Спосіб виготовлення вакцини проти пастерельозу качок емульсійної інактивованої

Спосіб виготовлення вакцини проти пастерельозу качок емульсійної інактивованої, при якому як імуногени використовують вітчизняні штами 3 імуногенів штамів пастерел регіонального походження : SQ № 1058, SQ №1060 Pasteurella multocida серовару В, які інактивують ацетилетилетиленіміном, який вносять у суспензію бактеріальної маси до концентрації в межах 4,5-5,5% з корегованим рН 7,2-7,4 а по закінченні девіталізації отриманий антиген вносять у стабілізуюче середовище і з'єднують з масляним ад'ювантом, щоб забезпечити процес виготовлення емульсійної протипастерельозної вакцини. Технічний результат від використання корисної моделі полягає в підвищенні імуногенної активності і специфічності препарату шляхом підбору вітчизняних (регіональних) штамів Українського походження і збереження вихідних властивостей білкових антигенів пастерел при девіталізації. Зазначений технічний результат досягається створенням корисної моделі, охарактеризованої наступною сукупністю ознак: 1) Процес виготовлена емульсійної вакцини проти пастерельозу качок; 2) Одержання суспензії бактеріальної маси пастерел, що найменше одного серовару із вітчизняних штамів; 3) Девіталізація отриманої культури; 4) Як інактивант використовують ацетилетилетиленімін (АЕЕІ); 5) АЕЕІ вносять у бактерійну суспензію в ефективній кількості; 6) АЕЕІ вносять у бактерійну суспензію до концентрації 4,5-5,5% з корегованим соляною кислотою до pH 7,2-7,4; 7) Девіталізацію ведуть протягом 12 годин при 37-38°С; 8) Осадження бактерійного антигену ультрацентрифугуванням; 9) Розведенням бактерійного антигену стабілізуючим середовищем; 10) Як стабілізуюче середовище використовують сахарозо-пептонне середовище; 11) з'єднання бактерійного антигену з масляним ад'ювантом; 12) бактерійний антиген і масляний ад'ювант з'єднують у співвідношенні 3:7-1:1; Завдяки використанню пропонованого процесу отримана вакцина проти пастерельозу качок емульсійна інактивована, що володіє в порівнянні з прототипом, більш високою імуногенною активністю і специфічною безпекою. Досягнення технічного результату від використання пропонованого процесу зумовлюється тим, що використані високоімуногенні епізоотичні штами вітчизняного походження: Pasteurella multocida SQ № 1058 та штам SQ № 1060 серовару В. Отже, пропонований процес відповідає умовам патентоспроможності та критерію «новизна». Процес виготовлення емульсійної вакцини виконується таким чином. Приклад 1 Для готування серії вакцини використовували 2 ампули із сухою культурою виробничих штамів Pasteurella multocida серовару В. У кожну ампулу 3 вносили 2-3 см живильного середовища. Як живильне середовище використовували бульйон Хоттінгера з рН 7,2-7,4 і показником амінного азоту 64326 4 200-250мг%. Отриманою рівномірною суспензією 3 пастерел кожного серовару в обсязі 0,3 см засі3 вали по 2-3 флакона ємність 100 см , утримуючих 3 по 40-50 см живильного середовища. Одночасно робили контрольні висіви кожної культури в пробірки з МПА, МПБ, МППБ під вазеліновою олією. Посіви культивували протягом 12 годин при 37-38°С. У результаті одержали культури першої генерації пастерел кожного серовару. Культури першої генерації досліджували мікроскопічно. Для одержання культури другої генерації чисту культуру першої генерації пастерел кожного 3 серовару засівали по 5-15 см на живильному середовищі в трьох-п'яти, або десятилітрові бутилі зі 1 змістом середовища /2 об'єму сулії з одночасним проведенням контрольного висіву в пробірки з МПА, МПБ, МППБ під вазеліновою олією й у бактеріологічні чашки з МПА. Матриксну культуру другої генерації у кількості, необхідної для засіву в реактор вирощували у термостаті протягом 6-8 годин при 37-38°С з 2-3 разовим перемішуванням культури протягом 1-2 хвилин. З вирощеної культури робили посіви в пробірки з живильними середовищами, чашки Петрі з МПА, проводили мікроскопію і визначали концентрацію мікробних клітин, 9 3 які повинні бути не менш , ніж 10 КУО / см . Для одержання бактеріальної маси матриксну культуру пастерел кожного серовару вносили в окремий реактор з живильним середовищем. Матриксну культуру вносили в об'ємі 5-10% від робочого об'єму реактора. Культивування вели при 37-38°С і рН 7,0-7,2 протягом 12 годин до одержання суспензії з концентрацією мікробних клітин 2-410 9 3 КУО/ см . Для регулювання рН використовували розчини Na2 PO4 і NaН2PO4. Вирощені культури пастерел кожного серовару за допомогою забуференного фізіологічного розчину приводили до єдиної найменшої концентрації, змішували у рівних пропорціях перекачуючи в стерильний реактор отриману бактеріальну суміш піддавали девіталізації ацетилетіленіміном. Для цього в бактеріальну суміш вносили АЕЕІ до концентрації 4,5-5,5% і девіталізували до 12 годин в умовах перемішування при 50 - 80 об/хв., температурі 37-38°С. По закінченні девіталізації антиген залишили при кімнатній температурі в стаціонарних умовах на 18-24 години. Контроль повноти девіталізації здійснювали шляхом висіву вмісту реактора на бульйон і агар Хоттінгера і інкубування посівів при 37 - 38°С протягом 18 -24 години. Росту бактеріальної мікрофлори на живильних середовищах не повинно було бути. Отриманий антиген очищали від баластових білків АЕЕІ, а також концентрували осадження на проточній ультрацентрифузі. Концентрат антигену ресуспендували у сахарознопептонному середовищі до концентрації 10 - 12 3 КУО/см по 18 по оптичному стандартові Діск ім. Тарасовича. Після цього антиген з'єднували з масляним ад'ювантом (МА) «Montanid ISA 70» фірми «SEPPIS» (Франція). При цьому кількість водної фази, що містить антиген, складала в обсязі 30 %,а масляного ад'юванта 70 %. Для виготовлення емульсійної вакцини використовували колоїдні млини. 