8064), Hep G2 (НВ 8065) и Аденовирусный вектор ACNTK: плазмида HFL поддерживали на среде DME/F12 с добавлеpMLBKTK в E.coli HB 101 (из АТСС, #39369) была нием 10% эмбриональной телячьей сыворотки, использована как источник гена тимидинкиназы так же как и линии рака молочных желез MDA(ТК) вируса простого герпеса (HSV-1). Ген ТК был MB468 (НТВ 132) и ВТ-549 (НТВ 122). Печеночные вырезан из плазмиды в виде фрагмента 1.7кб при клетки линии Chang (CCL 13) выращивали на сререстрикции ферментами Вgl II и Pvu II, а затем де MEM с добавлением 10% эмбриональной тесубклонирован по сайтам BamHI и EcoRV в плазлячьей сыворотки. Клеточная линия HLF была миду pSP72 (Promega) с использованием станполучена от д-ров T.Morsaki и H.Kitsuki (медициндартных методов клонирования (Sambrook et al., ский факультет Университета Киушу, Япония). 1989). Вставку ТК-гена затем вырезали из данного Конструирование рекомбинантного вируса вектора в виде 1.7кб фрагмента рестриктазами Два аденовирусных вектора экспрессии, обоХbа I и Bgl Il и клонировали в плазмиду pACN значенные здесь как ACNTK и AANTK, лишенные (Wills et al., 1994). Двадцать (20) микрограмм данфункции белка IX (приведены на Фиг.11), способной плазмиды, обозначенной pACNTK, линеарины обеспечивать экспрессию "суицидного" гена зовали при помощи рестриктазы EcoRI и котранстимидинкиназы (ТК) в опухолевых клетках. Третий фицировали в клетки 293 (АТСС CRL 1573) с 5мкг аденовирусный вектор экспрессии, обозначенный переваренной СІа І плазмиды ACBGL (Wills et AANCAT, был сконструирован для дальнейшей al.,1994 supra) и использованием набора для демонстрации осуществимости специфической кальций-фосфатной трансфекции (Stratagene, San целенаправленной экспрессии генов в особых Diego, California). Изолировали вирусные бляшки и типах клеток при помощи аденовирусных вектоидентифицировали рекомбинанты ACNTK при ров. Данные аденовирусные конструкции "собирапомощи рестрикционного анализа выделенной 35 70909 36 ДНК. При этом использовали рестриктазы Xhol и из Basic Vector pCAT (Promega Corporation) при BsiWI. Положительные рекомбинанты затем очирестрикции последнего ферментами Xbal и щали методом конечных разведений, наращивали BamHI. Полученный 1.64-кб фрагмент лигировали и титровали стандартными методами (Graham and с рестрицированной Xbal и BamHI плазмидой Prevec, 1991). pAAN (описана ранее) с получением плазмиды Аденовирусный вектор AANTK: промотор гена pAANCAT. Данную плазмиду затем линеаризоваальфа-фетопротеина (AFP-P) и эн хансер того же ли при помощи EcoRI и котрансфицировали с гена (AFP-E) были клонированы из геномной ДНК большим фрагментом рестрицированной СІа І человека (Clonetecn) путем ПЦР-амплификации с rА/С/ 7бета-gаІ с получении AANCAT. использованием праймеров с сайтами рестрикции Экспрессия репортерного гена: экспрессия бетана концах. Праймеры, использованные для выдегалактозидазы ления фрагмента AFP-P (210 пар оснований), соКлетки засевали по 1´105 клеток на лунку в держали сайт рестрикции Nhel в 5'-праймере и 24-луночные культуральные планшеты (Costar) и линкер Xbal, Xhol, Kpnl в 3'-праймере. Последоваоставляли на ночь для прикрепления (37°С, 7% тельность 5'-праймера была следующей: 5'-CGC СО2). Заражение вирусом ACBGL проводили в GCT AGC ТСТ GCC CCA AAG AGC Т-3'. Последотечение ночи при множественности инфекции, вательность З'-праймера была следующей: 5'равной 30. Спустя 24 часа клетки фиксировали CGC GGT АСС СТС GAG ТСТ AGA ТАТ TGC CAG 3.7%-ным формальдегидом, отмывали PBS и окTGG TGG AAG-3'. Праймеры, использованные для рашивали реагентом X-gal (1мг/мл, USB). Резульвыделения фрагмента AFE (1763 пар оснований), таты выражали в принятых символах (+, ++, +++), имели сайт рестрикции Notl в 5'-праймере и сайт определяя процент окрашенных клеток при кажрестрикции Xbal в 3'-праймере. Последовательдой множественности инфекции. ность 5'праймера была следующей: 5'-CGT GCG [+=1-33%, ++=33-67%, и +++=>67%). GCC GCT GGA GGA CTT TGA GGA TGT CTG TCЭкспрессия репортерного гена: экспрессия CAT 3'. Последовательность 3'-праймера была слеКлетки HepG2, Hep В3, HLF, Chang и MDAдующей: 5-CGC ТСТ AGA GAG АСС AGT TAG MB468 засевали по 2´106 на 10-см чашки (по три GAA GTT TTC GC A-3 1. Для ПЦР-амплификации чашки