Спосіб біомоніторингу антропогенного забруднення довкілля

Винахід відноситься до гігієни або зокрема до біомоніторингу забруднення навколишнього середовища. Для виявлення інтенсивності мутагенного фону довкілля, спричиненого антропогенним забрудненням, використовуються різні рослинні тест-системи, які базуються на таких сучасних методах: 1) оцінка молекулярногенетичних порушень за частотою явищ гомологічної рекомбінації у трансгенних лініях рослин Arabidopsis thaliana і Nicotiana tabacum; 2) метод визначення цито- і генотоксичності води і грунтів на основі ана-телофазного аналізу первинної меристеми корінців рослин (цибулі, кукурудзи, часнику), пророщених на різних пробах досліджуваних об'єктів [1-4]. Найбільш близьким прототипом винаходу є "Process for monitoring mutagens in plants" - European Patent №00116070.4-2116, властивостями якого є оцінка інтенсивності мутагенного фону води та грунтів, що здійснюється на основі використання трансгенних рослин Arabidopsis thaliana і Nicotiana tabacum. Недоліком прототипу є те, що даний спосіб передбачає застосування виключно двох ліній Arabidopsis thaliana і Nicotiana tabacum, які чутливі до радіаційного забруднення і не дозволяють об'єктивно тестувати мутагени хімічної природи. Відомий метод визначення хімічного забруднення за допомогою ана-телофазного аналізу первинних корінців цибулі посівної Allium сера, який рекомендований групою експертів Міжнародної комісії із захисту від мутагенів оточуючого середовища [5]. Перевагою цього методу цитогенетичного моніторингу є добра кореляція його результатів з результатами, отриманими на інших тест-системах [6]. Allium-тест дає можливість вивчати два аспекти токсичності: а) загальну токсичність (або фітотоксичність) на основі пригнічення росту корінців цибулі (Allium сера), б) цитотоксичність, документовану мікроскопічним дослідженням хромосомних аберацій в клітинах кореневої меристеми. Недоліком цього методу є те, що не враховуються ряд показників (енергія проростання насіння, активність поділу клітин, хромосомні аберації в різних фазах мітозу), окремі ядерні аномалії, які повністю охопили б спектр пошкодження спадкового апарату і довели природу потенційних мутагенів довкілля. Для усунення вказаних недоліків нами пропонується використання трансгенних рослин в поєднанні з аналізом порушень мітозу: для первинної діагностики антропогенного забруднення використовується Arabidopsis thaliana з різним ступенем чутливості до мутагенів, а для конкретизації чинника забруднення - насіння цибулі Allium сера. Лише поєднана характеристика змін фенотипу і явищ гомологічної рекомбінації трансгенних рослин з врахуванням ана-тело-метафазних показників, активності мітотичних процесів об'єктивно відображає ступінь цито- і генотоксичності екологічних факторів. Спектр аберацій та ядерних аномалій клітин первинної меристеми з високим рівнем достовірності доводить природу факторів забруднення (хімічне або радіаційне). Методика використання Arabidopsis thaliana полягає у наступному. Забір питної води та грунтів проводиться за загально прийнятими методами [7]. Насіння трансгенних рослин висаджується у грунт/воду і вирощується в стандартних умовах - 16 годин день/8 годин ніч, при температурі 22°С протягом 2 тижнів. Для проведення гістохімічної обробки рослини стерилізуються - промивання протягом 1 хвилини у 0,02% розчині гіпохлориду натрію, 5 хвилин у 70% етанолі та 3 рази по 1 хвилині