5 Отримана вакцина являє собою речовину білого кольору з жовтуватим відтінком, злегка грузлої консистенції, рН 7,2-7,4. При тривалому збереженні можливо не значне відшарування мінерального масла над нерозшарованою однорідною емульсією. При ретельному струшуванні вакцина здобуває вид гемогенної маси. Приклад 2 Бактеріологічний контроль стерильності отриманої вакцини здійснювали наступним шляхом. Проби вакцини висівали на сироватковий бульйон і агар, рідке і щільне середовище Сабуро, МПА, МПБ - по 3 пробірки, на МППБ - по 2 пробірки і 2 флакони, середовище Ендо - по 3 чашки. 3 Для виявлення аеробів висівали по 0,5см вакцини 3 в 1 пробірку і 2 см один флакон, а для виявлення 3 анаеробів -відповідно по 1 і 5 см . Пробірки, 2 бактеріологічні чашки, флакони з посівами на всіх середовищах, крім Сабуро, витримували в термостаті при (37,0+0,5)°С, на середовищі Сабуро при (21,04+0,5)°С протягом 7 діб. Після закінчення зазначеного терміну робили пересівання, за винятком посівів на МПА, середовище Ендо, агар Сабуро і сироватковий агар. Пересівали проби на ті ж живильні середовища в тих же обсягах, що і при посіві. Вторинні посіви витримували 7 діб. Одночасно проводили контроль стерильності живильних середовищ. Результати первинного і вторинного посівів оцінювали шляхом мікроскопічного дослідження посівів. Ріст мікроорганізмів на живильних середовищах був відсутній. Приклад 3 Контроль нешкідливості і реактогенності отриманої вакцини здійснювали наступним шляхом. Нешкідливість вакцини була перевірена на 6 морських свинках і 12 білих мишах. Препарат вводили підшкірно морським свинкам в області паху 1 і 2 см, білим мишам в області 3 спини 0,5см . Спостереження за тваринами вели протягом 10 діб. Усі тварини залишилися живими. Для перевірки реактогенності препарат вводи3 ли внутрішньом'язово 6 каченятам по 5 см . Через 14 днів після введення вакцини, у каченят на місці ін'єкції препарату збереглися місцеві зміни у вигляді ущільнення тканин, величиною від 3 1 до 3 см , ущілення однорідні, без розм'якшення, безболісні. При розтині птиці у товщі м'язового шару виявлені ясно-жовтого кольору гранульоми щільної консистенції. Приклад 4 Для іспиту імуногенної активності стриманої вакцини на білих мишах використовували по 10 тварин на серовар. Комп’ютерна верстка Мацело В. 64326 6 Вакцину вводили 20 білим мишам підшкірно в 3 області спини в обсязі 0,1 см (1,5 млрд.м.к) одноразово. Через 21 добу після імунізації по 10 вакцинованих і по 5 інтактних білих мишей заражали підшкірно попередньо відтитрованою смертельною дозою пастерел відповідного серовару. Серовар В вводили в дозі 10-20 ж.м.к. на білу 3 мишу (0,2 см 20 - годинній бульйонною культурою 7 в розведенні 10 з накопиченням 1 млрд.ж.м.к.у 3 1см живильного середовища. Контрольні миші загинули протягом 24-36 годин. Вакциновані залишилися живили протягом 10 діб спостереження після загибелі контролю. Приклад 5 Для іспиту імуногенної активності отриманої вакцини на качках використовували по 4 качки на кожен серовар. Вакцину вводили 8 качкам внутрішньом'язово 3 в стегно в обсязі 0,5см (7,5 млр.ж.м.к). Одноразово через 21 день після імунізації по 4 вакцинованих і 2 інтактних качки заражали внутрішньом'язово попередньо від титрованою смертельною дозою пастерел відповідного серовару. Серовар В вводили в дозі 30 ж.м.к. на одну ка3 чку 0,5 см 20 - годинної бульйонної культури в 8 3 розведені 10 з накопиченням 1 млрд.ж.м.к. у 1см живильного середовища. Контрольна група качок загинула протягом 24-36 годин. Вакциновані залишилися живі протягом 10 діб спостереження після загибелі контролю. Серовар В вводили в дозі 500 ж.м.к. на 1 качку 3 (0,5 см 20 годинної бульйонної культури в розве3 денні 10 з накопиченням 1 млрд.ж.м.к. у 1см живильного середовища.) Контрольна група птиці загинула протягом 6-7 діб. Вакциновані залишилися живими протягом 10 діб спостереження після загибелі контролю. Приклад 6 Зроблено дослідження з порівняльного вивчення ефективності інактивованих протипастерельозних вакцин отриманих на підставі вітчизняних виробничих штамів пастерел. Дослід проведений на качках, термін спостереження 6 місяців. Дослідження підтвердили високу імуногенність вакцини проти пастерельозу качок емульсійної інактивованої з вітчизняних штамів. Таким чином, завдяки використанню пропонованого способу отримана вакцина проти пастерельозу качок емульсійна інактивована яка володіє більш високою імуногенною активністю та специфічною безпекою. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601