Спосіб прогнозування зниженої щільності кісткової тканини (щкт) у жінок

Спосіб прогнозування зниженої щільності кісткової тканини (ЩКТ) у жінок, який передбачає забір біологічного матеріалу (крові, слини, зішкрябків чи мазків) та його дослідження, який відрізняється тим, що з біологічного матеріалу виділяють ДНК та визначають наявність точкових мутацій гена інтерлейкіну 10 (Іл-10) за допомогою застосування методу полімеразної ланцюгової реакції з використанням праймерів, які визначають наявність мутації (-1082 A/G), і при наявності генотипу АА прогнозують зниження щільності кісткової тканини. (19) (21) u200814442 (22) 15.12.2008 (24) 12.05.2009 (46) 12.05.2009, Бюл.№ 9, 2009 р. (72) ПОВОРОЗНЮК ВЛАДИСЛАВ ВОЛОДИМИРОВИЧ, UA, БУТЕНКО ГЕННАДІЙ МИХАЙЛОВИЧ, UA, ПІШЕЛЬ ІРИНА МИКОЛАЇВНА, UA, ГРИГОР'ЄВА НАТАЛІЯ ВІКТОРІВНА, UA, ЄВТУШЕНКО ОЛЬГА ОЛЕКСАНДРІВНА, UA, ЛЕОНОВ ЮРІЙ ІГОРОВИЧ, UA (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ", UA 3 лено 191 маркер, серед них Іл-10), з використанням біохімічних методів ІФА (імуноферментного аналізу) або методів визначення кількості РНК (рибонуклеїнової кислоти). Спосіб дозволяє проводити діагностування загальної популяції людей, але передбачає використання досить дорогих тест-систем, більшість з яких не доступні в Україні. Завданням даної корисної моделі є створення способу прогнозування ризику наявності низької ЩКТ за рахунок виділення та дослідження ДНК з біологічного матеріалу (крові, слини, зішкрябів чи мазків), визначення наявності точкових мутацій гену інтерлейкіну 10 (-1082 A/G), і при наявності генотипу АА прогнозують ризик наявності низької ЩКТ, і забезпечують можливість раннього (в молодому віці) прогнозу виникнення остеопорозу у жінок, що дозволить завчасне застосування попереджувальних заходів. Спосіб здійснюється наступним чином: 1. Відбираємо у пацієнта біологічний матеріал (кров / слина / зішкряби / мазки). 2. Виділення ДНК проводимо з допомогою набору „ДНК-сорб-В” (фірми АмплиСенс, Росія). - у пробірки з лізуючим розчином вносимо по 100мкл проби; - проби ретельно змішуємо на вортексі та прогріваємо 5хв. при 65°С. Центрифугуємо 5с при 5 тис. об./хв.; - ретельно ресуспендуємо сорбент на вортексі. В кожну пробірку додаємо по 25мкл ресуспендованого сорбенту, змішуємо на вортексі, залишаємо у штативі на 2хв., ще раз змішуємо і залишаємо у штативі на 5хв.; - осаджуємо сорбент центрифугуванням при 5 тис. об./хв. протягом 30с, видаляємо супернатант; - додаємо в проби по 300мкл розчину для відмивання 1, змішуємо на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Осаджуємо сорбент центрифугуванням при 5 тис. об./хв. протягом 30с. Видаляємо супернатант; - додаємо в проби по 500мкл розчину для відмивання 2, змішуємо на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, центрифугуємо 30с при 10 тис. об./хв. Видаляємо супернатант. Процедуру повторюємо; - поміщаємо пробірки в термостат при 65°С на 5-10хв. для підсихання сорбенту; - в пробірки додаємо по 50мкл ТЕ-буфера для елюції ДНК, змішуємо на вортексі, ставимо в термостат при 65°С на 5хв., періодично струшуємо; - центрифугуємо пробірки при 12 тис. об./хв. протягом 1хв. Супернатант містить очищену ДНК, проби готові для постановки ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції). 3. Постановка ПЛР: - готуємо реакційну суміш для ПЛР, виходячи з необхідного числа реакцій, додаємо реагенти в наступному порядку: вода, буфер для ПЛР, розчин dNTP (100мМ), ДНК-полімераза Taq (5u/мкл), праймер (IL-10 С: 5’-СТТ GGA ТТА AАТ TGG ССТ TAG А; IL-10 F: 5’-ACT ACT AAG GCT ТСТ TTG GGA A; IL-10 R: 5’-СТА СТА AGG СТТ СТТ TGG GAG). 41212 4 - в пронумеровані пробірки наливаємо по 15мкл реакційної суміші і 1 краплі мінеральної олії; - додаємо зразок ДНК і закриваємо пробірки. - центрифугуємо пробірки протягом 10с, щоб шар води опинився під олією. - пробірки ставимо до ампліфікатора та встановлюємо програму роботи: 96 o C − 1хв. 96o С − 15 с ⎫ ⎪ 65o С − 50 с ⎬ 72o С − 40 с ⎪ ⎭ 10 циклів 96o С − 10 с ⎫ ⎪ 60o С − 50 с ⎬ 72o С − 40 с ⎪ ⎭ 20 циклів 4. Аналіз отриманих продуктів проводимо з допомогою електрофорезу в 1,5% агарозному гелі з бромистим етідієм. Електрофорез проводимо в 1х ТВЕ (трисбейс-ЕДТА) буфері при 200В, 80мА, протягом 15хв. 5. Після проведення електрофорезу гель розміщуємо на робочій поверхні трансілюмінатора, закриваємо темною камерою з фотоапаратом і фотографуємо гель. 6. Аналізуємо отримані результати. При наявності генотипу АА робимо висновок про ризик виникнення у пацієнта зниженої ЩКТ. Новим в способі є те, що з біологічного матеріалу (крові, слини, зішкрібів чи мазків) виділяють ДНК та визначають наявність точкових мутацій гену Іл-10 за допомогою застосування методу полімеразної ланцюгової реакції з використанням специфічних праймерів, які визначають наявністьмутації (-1082 A/G), і дають можливість (при наявності мутації) віднесення пацієнта до групи ризику виникнення остеопорозу на ранньому етапі. Здійснення запропонованого способу не пов'язане із травмуванням пацієнта, проведення дослідження можливе після транспортування біологічних зразків до діагностичних центрів на далекі відстані й не потребує транспортування або присутності пацієнта під час проведення генотипування. Спосіб, що заявляється, ілюструється прикладами. Приклад 1. Жінка 30 років. При проведенні дослідження виявлено генотип АА, що свідчить про високу ймовірність наявності низької щільності кісткової тканини (Р