у дистильованій воді. Наступний етап - вакуум-інфільтрація стерильним буферним розчином, що містить 3-бромо-4-хлоро-5-умбиферилглюкуронід (X-glu), потім інкубація в цьому ж розчині протягом 48 годин. Для екстракції хлорофілу та візуалізації рекомбінаційних явищ рослини обробляються 70% етанолом. Після цього виявляються сині плями в різних органах рослин: листках, стеблах, корінцях. Частота явищ гомологічної рекомбінації корелює з кількістю і площею синіх плям і відповідає інтенсивності мутагенного фону. Методика виготовлення препарату з другого тест-об'єкту - насіння цибулі Allium сера. Насіння пророщується в чашках Петрі, у кількості 50 насінин на пробу, в присутності досліджуваного фактора (води, ґрунту, суспензії харчових продуктів, ліків тощо) в термостаті при температурі 21°С. Підрахунок енергії проростання насіння, відбір корінців та визначення їх довжини проводиться через 72 годин, що відповідає другому періоду активності мітозу. Фіксація корінців здійснюється в розчині етанолу та оцтової кислоти (3:1) протягом 24 годин. Підготовка давлених препаратів та їх фарбування 2% орсеїном, а для виявлення ДНК - за Фьольгеном, проводиться за стандартними методиками [7-8]. Мітотичний індекс визначається у 400 клітинах з 5-ти полів зору в різних фазах мітозу (про-, мета-, ана- і телофазах); хромосомні аберації - у 100 мета-, ана- і ранніх телофазах. Ідентифікуються хромосомні та хроматидні аберації на 100 клітин і на одну аберантну клітину, як показники радіаційного та хімічного мутагенезу. Результати дослідження Проведено моніторингове дослідження води та ґрунтів в 2000 та 2002 роках з 15 екологічних зон ІваноФранківської області: зони посиленого радіаційного контролю (Снятинський район), хімічно забрудненого (м.Івано-Франківськ, м.Коломия) та умовно екологічно чистого (Верховинський і Косівський райони) регіонів. За фенотипом трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana ідентифіковано наявність потенційних мутагенів у довкіллі (табл.1). Таблиця 1 Морфологічна характеристика трансгенних ліній Arabidopsis thaliana, пророщених на різних пробах грунтів № п/п 1 2 3 Лінії трансгенних рослин Col-O Bin AR/SiR2№8 Col-O Bin AR/SiR2№7 BAR Bin Верховинський район м. Івано-Франківськ м. Коломия Висота % Висота % Висота % Бутонізація Бутонізація Бутонізація стебла схожості стебла схожості стебла схожості (см) (см) (см) 1,5±0,5 75,0 1,5±0,5 62,5 1,0±0,5 50,0 2,0±0,4 100,0 2,1±0,5 100,0 2,7±0,8 25,0 1,3±0,6 75,0 1,3±0,6 25,0 1,3±0,6 37,5 4 5 6 7 8 AR/RPД3-1 BAR Bin AR/RPД3-9 Col-O pTA/SiR2№2 Col-O pTA/SiR2№3 Col-O pMEX/SiR2№3 Col-O pMEX/SiR2№9 1,0±0,5 62,5 0,7±0,3 62,5 0,7±0,5 37,5 1,0±0,5 75,0 1,2±0,5 50,0 + 0,5±0,0 37,5 2,0±0,5 87,5 5,2±0,8 75,0 + 3,9±0,5 50,0 + 3,0±0,8 50,0 + 5,0±0,6 62,5 + 4,1±0,6 50,0 + 5,4±0,8 75,0 + 4,1±1,8 62,5 + 4,8±0,2 25,0 + Інтенсивність антропогенного забруднення оцінювали за частотою явищ інтрахромосомної гомологічної рекомбінації. При пророщуванні трансгенних рослин на пробах ґрунтів з міста Івано-Франківська встановлено найбільшу кількість синіх плям у генетично модифікованих лініях Col-0 pMEX/SiR2 №3, Col-0 pMEX/SiR2 №9. Аналогічна закономірність спостерігалась при пророщуванні Arabidopsis thaliana на воді та ґрунтах м. Коломиї. Частота рекомбінаційних процесів ДНК у рослинах, що виросли на пробах води та ґрунтів рекреаційних зон, була найменшою, що доводить можливість їх відношення до екологічно чистих територій (р