Спосіб визначення ртуті

Предполагаемое изобретение относится к биохимии и может быть использовано в медицине, токсикологии, ветеринарии, сельском хозяйстве в лабораторных условиях при исследовании биологических жидкостей и других веществ. Известен способ быстрого и простого определения в полевых условия х в питьевой и сточных водах, почве и донных отложениях, золе на уровне "мг/мл" кадмия, свинца, ртути и др. тяжелых металлов (Microbiological assay pad and kit for selective detection of toxicants: Патент ГДР №4206147, кл. C21Q1/02/ Bittlon G., Koopman B.; Academ. Wissen-Schaften DOR, №518686; Заявл. 03.05.90; НКИ 435/288 // Реф. журн. "Биотехнология". - 1993. - №6. - Р1653П) прототип. Способ основан на специфическом ингибировании последними микробной бетагалактозидазы и позволяет отличить тяжелые металлы от химических веществ-неметаллов, которые бета-галактозидазу не инактивируют. Анализируемую пробу инкубируют в течение 90мин при температуре 35°C с содержащими бета-галактозидазу клетками E.coli, каплю инкубационной смеси наносят на подложку из фильтрующего материала, пропитанную раствором хромогенного или флюорогенного субстрата, и по ослаблению интенсивности окраски по сравнению с таковой в контроле судят о наличии в пробе тяжелых металлов. Недостатком прототипа является неспецифичность по отношению к ртути. Задача изобретения повышение специфичности теста для определения ртути отдельно и в смеси с другими металлами. Для решения поставленной задачи проводят реакцию ингибирования маркерного фермента и определяют остаточную ферментативную активность по окрашиванию субстрата, нанесенного на подложку. При этом в реакции ингибирования используют маркерный фермент, который предварительно конъюгируют с белком и затем сенсибилизируют на подложке из полистирола. Реакцию ингибирования проводят непосредственно на полистироле с использованием серии разведении исследуемого образца. Определяют остаточную ферментативную активность на полистироле после удаления реакционной жидкости отмыванием. Определяют концентрацию ртути с учетом характера изменений остаточной ферментативной активности маркерного фермента по мере уменьшения концентрации контрольного и исследуемого образцов. Отличительными признаками предлагаемого изобретения являются: - перед реакцией ингибирования маркерный фермент конъюгируют с белком и сенсибилизируют на подложке из полистирола; проводят реакцию ингибирования непосредственно на полистироле с использованием серии разведении исследуемого образца; - удаляют реакционную жидкость отмыванием перед определением остаточной ферментативной активности на полистироле; - строят графики зависимости величины оптической плоскости от концентрации для контроля и каждого образца отдельно; - определяют концентрацию ртути с учетом характера изменений остаточной ферментативной активности маркерного фермента по мере уменьшения концентрации контрольного и исследуемого образцов. Использование в реакции ингибирования сенсибилизированного на полистирол маркерного фермента позволяет определять тяжелые металлы. Конъюгирование маркерного фермента с белком приводит к изменению конформации и способствует образованию новых каталитических центров. Именно эта процедура обеспечивает возможность ингибирования маркерного Фермента солями ртути в концентрации 10г/мл. Такая закономерность наблюдается лишь для солей ртути, в отличие от олова, свинца и других. Наличие ртути в смеси с другими металлами приводит к увеличению угла наклона концентрационной кривой и снижению предела чувствительности суммарного содержания солей металлов до 10-7г/мл. Использование в качестве подложки полистирола дает возможность как сокращения времени проведения анализа непосредственно каждого образца, одновременно микроанализа 40 исследуемых образцов в дубликате при использовании стандартных планшет, так и способствует повышению чувствительности анализа. Отличительные признаки заявляемого решения соответствуют критерию "новизна" и требованиям изобретательского уровня. Проведенные исследования в отделе биохимии Института терапии АМН Украины и отделе молекулярных основ семиотики Института биохимии НАН Украины (г.