Антитіло проти підгрупи elr+ cxc-хемокінів

Реферат: + Винахід належить до антитіла, яке специфічно зв'язують сім людських ELR CXC-хемокінів, а саме: Gro-альфа, Gro-бета, Gro-гамма, ENA-78, GCP-2, NAP-2 та IL-8, молекули ДНК, клітинихазяїна та способу лікування неспецифічного виразкового коліту, раку нирки або раку яєчників шляхом введення такого антитіла. UA 116008 C2 (12) UA 116008 C2 UA 116008 C2 + 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Цей винахід стосується антитіл проти ELR СХС-хемокінів і їх використання в лікуванні + захворювань, патогенез яких опосередковується ELR СХС-хемокінами. + ELR СХС-хемокіни (звані так тому, що всі члени родини хемокінів мають амінокислотний мотив E-L-R в безпосередній близькості від їхнього мотиву СХС) відіграють важливу роль у різноманітних патогенних механізмах, у тому числі у міграції нейтрофілів до місць запалення і ангіогенезу. Нейтрофіли додають свій внесок у патогенез деяких гострих і хронічних запальних/аутоімунних захворювань, таких як запальне захворювання кишечнику (IBD), + бляшковий псоріаз і долонно-підошовний пустульоз. ELR СХС-хемокіни також відіграють важливу роль у канцерогенезі і метастазуванні пухлин. Ці хемокіни мають високий ступінь + експресії в пухлинах. У середовищі пухлин ELR СХС-хемокіни залучені до різних провідних шляхів, наприклад, ангіогенезу, мобілізації та інвазії ендотеліальних клітин і лейкоцитів на ділянках пухлин та проліферації і виживання пухлинних клітин. Хемокіни згруповані в чотири підродини: СХС, СС, (Х)С, і СХЗС. У СХС-хемокінів одна + амінокислота відокремлює перші два цистеїни ("мотив СХС"). ELR СХС-хемокіни є лігандами хемокінових рецепторів CXCR1 та/або CXCR2, які являють собою сім зв'язаних з G-білком + рецепторів трансмембранно-доменного типу, що специфічно зв'язують ELR СХС-хемокіни. + Сімома людськими ELR СХС-хемокінами є людський Gro-альфа (також відомий як CXCL1), людський Gro-бета (також відомий як CXCL2), людський Gro-гамма (також відомий як CXCL3), людський ENA-78 (також відомий як CXCL5), людський GCP-2 (також відомий як CXCL6), + людський NAP-2 (також відомий як CXCL7) і людський IL-8 (також відомий як CXCL8). Всі ELR + СХС-хемокіни зв'язують рецептор CXCR2; крім того, деякі ELR СХС-хемокіни зв'язують як рецептор CXCR1, так і рецептор CXCR2 (тобто CXCL6 і CXCL8), всі з яких вносять свій внесок у надлишковість активаційних провідних шляхів. + Антитіла, які зв'язуються з окремими ELR СХС-хемокінами, були описані раніше. Два моноклональні антитіла проти CXCL8 (IL-8) були оцінені в ранніх фазах клінічних випробувань щодо ефективності при запальних захворюваннях. (J Leuk Biol 66:401-410, J Immunol 181:669679) Крім того, у WO 2008/130969 описане антитіло, яке зв'язується з людським IL-8 (CXCL8), людським Gro-альфа (CXCL1), людським Gro-бета (CXCL2), людським Gro-гамма (CXCL3) і людським ЕСА-78 (CXCL5). Однак вказаний опис не показує, що антитіло міцно зв'язується з GCP-2 (CXCL6), і не надає відомості щодо зв'язування з NAP-2 (CXCL7). + Тим не менш, антитіло, яке здатне зв'язати і нейтралізувати всі сім людських ELR СХС+ хемокінів, ще не було описане. Кон'югування одного або декількох людських ELR СХС-хемокінів + залишає відкритою можливість виявлення численних біологічних функцій інших ELR СХС+ хемокінів. Нейтралізація всіх семи ELR СХС-хемокінів могла б вплинути на здатність клітин + + CXCR1 або CXCR2 мігрувати до місць запалення і могла б пригнічувати ангіогенез. З урахуванням значної