Спосіб диференційної діагностики впливу ксенобіотиків на стійкість рослин

Спосіб диференційної діагностики впливу ксенобіотиків на стійкість рослин, що включає вирощування рослин в присутності та відсутності дії стресового фактора, підготовку рослинного препарату до аналізу та визначення стійкості рослин за вмістом антиоксидантів, який відрізняється тим, що проводять спиртову екстракцію коренів дослідних та контрольних рослин, встановлюють вміст спирторозчинних антиоксидантів фенольного типу, періодичну зміну нагромадження яких залежно від дози ксенобіотика визначають за виразом æ 2p × C ö ÷, y = f 0 + A c × sinç j 0 + ç K 0 + K × C÷ è ø де y - вміст антиоксидантів фенольного типу, ммоль/г сухої речовини або % до контролю; f0 - базова функція; Винахід стосується рослинництва, а саме вирощування рослин в умовах дії ксенобіотиків. Спосіб може бути використаний для диференційної оцінки токсичного впливу різних ксенобіотиків, що зменшують продуктивність рослин, оскільки знижують їх адаптивні можливості, які пов'язані з функціонуванням системи антиоксидантного захисту. Відомий спосіб діагностики впливу ксенобіотиків на стійкість рослин, згідно з яким оцінку проводять за вмістом глутатіону [1]. До причин, що перешкоджають спрощенню та скороченню тривалості процедур пробопідготовки і аналізу слід віднести необхідність попереднього отримання похідних глутатіону при обробці спеціальними реагентами, а також складність аналітичних прийомів з використанням високоефективної рідинної хроматографії із спектрофлуорометричною детекцією. Крім того, спосіб не дає можливості проведення діагностики стійкості рослин в діапазоні токсичних доз ксенобіотика. Найбільш близьким до об'єкта, що заявляється, є спосіб діагностики впливу стресового фактора на стійкість рослин [2], який включає вирощування тест-рослин в присутності та відсутності дії стресового фактора, підготовку рослинного препарату до аналізу та визначення стійкості рослин за вмістом антиоксидантів. Відомий спосіб передбачає, що після вирощування рослин проводили відбір листя контрольних та дослідних рослин щодоби протягом 4 діб, розтирали наважку листя з рідким азотом до порошкоподібного стану та переносили у воду. Визначення вмісту водорозчинних антиоксидантів сульфгідрильного типу у зразках проводили після додавання реагентів (4% розчин сульфосаліцилової кислоти, 5% розчин КI, 1% розчин крохмалю) з наступним титруванням 0,001н розчином КІО3. Розраховували різницю вмісту антиоксидантів в зразках дослідних рослин відносно контрольних і на основі змін цього показника проводили діагностику стійкості рослин до дії стресового фактора. (19) UA (11) 85040 (13) у разі однакової спрямованості базової функції f0 порівнюють значення К для різних ксенобіотиків і при зменшенні цього показника визначають підсилення токсичного впливу ксенобіотика на рослини. C2 Ac - найбільше відхилення встановленого значення вмісту антиоксидантів фенольного типу від обчисленого згідно з базовою функцією f0 , ммоль/г сухої речовини або % до контролю; j 0 - початкова фаза коливань; С - концентрація ксенобіотика у середовищі проростання, ммоль/л або мг/л; K 0, K - коефіцієнти, 3 85040 4 Операція підготовки рослинного препарату з вважають рослини, які вирощені при дії ксенобіовикористанням рідкого азоту відзначається складтика, а контрольними рослинами - рослини, які ністю. Визначення вмісту антиоксидантів потребує вирощені при відсутності такої дії. застосування набору хімічних реагентів. НеобхідПідготовка препарату до аналізу не потребує ність аналізу показника 4 рази протягом 4 діб піддодаткового прийому гомогенізації з використанвищує тривалість процесу діагностики. Крім того, ням