Спосіб діагностики туберкульозу in vitro

Спосіб діагностики туберкульозу in vitro, який здійснюється на мазках крові після їх сухотермічної обробки протягом 30-60хв. з наступним послідовним нанесенням на мазок крові 10%-20% розчину натрієвої солі етилендіамінодибурштинової кислоти та туберкуліну і діагностують туберкульоз при появі продуктів реакції у вигляді преципітатів в зоні дії реагентів проти відсутності преципітатів в зоні реакції на мазках крові здорових людей. (19) (21) a200802870 (22) 05.03.2008 (24) 10.12.2008 (46) 10.12.2008, Бюл.№ 23, 2008 р. (72) СУСЛОВ ЄВГЕНІЙ ІВАНОВИЧ, UA, ПІДГ АЄВСЬКА ТЕТЯН А ПЕТРІВН А, U A, ПІДГ АЄВСЬКИЙ ІГОР ЮРІЙОВИЧ, U A (73) СУСЛОВ ЄВГЕНІЙ ІВАНОВИЧ, UA, ПІДГ АЄВСЬКА ТЕТЯН А ПЕТРІВН А, U A, ПІДГ АЄВСЬКИЙ ІГОР ЮРІЙОВИЧ, U A (56) UA C2 22351 17.09.2001 3 85026 - невизначеність чітких технічних умов виконання методу: відсутній базовий етап підготовки мазків крові - обов'язкова сухотермічна обробка мазків; - застосування в якості реагенту перенасиченого розчину комплексону - трилона Б в якості нефізіологічного для об'єкту реагенту; - використання розведеного туберкуліну (1:20), що негативно впливає на кінцевий результат реакції - знижує її специфічність та чутливість. В основу винаходу, що заявляється, поставлено завдання створити не шкідливий для організму, ефективний специфічний та чутливий спосіб діагностики туберкульозу на мазках крові (in vitro) та визначити чіткі технічні умови виконання методу, підібравши відповідні реагенти. Це може здійснитися шляхом обробки мазків крові комплексоном та туберкуліном після етапу термічного їх сушіння, в результаті чого в зоні дії реагентів досягається поява візерунку кінцевих продуктів реакції, притаманних туберкульозу. Серед можливих реагентів був вибраний комплексонат динатрієвої солі етилендіамінодибурштинової кислоти. Поставлене завдання вирішується тим, що мазки крові пацієнтів, згідно винаходу, піддають термічному сушінню при температурі 60°С на протязі 30-40хв., далі обробляють 10-20% водним розчином натрієвої солі етилендіамінодибурштинової кислоти та туберкуліном. У хворих на туберкульоз цим досягається специфічна гістохімічна реакція білків крові з реагентами з утворенням осаду біоорганічної речовини у вигляді складносполучних преципітатів, що свідчить про активну фазу туберкульозу, проти відсутності преципітатів на мазках крові здорових пацієнтів. На відміну від відомої внутрішньошкірної реакції Манту, здійснення гістохімічної реакції на мазках крові (in vitro) способом, що заявляється, не має протипоказань і головне - усувається алергізіція організму. В ході проведення експериментів були відпрацьовані технічні умови для найкращого проведення гістохімічної реакції: температура сушіння та оцінювалася вологість мазків крові. Для інформативності результатів гістохімчної реакції були випробувані розчини не розведеного туберкуліну та розведеного водою в співвідношенні 1:10, 1:20, 4 1:30. Був підібраний специфічний комплпексон розчини динатрієвої солі етилендіамінодибурштинової кислоти. Дослідним шляхом встановлено, що оптимальними технічними умовами і реагентами для проведення реакції є: - мазки крові після сухотермічної обробки; - не розведений туберкулін; - розчини динатрієвої солі етилендіамінодибурштинової кислоти в межах від 10% до 20%. Технічні умови і склад реагентів вкрай різняться від таких способу - прототипу. Дослідним шляхом встановлено, що на хід реакції впливає термічна обробка мазків. При відсутності сухотермічної обробки мазків крові, а також при її тривалості до 30хв. і більш, ніж 40хв. гісто хімічна реакція на мазках крові виявлялася не інформативною, тому що виникає нечіткий візерунок преципітатів - продуктів реакції. Визначено, що на вологих мазках крові без сухотермічної обробки також реакція не інформативна. У звязку з цим, встановлено, що