Штам porcine teschovirus для виробництва ветеринарних імунобіологічних препаратів

Штам Porcine teschovirus для виробництва ветеринарних імунобіологічних препаратів проти ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней депонований у Депозитарії Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів за номером 486. (19) (21) u201009325 (22) 26.07.2010 (24) 25.02.2011 (46) 25.02.2011, Бюл.№ 4, 2011 р. (72) ДЕРЕВ'ЯНКО СТАНІСЛАВ ВАСИЛЬОВИЧ, БОВА ТЕТЯНА ОЛЕКСАНДРІВНА, СОРОКА ВІКТОР ІВАНОВИЧ, БОКУН АЛЕВТИНА ОЛЕКСАНДРІВНА, БОЖОК ЛАРИСА ВАЛЕНТИНІВНА, БАБІЧ НІНА ВАСИЛІВНА 3 сол. ім. Д.К. Заболотного НАН України. - Київ, 2008. - 20 с.]. В основу корисної моделі поставлено завдання одержати імунологічно домінуючий штам збудника ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней для виготовлення вакцини й діагностичних препаратів. Поставлена мета досягається шляхом виділення штаму "Дніпровський-34" Porcine teschovirus 1-го серотипу в культурі клітин СНЕВ із головного мозку свиноматки, хворої на ензоотичний енцефаломієліт (хворобу Тешена) свиней. Штам "Дніпровський-34" Porcine teschovirus-1 депоновано в Депозитарії Державного науковоконтрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (03151, м. Київ, вул. Донецька, 30) 03 листопада 2009 року за реєстраційним номером 486. Штам "Дніпровський-34" вірусу ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней характеризується наступними ознаками та властивостями. Морфологічні ознаки. Віріони сферичної форми без зовнішньої ліпідопротеїдної оболонки, розміром 28-30 нм, Mr 8,6×106, мають ікосаедричний тип симетрії і плавучу густину в градієнті густини хлористого цезію 1,34-1,35 г/см3, коефіцієнт седиментації 150-160 S. Фізико-хімічні властивості. Вірус стійкий до дії ліпідорозчинників (ефіру, хлороформу), протеолітичного ферменту (трипсину), інгібіторів ДНК (актиноміцину D, 5-бром-2 дезоксиуридину), рН 2,011,0, прогрівання в присутності двовалентних іонів магнію при температурі 50°С 1 годину. Вірус інактивується 0,5 % розчином фенолу за 18 год., 3 % розчином гідроксиду натрію, 2 % розчинами формаліну, крезолової, сірчаної, азотної кислот за 1 год., при кип'ятінні - миттєво. Культуральні ознаки. Вірус культивується в перещеплюваних культурах клітин СНЕВ, ВНК-21, РК-15, ПТП, у яких викликає цитопатичний ефект, що спостерігається в залежності від доз вірусу через 24-72 години, і накопичується в титрі 7,0-8,5 lg ТЦД50/см3. In vivo вірус культивується на свинях. При інтрацеребральному зараженні накопичується у центральній нервовій системі в титрі 3,5-4,5 lg ТЦД50/см3. Патогенність. Механізм передачі аліментарний, поширений серед свинопоголів'я в Україні, висококонтагіозний, вірулентний лише для свиней. Стабільність біологічних властивостей. Штам вірусу стабільний і зберігає свої біологічні та антигенні властивості після 28-ми разового пасажування в культурі клітин СНЕВ. Антигенні властивості. У реакції віруснейтралізації антигенно споріднений з еталонними штамами тешовірусу 1-го серотипу Talfan, Teschen 199 й Tirol, епізоотичним контрольним штамом „Чернігівський-2372" на 100 % та вакцинним штамом „Перечинський-642" вірусу ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней на 66 %, константа нейтралізації гомологічною сироваткою - 4,0 lg ТЦД50/см3. Імуногенні властивості. Парантеральне введення вірусу стимулює утворення віруснейтралі 57372 4 зуючих антитіл через 21 добу після введення в титрі 1:128. В організмі свиней також утворюються антитіла, які виявляються у реакціях зв'язування комплементу та преципітації, що забезпечує захист тварин при експериментальному зараженні. Умови зберігання. У нативному стані (мозкова, вірусовмісна культуральна суспензія) вірус зберігається при температурі - 18°С і нижче, у ліофілізованому при +2-8°С. Підтримання штаму проводять шляхом репродукції на чутливих культурах клітин та свинях. Одержаний штам "Дніпровський-34" Porcine teschovirus 1-го серотипу використовують для виготовлення діагностичних засобів. Можливість здійснення корисної моделі підтверджується наступними прикладами. Приклад 1. Застосування штаму тешовірусу в наборі діагностикумів ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней у реакції нейтралізації. Штам "Дніпровський-34" тешовірусу свиней накопичують у культурі клітин СНЕВ у титрі 7,5-8,5 lg ТЦД50/см3. Після очищення і концентрування вірус використовують для одержання гіперімунної сироватки на кролях з титром не менше 1:512. Для ідентифікації виділеного вірусу та виявлення віруснейтралізуючих антитіл у сироватках крові тварин у реакції нейтралізації використовують 100 ТЦД50 антигену або 10 нейтралізуючих доз гіперімунної кролячої сироватки до штаму "Дніпровський-34" тешовірусу. До кожного із досліджуваних вірусів або розведень сироватки крові об'ємом 0,5 см та вмістом у 0,1 см3 100 ТЦД50 антигену (10 нейтралізуючих доз сироватки) додають по 0,5 см з вмістом у 0,1 см 10 нейтралізуючих доз сироватки (100 ТЦД50 антигену). Після витримки одержаної суміші при температурі 37°С упродовж 60-90 хв. по 0,2 см3 вносять у 2-4 пробірки, в які попередньо добавляють по 0,8 см3 підтримуючого середовища. Контрольні та дослідні пробірки інкубують при температурі 37°С. Облік результатів здійснюють на 4 і 7 добу. Нейтралізація вірусу (сироватки) в указаних дозах свідчить про їх наявність у досліджуваному матеріалі. Приклад 2. Застосування штаму тешовірусу в наборі діагностикумів ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней у реакції імунофлюоресценції. Ідентифікацію ізолятів вірусів проводять у мазках-відбитках мозочку, довгастого мозку, амонових рогів, нюхових луковиць, кори півкуль головного мозку та грудного й поперекового відділів спинного мозку від загиблих або вимушено забитих у стадії парезу та паралічу хворих тварин. Мазки висушують на повітрі при кімнатній температурі, фіксують від 10 до 15 хв. при температурі 0-2°С охолодженим до -15°С ацетоном. На фіксовані препарати наносять робоче розведення позитивної сироватки до штаму "Дніпровський-34" тешовірусу свиней першого серотипу, на два - негативної. Скельця інкубують 30 хв. при 37°С у вологій камері. Препарати тричі промивають буферним розчином і вносять робоче розведення флюоресціюючого глобуліну. Предметні скельця витриму 5 57372 ють 25-30 хв. при 37°С у вологій камері, промивають у трьох змінах буферу по 10 хв., ополіскують дистильованою водою і висушують на повітрі. Мікроскопія препаратів проводиться за допомогою люмінісцентного мікроскопа. У позитивних випадках виявляють специфічне світіння у вигляді яскраво-зеленої блискучої люмінісценції клітин, на скельцях з негативною сироваткою світіння відсутнє. Приклад 3. Застосування штаму тешовірусу в імуноферментній тест-системі для виявлення імуноглобулінів класу G до збудника хвороби Тешена в сироватках крові свиней. У планшет для мікротитрування вносять робочий розчин очищеного, інактивованого етиленіміном та стабілізованого гліцерином штаму "Дніпровський-34" тешовірусу в об'ємі 100 мкл на лунку. Інкубують при 4°С упродовж 16-18 годин. Видаляють неадсорбований антиген, проводять триразове відмивання планшету промивним буферним розчином. Вносять зразки сироваток та контролі в розведенні 1:100. У лунки А1-D1 вносять 100 мкл позитивної сироватки крові свині, у лунки Е1-Н1 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 6 100 мкл негативної сироватки, у лунки А2-D2 - 100 мкл досліджуваної сироватки №1, Е1-Н1 - досліджуваної сироватки №2 і т.д. На одному планшеті можна досліджувати 22 сироватки крові свиней у чотирьох повторах. Інкубують при 37°С упродовж 1 години, триразово відмивають і вносять робоче розведення антисвинячого кон'югату. Після інкубування при 37°С упродовж 1 години і відмивання вносять субстрат/хромогенну суміш в об'ємі 100 мкл на лунку. Інкубують 15 хв., зупиняють реакцію внесенням стоп-реагенту 100 мкл на лунку. Облік результатів реакції проводять на рідері при 450 нм/620 нм. Дослідженням у реакції нейтралізації 22 позитивних сироваток крові свиней, відібраних від щеплених вакциною проти хвороби Тешена, встановлено 100 % чутливість тест-системи. Специфічність тест-системи, що визначалась з використанням 22 сироваток крові свиней, які за результатами реакції нейтралізації гарантовано не містили антитіл до вірусу хвороби Тешена, становила 100 %. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601