рідкого азоту. Додаткова обробка екстракту проведення діагностики при одній дозі стресового аналітичними реагентами стає непотрібною, оскіфактора встановлює стійкість рослин саме для цієї льки аналіз проводять за власними спектральними дози, що не дозволяє проводити диференційну характеристиками спирторозчинних антиоксиданоцінку впливу різних стресових факторів в діапатів фенольного типу в екстракті. Діагностичний зоні діючих доз. показник визначають одноразово, а встановлення В основу винаходу поставлено задачу у спойого залежності від концентрації ксенобіотика згідсобі диференційної діагностики впливу ксенобіотино математичного виразу дозволяє порівнювати ків на стійкість рослин шляхом виключення прийовплив різних ксенобіотиків в діапазоні діючих доз му гомогенізації рослинного зразка у рідкому азоті замість оцінки фізіологічного стану рослин при дії в операції підготовки препарату, проведення спирпевної дози одного стрес-фактора. Внаслідок цьотової екстракції коренів, виключення прийому обго забезпечується спрощення та скорочення триробки екстракту аналітичними реагентами, одновалості процедур підготовки препарату до аналізу і разового встановлення змін вмісту антиоксидантів виміру діагностичного показника. фенольного типу в тест-рослинах в діапазоні діюЗаявлений спосіб здійснюється наступним чичих доз стресового фактора за параметрами власном. ного поглинання рослинного екстракту забезпечиОдночасно пророщують насіння дослідних роти спрощення та скорочення тривалості процедур слин на живильних розчинах з різною концентраціпідготовки препарату до аналізу і виміру діагносєю ксенобіотика і контрольних рослин при відсуттичного показника. ності такої дії. Проводять відбір коренів рослин і Поставлена задача вирішується тим, що у висушують зразки. Отримують спиртовий екстракт способі диференційної діагностики впливу ксенокоренів, визначають на спектрофотометрі оптичну біотиків на стійкість рослин, який включає вирощугустину екстракту при аналітичному значенні доввання рослин в присутності та відсутності дії стрежини хвилі встановлюють вміст антиоксидантів сового фактора, підготовку рослинного препарату фенольного типу у рослинному препараті. На осдо аналізу та визначення стійкості рослин за вміснові цих даних визначають вид базової функції f0 і том антиоксидантів згідно з винаходом проводять значення Ас, j0 , К 0, К у математичному виразі. В спиртову екстракцію коренів дослідних та контроразі однакової спрямованості базової функції f0 льних рослин, встановлюють вміст спирторозчинпорівнюють значення К для різних ксенобіотиків і них антиоксидантів фенольного типу, періодичну при зменшенні цього показника визначають підсизміну нагромадження яких залежно від дози кселення токсичного впливу ксенобіотика на рослини. нобіотика визначають за виразом Приклад 1. Для визначення диференційної діагностики впливу важких металів (свинець та кадмій) на стійкість рослин пророщували насіння куæ 2p × C ö ÷, y = f0 + A c × sinç j 0 + курудзи (гібрид Дніпровський 284MB) в рулонах ç ÷ К0 + К × С ø è фільтрувального паперу на розчинах з різною концентрацією нітратів свинцю та кадмію (2,5¸100·105 де у - вміст антиоксидантів фенольного типу, моль/л), а також воді (контроль) при однаковій ммоль/г сухої речовини або % до контролю; кількості тест-рослин (n=25) та об'ємі живильного f0 - базова функція; середовища в усіх варіантах (200мл). По заверАс - найбільше відхилення встановленого знашенні біотестування (10 діб) проводили відбір зрачення вмісту антиоксидантів фенольного типу від зків коренів. Вміст антиоксидантів фенольного обчисленого згідно базової функції f0, ммоль/г сутипу (ммоль/г сухої речовини) визначали