оптимальний термін сухо термічної обробки - 30-40хв. (Табл.). Визначено, що зменшення концентрації розчину реагенту динатрієвої солі етилендіамінодибурштинової кислоти нижче, ніж 10%, унеможливлює процес преципітації білків на мазках крові, а збільшення концентрації цього реагенту вище за 20% унеможливлює процес розчинення речовини, реагент втрачає прозорість та випадає в осад. Таку емульсію неможливо застосовувати в реакції. В ході відпрацювання способу було встановлено, що отпимальним є використання нерозведеного туберкуліну як одного з реагентів, при якому кінцеві продукти реакції - преципітати визначалися найбільш чітко. З метою визначення діагностичної чутливості і специфічності нового способу було проаналізовано результати дослідження мазків крові 50 здорових осіб та 100 хворих на активний туберкульоз легень за методом, що заявляється. Встановлено, що гістохімічна реакція діагностики туберкульозу на мазках крові (in vitro) способом, що заявляється, є специфічною для туберкульозу і високочутливою, усуваються неспецифічні побічні артефаки в зоні реакції, що траплялися у прототипі (Табл.). Таблиця Залежність чутливості способу діагностики туберкульозу на мазках крові (in vitro), що заявляється від тривалості термічного сушіння мазків крові Висушені мазки крові на протязі 30-40хв. Кількість спостереЧутливість Кількість поКількість іс- Кількість похи- Чутливість (%) жень (%) Кількість істинохибнотинопозитивбнопозитивних негативних них негативних 50 40 10 80 50 50 100 Не висушені мазки крові Наводимо конкретні приклади здійснення способу. Приклад 1. На мазках крові хворого Х-ва, іст. хв. №744 з діагнозом фіброзно-кавернозний туберкульоз легень в стадії загострення процесу було проведено гістохімічну реакцію за способом прототипу без попередньої термічної обробки з реактивами 25% трилону Б та туберкуліном. В результаті був отриманий нечіткий рисунок реакції, за 5 85026 яким не можливо було встановити точний діагноз туберкульозу в стадії активності. При обробці мазків крові за способом, що заявляється, який здійснювався після попередньої сухотермічної обробки мазків на протязі 30 хв. з наступною дією на мазки 10% розчину натрієвої солі етилендіамінодибурштинової кислоти та нерозведеного туберкуліну був отриманий чіткий рисунок кінцевих продуктів реакції у вигляді преципітатів, за яким був встановлений діагноз туберкульозу в стадії активності, проти неоднозначності у постановці діагнозу при аналізі мазків крові цього пацієнту, оброблених розведеним туберкуліном 1:10. Приклад 2. Мазки крові здорового донора Нко, історія хвороби №558 без попередньої їх сухотермічної обробки фарбували за способом прототипом. Був отриманий нечіткий рисунок кінцевих продуктів реакції, що не дозволяло підтвердити відсутність або наявність захворювання на тубер Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 6 кульоз. При обробці мазків крові цього пацієнту за способом, що заявляється, після попереднього сухотермічного сушіння на протязі 40хв., з наступним впливом реагентів 20% натрієвої солі етилендіамінодибурштинової кислоти та не розведеного туберкуліну був о триманий чіткий рисунок гістохімічної реакції у вигляді радіально розташованих кінцевих продуктів реакції без преципітатів, що свідчило про відсутність туберкульозу. Така ж реакція на зрізах із застосуванням нерозведеного туберкуліну також не дала візерунку осаду. Що свідчить про недоцільність розведення туберкуліну. Спосіб простий та доступний у лабораторній практиці, діагностична чутливість його значно вище у порівнянні з прототипом за рахунок етапу термічного сушіння мазків крові. Може бути рекомендованим у повсякденній діагностичній роботі фтизіатрів та патоморфологів для первинної та диференційної діагностики туберкульозу та скринінгових обстежень населення. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601