Киев) показали, что использование данного способа позволяет повысить специфичность теста по сравнению с прототипом, что позволяет определять концентрацию ртути и суди ть о содержании солей ртути в смеси с солями других металлов, а также повысить чувствительность анализа до 10-9г/мл, уменьшить продолжительность реакции ингибирования до 10мин и расширить функциональные возможности способа для его применения в научных и практических работах. На фиг.1 представлена зависимость величины, оптической плотности (в единицах экстинкции) от времени воздействия соли ртути (в минуту) на пероксидазу, сенсибилизированную в комплексе с белком; концентрация соли ртути составляет 0,001мкг/мл; на фиг.2 - зависимость величины оптической плотности от концентрации солей металлов (мкг/мл), где 1 - соль ртути, позиции 2, 3, 4, 5, 6 - смеси солей ртути с солями други х металлов: никеля (2), олова (3), меди (4), кадмия (5), цинка (6). Предложенный способ осуществляют следующим образом. 1. Маркерный фермент (пероксидазу) конъюгируют с белком (альбумином сыворотки быка) известным способом (Курманова Л.И., Ермолин Г.А., Эткин А.Ф., Цветков С.В. // Лаб. дело. - 1984. - №2. - С.80 - 83). 2. Сенсибилизируют конъюгат на полистироловые планшеты в концентрации 20мкг/мл путем высушивания из раствора 0,33М карбоната аммония при 37°C. Несвязавшийся конъюгат отмывают 2 - 3 раза водой с 0,05% Твин20. 2. Проводят реакцию ингибирования. Для этого готовят серию разведении исследуемых образцов с помощью 1М трис-HCl буфера pH 8,6, принимая во внимание предлагаемое содержание ртути и други х металлов. Отдельно готовят калибровочный материал: исходный раствор соли ртути в концентрации 2мг в 1мл растворе буфера и затем серию разведении от 0,5 до 0,001мкг в 1мл. Наносят калибровочный материал и исследуемые образцы на планшет, подготовленный по п.2, и затем инкубируют в термостате 10мин при 37°C. 3. Удаляют реакционную жидкость путем стряхивания и отмывания как описано в п.1. Просушивают планшет на фильтровальной бумаге. 4. Определяют остаточную ферментативную активность на полистироле путем добавления субстратной смеси, содержащей цитратный буфер, ортофенилендиамин и пергидроль. Инкубируют при комнатной температуре до 5мин. Останавливают реакцию добавлением 50% серной кислоты. 5. Измеряют оптическую плотность на многоканальном микроспектрофотометре при 490нм. 6. По результатам измерений оптической плотности исследуемых образцов в полулогарифмической системе координат строят для каждой серии разведении исследуемого образца графики зависимости величины оптической плотности от концентрации, принимая за точку отсчета значение максимальной концентрации калибровочной кривой, построенной для соли ртути (фиг.2, позиция 1, значение "4" на оси абсцисс). Примечание: Если величина оптической плотности не изменяется при уменьшении концентрации исследуемого образца, следует изменить разведение для достижения соответствия значений оптической плотности исследуемого и контрольного образцов. 7. Определяют концентрацию ртути по калибровочной кривой с учетом разведения образца. 8. Судят о наличии ртути в смеси с другими металлами по увеличению угла наклона графика ингибирования исследуемого образца относительно оси абсцисс по сравнению с углом наклона калибровочной кривой (фиг.2, композиции 2, 3, 4, 5, 6). Основные характеристики способа: - чувствительность - 10-9г; интервал линейности калибровочного графика - 10-6 - 10 -9г; - воспроизводимость - коэффициент вариации не превышает 10%. Пример 1. Определение содержания ртути. 1. Пероксидазу конъюгируют с альбумином сыворотки быка известным способом. 2. Сенсибилизируют конъюгат на полистироловые планшеты в концентрации 20мкг/мл путем высушивания из раствора 0,33М карбоната аммония при 37°C. Несвязавшийся конъюгат отмывают 2 - 3 раза водой с 0,05% Твин20. 