відомим хої речовини або % до контролю; методом після екстракції сухих коренів 80% ізоj0 - початкова фаза коливань; пропанолом та виміру оптичної густини екстракту C - концентрація ксенобіотика у середовищі при 260нм на спектрофотометрі ДУ-7. На основі проростання, ммоль/л або мг/л; отриманих результатів встановили, що базова К0, К - коефіцієнти; функція має вигляд лінійної залежності однакової у разі однакової спрямованості базової функції спрямованості. Періодична зміна нагромадження f0 порівнюють значення К для різних ксенобіотиків і антиоксидантів залежно від діючої дози свинцю при зменшенні цього показника визначають підсивизначали за виразом лення токсичного впливу ксенобіотика на рослини. æ 2p × C ö y = 131 7 - 0,06 × C + 34,0 × sinç 2,2 + , ÷ Спосіб базується на загальній закономірності: ç ÷ 17,0 + 0,68 × С ø è реакції живих організмів на дію несприятливих ; умов середовища можуть мати ефект стимуляції або пригнічення залежно від дози стрес-фактора, що призводить до періодичного характеру адаптивних змін. Терміном "базова функція" позначена залежність, яка задає спрямованість змін (наприклад, лінійна залежність у=а +bх або поліном другого ступеню у=а +b х+сх2). Дослідними рослинами коефіцієнт кореляції між експериментальними та обчисленими значеннями r=0,93, p=0,001. Аналогічна залежність для кадмію мала вигляд æ 2p × C ö y = 142,5 - 0,27 × C + 20,0 × sinç 2,0 + ç ÷ ÷ 10,0 + 0,38 × С ø è (r=0,88, p=0,001). 5 85040 6 Для підтвердження змін фізіологічного стану y = 107,1 + 0,395 × C - 0,0045 × С2 + рослин паралельно визначали загальноприйнятий æ 2p × C ö показник - індекс толерантності (приріст головного + 7,1 sinç 1 57 + ÷ ç, ÷ кореня дослідних рослин відносно контролю, %). 6,3 + 0,38 × С ø è Зниження коефіцієнта К для кадмію (0,38) по(r=0,95, p=0,001). рівняно із свинцем (0,62) співпадало з більш значВ обраному діапазоні концентрацій спостеріним пригніченням життєдіяльності рослин за індегалось посилення токсичного впливу ксенобіотиків -5 2+ ксом толерантності: 10·10 моль/л - 47,2% (Cd ), на рослини при зростанні їх дози, однак ступінь 76,6% (Pb2+); 100·10-5моль/л - 23,7% (Cd2+), 34,6% цього ефекту суттєво різниться. Величина індексу 2+ (Pb ). толерантності рослин для трофі знижувалось в Приклад 2. Аналогічно прикладу 1 порівнюваінтервалі значень 78,4¸38,9%, а для кросу ли вплив на рослини кукурудзи (гібрид Дніпровсь32,0¸11,7%, що підтверджувалось зменшенням кий 284MB) гербіцидів трофі (діюча речовина значення коефіцієнту К: 0,76 (трофі) та 0,38 (крос). ацетохлор) та крос (діюча речовина - хлорсульфуТаким чином, наведені приклади підтверджурон та хлорсульфоксим) в діапазоні концентрацій ють, що при здійсненні заявленого способу досяг2,5¸100мг/л (в розрахунку на діючу речовину). Згінуто спрощення та скорочення тривалості процедно експериментальних результатів за базову фудур підготовки препаратів до аналізу і виміру нкцію визначено поліном другого ступеня з однадіагностичного показника для диференційної оцінковою спрямованістю. Періодична зміна ки токсичного впливу різних ксенобіотиків на стійнагромадження антиоксидантів (% до контролю) кість рослин. залежно від концентрації трофі визначалась за Джерела інформації виразом 1. Gulner G., Kömives Т., Rennenberg H. Enchanced tolerance of transgenic poplar plants overexpressing y = 100 + 0,834 × C - 0,0031× С2 + g-glutamylcysteine systhetase towards æ 2p × C ö + 17,7 sinç ÷ chloroacetanilide herbicides // J. Exp. Bot. - 2001. ç ÷ è 22,85 + 0,76 × С ø V.52, N358. - P. 971-979. (r=0,98, p=0,001). 2. A.c. CPCP №1507254, MKB4 A01G7/00, 1989. Аналогічна залежність для кросу мала вигляд Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601