каждой культуры) и инкубировали ночь при ДНК денатурировали 7 минут при 97°C, затем 37°С, 7% СО2. Затем клетки на каждой чашке заследовали 5 циклов амплификации при 97°С, 1 ражали или AANCAT с множественностью инфекминута, 53°С, 1 минута, 72°С 2 минуты и, наконец, ции 30 или 100, или же оставляли незараженными наращивание при 72°С 10 минут. Амплифицирои инкубировали в течение 3 дней. Затем клетки ванный фрагмент AFE рестрицировали ферменснимали трипсином, отмывали PBS и суспендиротами Notl и Xbal и встраивали по сайтам Notl и вали в 100мкл 0.25Μ Трис-НСІ рН7.8. Образцы Xbal в плазмидный вектор рА/lTR/B, содержащий трижды замораживали и оттаивали, супернатант последовательности аденовируса типа 5 (1-350 и переносили в новые пробирки и инкубировали при 3330-5790), разделенные полилинкером, содер60°C 10 минут. Затем образцы центрифугировали жащим сайты рестрикции Notl, Xhol, Xbal, Hindlll, при 4°С 5 минут и в супернатантах определяли Kpnl, BamHI, Ncol, Smal и Bglll. Амплифицированконцентрацию белка по Брэдфорду (Bio-Rad ный фрагмент AFP-E переваривали ферментами Protein Assay Kit). Концентрацию белка в пробах Nhel и Kpnl и встраивали в содержащий AFP-E выравнивали, доводя конечный объем до 75мкл с конструкт, описанный выше по сайтам рестрикции использованием 0.25Μ Трис, 25мкл 4мМ ацетилуказанных ферментов. Этот новый конструкт заКоА и 1мкл 14С-хлорамфеникола. Пробы инкубитем рестрицировали ферментами Xbal и NgoMI ровали ночь при 37°С. Затем к каждой пробе додля удаления аденовирусных последовательнобавляли 500мкл этилацетата, перемешивали на стей 3330-5780, которые заменяли рестрикционвстряхивателе и центрифугировали 5 минут при ным фрагментом Xbal-NgoMl плазмиды pACN, комнатной температуре. Верхнюю фаз у переносисодержащим нуклеотиды 4021-10457 аденовируса ли в новые пробирки и испаряли этилацетат центипа 2, с получением плазмиды pANN, содержатрифугированием в вакууме. Продукты реакции щей как промотор, так и энхансер альфарастворяли в 25мкл этилацетата и наносили на фетопротеина. Данный конструкт затем рестриципластину для тонкослойной хроматографии (TLC). ровали ферментами EcoRI и Xbal для выделения Пластину помещали в уравновешенную (95% хлофрагмента размером 2.3кб, содержащего обрароформа, 5% метанола) камеру для TLC. Раствощенный концевой повтор вируса Ad5, AFP-E и рителю давали возможность мигрировать в верхAFP-P, который затем лигировали с EcoRI-Xbal нюю часть камеры, затем пластину высушивали и 8.5-кб фрагментом описанной выше плазмиды экспонировали с рентгеновской пленкой. pACNTK с получением плазмиды pAANTK, в котоПролиферация клеток: включение 3Н-тимидина рой ген ТК в аденовирусном окружении поставлен Клетки засевали по 5´103клеток/ячейка в под контроль промотора и энхансера гена альфаячейки 96-луночных планшетов (Costar) и инкубифетопротеина. Данную плазмиду затем линеарировали в течение ночи (37°С, 7% СО2). Серийно зовали при помощи EcoRI и котрансфицировали разведенные вирусы ACN, ACNTK или ААТК в вместе с большим фрагментом Clal рестрициросреде DM ЕМ с 15% телячьей эмбриональной сыванной плазмиды ALBGL, как описано выше, и воротки и 1% глутамина использовали для зарарекомбинанты, обозначенные AANTK, выделяли и жения клеток с множественностью инфекции, равочищали, как описано выше. ной 30. Инкубация с вирусом продолжалась в Аденовирусный вектор AANCAT: ген хлорамтечение ночи, после чего клеткам добавляли ганфениколацетилтрансферазы (CAT) был выделен цикловир в логарифмических разведениях от 37 70909 38 0.001 до 100мкМ (микроМоль). За 12-18 часов до зованы для заражения трех клеточных линий гесбора клеток в каждую ячейку добавляли 1мкКи патоцеллюлярной карциномы (HLF, Нер3В и Hep3 Н-тимидина (Amersham). Спустя 72 часа после G2). В качестве контролей были использованы заражения клетки осаждали на стекловолоконные линия клеток печени человека (Chang) и две лифильтры и определяли количество включенного нии рака молочной железы (MDAMB468 и ВТ549). 