2. Проводят реакцию ингибирования. Готовят калибровочный материал: исходный раствор соли ртути в концентрации 2мг в 1мл 1М трис-HCl буфера pH 8,6 и затем серию разведении от 0,5 до 0,001мкг в 1мл. По аналогичной схеме готовят серию разведении исследуемых образцов. Наносят калибровочный материал и пробы исследуемых образцов на планшет, подготовленный по п.2, и затем инкубируют в термостате 10мин при 37°C. 3. Удаляют реакционную жидкость путем стряхивания и отмывания как описано в п.1. Просушивают планшет на фильтровальной бумаге. 4. Определяют отстаточную ферментативную активность на полистироле путем добавления субстратной смеси, содержащей цитратный буфер, ортофенилендиамин и пергидроль. Инкубируют при комнатной температуре до 5мин. Останавливают реакцию добавлением 50% серной кислоты. 5. Измеряют оптическую плотность на многокаскадном микроспектрометре при 490нм. 6. По результатам измерений оптической плотности в полулогарифмической системе координат строят для каждой серии разведении исследуемого образца графики зависимости величины оптической плотности от концентрации, принимая за точку отсчета значение максимальной концентрации калибровочной кривой, построенной для соли ртути (фиг.2, позиция 1, значение "4" на оси абсцисс). Результат: Величина оптической плотности не изменяется при уменьшении концентрации некоторых исследуемых образцов, следовательно, изменяют разведение образцов для достижения соответствия значений оптической плотности таковым контрольного образца. Величина оптической плотности максимальная, таким образом, ингибиторная активность ртути минимальна и необходимо использовать более концентрированный исходный материал. Готовят насыщенный раствор образцов в рабочем буфере путем их растворения порциями известной массы (1 - 2мг). 6.1. Повторяют пп.1 - 6. Результат: Величина оптической плотности увеличивается приуменьшении концентрации исследуемых образцов аналогично калибровочной кривой (фиг.2, позиция 1). 7. Определяют концентрацию ртути по калибровочной кривой (фиг.2, позиция 1) с учетом разведения образцов. Пример 2. Определение содержания ртути (2 й возможный вариант). 1. Пероксидазу конъюгируют с альбумином сыворотки быка известным способом. 2. Сенсибилизируют коньюгат на полистироловые планшеты в концентрации 20мкг/мл путем высушивания из раствора 0,33М карбоната аммония при 37°C. Несвязавшийся конъюгат отмывают 2 - 3 раза водой с 0,05% Твин20. 2. Проводят реакцию ингибирования. Готовят калибровочный материал: исходный раствор соли ртути в концентрации 62мг в 1мл М трис-HCl буфера pH 8,6 и затем серию разведении от 0,5 до 0,001мкг в 1мл. По аналогичной схеме готовят серию разведении исследуемых образцов. Наносят калибровочный материал и пробы исследуемых образцов на планшет, подготовленный по п.2, и затем инкубируют в термостате 10мин при 37°C. 3. Удаляют реакционную жидкость путем стряхивания и отмывания как описано в п.1. Просушивают планшет на фильтровальной бумаге. 4. Определяют остаточную ферментативную активность на полистироле путем добавления субстратной смеси, содержащей цитратный буфер, ортофенилендиамцн и пергидроль. Инкубируют при комнатной температуре до 5мин. Останавливают реакцию добавлением 50% серной кислоты. 5. Измеряют оптическую плотность на многоканальном микроспектрометре при 490нм. 6. По результатам измерений оптической плотности в полулогарифмической системе координат строят для каждой сери разведении исследуемого образца графики зависимости величины оптической плотности от концентрации, принимая за точку отсчета значение максимальной концентрации калибровочной кривой, построенной для соли ртути (фиг.2, позиция 1, значение "4" на оси абсцисс). Результат: Величина оптической плотности увеличивается при уменьшении концентрации образцов, к тому же, угол наклона калибровочной кривой (фиг.2, позиция 1) меньше примерно в 2 - 3 раза по сравнению с углом наклона графиков зависимости величины оптической плотности от концентрации исследуемых образцов (фиг.2, позиции 2, 3, 4, 5, 6). Таким образом, судят о наличии в исследуемых образцах солей ртути в смеси с солями други х металлов. 7. Определяют концентрацию солей металлов, находящихся в исследуемых образцах, по соответствующим графикам зависимости оптической плотности от их концентрации (фиг.2, позиции 2, 3, 4, 5, 6).