Спосіб виготовлення вакцини проти пастерельозу курей емульсійної інактивованої

Спосіб виготовлення вакцини проти пастерельозу курей емульсійної інактивованої, що включає використання як імуногенів вітчизняних штамів пастерел Українського походження: Pasteurella 3 хронічному перебігу хвороби відмічають ціаноз шкірного покриву, слизових оболонок, гребеню; птиця втрачає апетит, відстає у розвитку; спостерігають також кон'юнктивіт, задишку, на останніх стадіях захворювання - кульгавість, викривлення кінцівок, опухання сережок. На розтині виявляють запалювальні процеси в печінці й легенях, серозний або фібринозний перикардит, казеозні маси фібрину в порожнині суглобів і сухожильних піхов. При локалізованій формі клінічні ознаки і ураження залежать від місця проникнення інфекції. Профілактику пастерельозу птиці здійснюють відповідно до „Інструкції про заходи з профілактики та ліквідації захворювання птиці на пастерельоз", затвердженої наказом Державного департаменту ветеринарної медицини України 04.12.2002 № 69, зареєстровано в Міністерстві юстиції України 23 грудня 2002 р. за № 997/7285. У нашій країні пастерельоз птиці широко розповсюджений і наносить птахогосподарствам значний збиток. Важливе місце серед мір боротьби з пастерельозом займає вакцинопрофілактика. Відомий спосіб виготовлення сорбованої протипастерельозної вакцини, який включає суспензійне вирощування виробничих штамів пастерел, осадження отриманої культури 10% розчином алюмінієвих квасців та інактивацію 0,16-0,18 формаліном протягом 6 діб. (А.С.СССР №94044 кл.30Н6, 17.02.51). Недоліком вакцини отриманої даним способом, є нетривалість імунітету у вакцинованої птиці. Відомий спосіб інактивації вірусів при виробництві вакцин проти вірусних захворювань в якому використовують в якості інактиванта етиленімін [A.C. СРСР № 1594771 A61K39/12, 12N7/04, 07.07.93]. Недолік використання етиленіміну полягає в його високій токсичності, а також недоліком є те, що концентрації етиленіміну, використовувані для інактивації вірусів не придатні для інактивації пастерел. Найбільш близьким до пропонованої корисної моделі, щодо сукупності істотних ознак, є спосіб виготовлення емульсійної протипастерельозної вакцини, що включає одержання суспензії збудника, його інактивацію 0,5-4% розчином ацетилетиленіміна і наступне з'єднання інактивованого антигену з масляним ад'ювантом [патент РФ N 2162339, кл. А61К39/102, А61L6, C12N1/00, 17.04.2000 г.]. Недоліком способу є те, що отриманий препарат володіє порівняно невисокою імуногенною активністю при використанні його в Україні. Це обумовлено невідповідністю антигенних детермінант виробничих штамів Російського походження, епізоотичним варіантам, що циркулюють в Україні, що й приводить до зниження їх антигенної і імуногенної активності. Це рішення може бути прототипом. В основу корисної моделі, поставлено задачу розробити процес виготовлення емульсійної інактивованої вакцини проти пастерельозу курей , що включає одержання суспензії культури пастерел, девіталізацію отриманої культури та з'єднання бактерійного антигену з масляним ад'ювантом шляхом використання як імуногенів штамів пастерел: SQ № 1057 Pasteurella multocida серовару А та штам SQ № 1059 Pasteurella multocida серовару D, які інактивують ацетілетилетиленіміном, який вносять у суспензію бактеріальної маси до конце 43296 4 нтрації в межах 3,5 - 4,5% з корегованим рн 7,07,4, а по закінченні девіталізації отриманий антиген вносять у стабілізуюче середовище і з'єднують з масляним ад'ювантом, щоб забезпечити процес виготовлення емульсійної протипастерельозної вакцини. Технічний результат від використання корисної моделі полягає в підвищенні імуногенної активності і специфічності препарату шляхом підбору вітчизняних (регіональних) штамів Українського походження і збереження вихідних властивостей білкових антигенів пастерел при девіталізації. Зазначений технічний результат досягається створенням корисної моделі, охарактеризованої наступною сукупністю ознак: 1. Процес виготовлення емульсійної вакцини проти пастерельозу курей. 