3 Н-тимидина методом жидкостной сцинтилляции Для демонстрации специфичности промото(TopCount, Packard). Результаты представлены ра/энхансера АФП был сконструирован вирус как процент от контрольной пролиферации без AANCAT. обработки и приведены в виде эффективной дозы Данный вирус был использован для зараже(ED50 +/- стандартное отклонение) для 50%-ного ния клеток, которые экспрессируют (Hep3В, Hepснижения пролиферации над контролем со среG2) или не экспрессируют (HLE, Chang, дой. Значения ED50 оценивали по совпадению с MD AMB468) маркер гепатоцеллюлярных опухолей логическим уравнением "доза-ответ". альфа-фетопротеин (АФП). Как показано на Цитоксичность: высвобождение лактатдегидрогеФиг.13, AANC AT направляет экспрессию маркерназы (LDH) ного гена CAT только в тех НСС клетках, которые Клетки (HFL, гепатоцеллюлярная карцинома способны к экспрессии АФП (Фиг.13). Эффективчеловека, НСС) после заражения ACN или АСТК ность ACNTH и AANTK для лечения НСС провеобрабатывали ганцикловиром, как это описано в ряли с использованием включения 3Н-тимидина с разделе "Пролиферация клеток". Спустя 72 часа целью определения эффекта экспрессии HSV-TK после добавления ганцикловира клетки центрифув сочетании с обработкой ганцикловиром на прогировали и удаляли супернатант. Уровни лактатлиферацию клеток. Клетки указанных линий индегидрогеназы определяли колориметрически фицировали ACNTK или AANTK или же контроль(Promega, Cytotox 96TM). Среднее высвобождение ным вирусом ACN (Wills et al., 1994 supra), LDH (+/- среднее отклонение) ставили в зависикоторый не направлял экспрессии HSV-TK, a замость от множественности инфекции. Терапия in тем обрабатывали возрастающими дозами ганvi vo цикловира. Эффективность данной обработки Клетки гепатоцеллюлярной карциномы челоявлялась функцией концентрации ганцикловира. века (Hep 3B) вводили подкожно десяти самкам Определяли такую концентрацию ганцикловира, атимических мышей nu/nu (Simonsen Laboratories, которая требовалась для 50%-ного подавления Gilroy, C A). Каждое животное получало в левый включения 3Н-тимидина (ED50). Для каждой кле7 точной линии определяли также относительное бок около 1´10 клеток. Опухолям давали сфорчисло клеток, в которых экспрессировались перемироваться в течение 27 дней, а затем мышей рандомизировали по размеру опухоли. Мышам несенные аденовирусом гены, по отношению к клеткам, в которых экспрессировался маркерный вводили через день интратуморально или перитуген бата-галактозидазы, перенесенный контрольморально вирус ACNTH или контрольный вирус ным вирусом. Данные, представленные на Фиг.14 ACN (1´109 инфекционных единиц в 100мкл). Всеи в Таблице 2, показывают, что комбинированная го каждая мышь получила три инъекции. Спустя обработка вирусом ACNTK и ганцикловиром спо24 часа после первой инъекции аденовируса мысобна ингибировать пролиферацию клеток всех шам интраперитонеально вводили ганцикловир проверенных линий (контролем в данном случае (Cyto vene, 100мг/кг). Эти инъекции проводили служила обработка контрольным аденовирусом ежедневно в течение 10 дней. Дважды в неделю ACN в соче тании с ганцикловиром). Наоборот, проверяли размер опухолей и общий вес животновирусный вектор AANTK был эффективен в тех го. Замеры опухолей проводили в трех измеренигепатоцеллюлярных линиях, которые экспрессиях при помощи градуированных штангенциркулей ровали АФП. Кроме того, комбинация и объем опухолей определяли по формуле: 4/3 ¶ AANTK/ганцикловир была более эффективна при r3, где r - одна вторая среднего размера опухоли. засеве клеток с высокой плотностью. Результаты Рекомбинантные аденовирусы были испольТаблица 2 Линия клеток MD AMB468 ВТ549 HLF CHANG НЕР-3В HEP-G2 LOW HEP-G2 HIGH АФП + + Экспрессия бета-гал. +++ +++ +++ +++ + ++ ++ "Голые" мыши с опухолями, вызванными введением клеток Нер3В (группа из пяти животных), получали интратуморально или перитуморально эквивалентные дозы ACNTK или контрольного вируса ACN. Спустя 24 часа после первого введе ACN >100 >100 >100 >100 80 90 89 ED50 ACNTK 2 100 >100 >100 >100 8 35 4 ния рекомбинантного аденовируса начиналось ежедневное введение ганцикловира каждой мыши. Дважды в неделю определяли с помощью штангенциркуля размеры опухоли у каждого животного и средние размеры опухолей представле 39 70909 40 ны на Фиг.16. На 58-й день средний размер опухоAND GR AHAM, F.L. (1987) лей был ниже у обработанных ACNTK мышей, EMBO Journal 6:1733-1739. однако разница не была статистически значимой GOODING, L.R., AND WOLD, W.S.M. (1990) (р