2. Одержання суспензії бактеріальної маси пастерел, що найменше, одного серовару із вітчизняних штамів. 3. Девіталізація отриманої культури. 4. Як інактивант використовують ацетілетилетиленімін (АЕЕІ). 5. АЕЕІ вносять у бактерійну суспензію в ефективній кількості. 6. АЕЕІ вносять у бактерійну суспензію до концентрації 3,5-4,5% з корегованим соляною кислотою до рн 7,0-7,4. 7. Девіталізацію ведуть протягом 10-14 годин при 37-38°С. 8. Осадження бактерійного антигену ультрацентрифугуванням. 9. Розведенням бактерійного антигену стабілізуючим середовищем. 10. Як стабілізуюче середовище використовують сахарозо-пептонне середовище. 11. З'єднання бактерійного антигену з масляним ад'ювантом. 12. Бактерійний антиген і масляний ад'ювант з'єднують у співвідношенні 3:7-1:1. Завдяки використанню пропонованого процесу отримана вакцина проти пастерельоза курей емульсійна інактивована, що володіє в порівнянні з найближчим аналогом більш високою імуногенною активністю і специфічною безпекою. Досягнення технічного результату від використання пропонованого процесу зумовлюється тим, що використані високоімуногенні епізоотичні штами вітчизняного походження: Pasteurella multocida SQ № 1057 серовару А та штам SQ № 1059 серовару D. Отже, пропонований процес відповідає умовам патентоспроможності та критерію «новизна». Процес виготовлення емульсійної вакцини виконується таким чином. Приклад 1. Для готування серії вакцини використовували 2 ампули із сухою культурою виробничих штамів Pasteurella multocida сероварів А і D. У кожну ампулу вносили 2-3 см3 живильного середовища. Як живильне середовище використовували бульйон Хоттінгера з рн 7,0-7,4 і показником амінного азоту 200-250мг%. Отриманою рівномірною суспензією пастерел кожного серовару в обсязі 0,3 см3 засівали по 2-3 флакона ємність 100 см3, утримуючих по 40-50 см3 живильного середовища, значне від 5 шарування мінерального масла над нерозшорованою однорідною емульсією. При ретельному струшуванні вакцина здобуває вид гемогенної маси. Приклад 2. Бактеріологічний контроль стерильності отриманої вакцини здійснювали наступним шляхом. Проби вакцини висівали на сироватковий бульйон і агар, рідке і щільне середовище Сабуро, ΜΠΑ, МПБ - по 3 пробірки, на МППБ - по 2 пробірки і 2 флакони, середовище Ендо - по 3 чашки. Для виявлення аеробів висівали по 0,5 см3 вакцини в 1 пробірку і 2 см3 один флакон, а для виявлення анаеробів - відповідно по 1 і 5 см3. Пробірки, 2 бактеріологічні чашки, флакони з посівами на всіх середовищах, крім Сабуро, витримували в термостаті при (37,0+0,5)°С, на середовищі Сабуро при (21,04 +0,5)°С впродовж 7 діб. Після закінчення зазначеного терміну робили пересівання, за винятком посівів на ΜΠΑ, середовище Ендо, агар Сабуро і сироватковий агар. Пересівали проби на ті ж живильні середовища в тих же обсягах, що і при посіві. Вторинні посіви витримували 7 діб. Одночасно проводили контроль стерильності живильних середовищ. Результати первинного і вторинного посівів оцінювали шляхом мікроскопічного дослідження посівів. Ріст мікроорганізмів на живильних середовищах був відсутній. Приклад 3. Контроль нешкідливості і реактогенності отриманої вакцини здійснювали наступним шляхом. Нешкідливість вакцини була перевірена на 6 морських свинках і 12 білих мишах. Препарат вводили підшкірно морським свинкам в області паху 1 і 2 см3, білим мишам в області спини 0,5см3. Спостереження за тваринами вели протягом 10 діб. Усі тварини залишилися живими. Для перевірки реактогенності препарат вводили внутрішньом'язово 6 куркам по 5 см3. Через 14 днів після введення вакцини, у курей на місці ін'єкції препарату збереглися місцеві зміни у вигляді ущільнення тканин, величиною від 1 до 3см3. Ущільнення однорідні, без розм'якшення, безболісні. При розтині птиці у товщі м'язового шару виявлені ясно - жовтого кольору гранульоми щільної консистенції. Приклад 4. Для іспиту імуногенної активності стриманої вакцини на білих мишах використовували по 10 тварин на кожен серовар. Вакцину вводили 20 білим мишам підшкірно в області спини в обсязі 0,1 см3 (1,5 млрд.м.к) одноразово. Через 21 добу після імунізації по 10 вакцинованих і по 5 інтактних білих мишей заражали підКомп’ютерна верстка Л.Литвиненко 43296 6 шкірно попередньо відтитрованою смертельною дозою пастерел відповідного серовару. Серовар А вводили в дозі 10-20 ж.м.к. на білу мишу (0,2 см3 20 -годинній бульйонною культурою в розведенні 107 з накопиченням 1 млрд.ж.м.к.у 1см3 живильного середовища. Контрольні миші загинули впродовж 24 - 36 годин. Вакциновані залишилися живими впродовж 10 діб спостереження після загибелі контролю. Серовар Д вводили в дозі 300 ж.м.к на білу мишу (0,3 см3 20 - годинній бульйонної культури в розведеній 106 з нагромадженням 1 млн.ж.м.к у 1см3 живильного середовища. Контрольні миші пали впродовж доби. Вакциновані залишилися живими впродовж 10 діб спостереження після загибелі останньої контрольної білої миші. У висновку проведено оцінку вакцини кількісним методом. Приклад 5. Для іспиту імуногенної активності отриманої вакцини на курках використовували по 4 курки на кожен серовар. Вакцину вводили 8 куркам внутрішньом'язово в стегно в обсязі 0,5см3 (7,5млр.ж.м.к). Одноразово через 21 день після імунізації по 4 вакцинованих і 2 інтактних курках заражали внутрішньом'язово попередньо відтитрованою смертельною дозою пастерел відповідного серовару. Серовар А вводили в дозі 50 ж.м.к. на одну курку 0,5 см3 20 - годинної бульйонної культури в розведенні 108 з накопиченням 1 млрд.ж.м.к. у 1 см3 живильного середовища. Контрольна група курей загинула впродовж 24-36 годин. Вакциновані залишилися живі впродовж 10 діб спостереження після загибелі контролю. Серовар D вводили в дозі 500 ж.м.к. на 1 курку (0,5 см3 20 годинної бульйонної культури в розведенні 106 з накопиченням 1 млрд.ж.м.к. у 1 см3 живильного середовища). Контрольна група птиці загинула впродовж 6-7 діб. Вакциновані залишилися живими впродовж 10 діб спостереження після загибелі контролю. Приклад 6. Зроблено дослідження з порівняльного вивчення ефективності інактивованих протипастерельозних вакцин отриманих на підставі вітчизняних виробничих штамів пастерел. Дослід проведений на птиці, термін спостереження 6 місяців. Дослідження підтвердили високу імуногенність вакцини проти пастерельозу курей емульсійної інактивованої з вітчизняних штамів. Таким чином, завдяки використанню пропонованого способу отримана вакцина проти пастерельозу курей емульсійна інактивована, яка володіє більш високою імуногенною активністю та специфічною безпекою. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601