надлишковості в активаційних провідних шляхах рецепторів CXCR1 і + CXCR2, все ще існує потреба в антитілі, яке зв'яже всі сім людських ELR СХС-хемокінів зі специфічністю і високою спорідненістю. Існує потреба в антитілі, яке нейтралізує всі сім + людських ELR СХС-хемокінів. Існує також потреба в антитілі, яке є фізично стабільнім. Тому бажано створити септаспецифічне антитіло, яке здатне зв'язати і нейтралізувати всі сім + людських ELR СХС-хемокінів і яке є фізично стабільним. Цим винаходом запропоноване антитіло, яке нейтралізує людський Gro-альфа, Gro-бета, Gro-гамма, ENA-78, GCP-2, NAP-2 та IL-8. Цим винаходом також запропоноване антитіло, яке нейтралізує людський Gro-альфа, Gro-бета, Gro-гамма, ENA-78, GCP-2, NAP-2 та IL-8, причому це антитіло зв'язує IL-8 (послідовність SEQ ID NO: 27) по таких амінокислотах: Arg 6, Ilе 10, Ala 35, Ilе40. Далі, цим винаходом запропоноване антитіло, яке нейтралізує людський Gro-альфа, Gro-бета, Gro-гамма, ENA-78, GCP-2, NAP-2 та IL-8, причому це антитіло зв'язує IL-8 (послідовність SEQ ID NO: 27) по таких амінокислотах: Arg 6, Не 10, Ala 35, Не 40 та Leu 49. Цим винаходом запропоноване антитіло, що містить легкий ланцюг і важкий ланцюг, при цьому згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR), і згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR), причому LCVR містить LCDR1, LCDR2, LCDR3, і HCVR містить HCDR1, HCDR2, HCDR3, де LCDR1 являє собою RASQSISNNLH (послідовність SEQ ID NO: 7), LCDR2 являє собою YTSRSVS (послідовність SEQ ID NO: 8), LCDR3 являє собою GQNNEWPEV (послідовність SEQ ID NO: 9), HCDR1 являє собою GYEFTSYWIH (послідовність SEQ ID NO: 10), HCDR2 являє собою NISPNSGSANYNEKFKS (послідовність SEQ ID NO: 11), і HCDR3 являє собою EGPYSYYPSRXaaYYGSDL (послідовність SEQ ID NO: 20), де Хаа являє собою Ε або Q. Цим винаходом, за одним з аспектів, запропоноване антитіло, в якому амінокислотна послідовність HCVR являє собою послідовність SEQ ID NO: 2 або послідовність SEQ ID NO: 14. 1 UA 116008 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Далі, цим винаходом запропоноване антитіло, в якому амінокислотна послідовність LCVR являє собою послідовність SEQ ID NO: 4 або послідовність SEQ ID NO: 16. Цим винаходом запропоноване антитіло, в якому амінокислотна послідовність важкого ланцюга являє собою послідовність SEQ ID NO: 1 або послідовність SEQ ID NO: 13. Далі, цим винаходом також запропоноване антитіло, в якому амінокислотна послідовність легкого ланцюга являє собою послідовність SEQ ID NO: 3 або послідовність SEQIDNO:15. Цим винаходом також запропонована молекула ДНК, що містить першу полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1 або послідовність SEQ ID NO: 13; і містить другу полінуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 3 або послідовність SEQ ID NO: 15. Цим винаходом запропонована клітина ссавця, що містить молекули ДНК, описані вище, причому ця клітина здатна експресувати антитіло, що містить важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1 або послідовність SEQ ID NO: 13, і легкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 3 або послідовність SEQ ID NO: 15. Відомо, що клітини-хазяї ссавців, здатні експресувати функціональні імуноглобуліни, охоплюють клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітини COS і клітини NS0. Для використання в цьому винаході перевага віддається клітинам-хазяям, які являють собою клітини NS0. Далі, цим винаходом запорпонований спосіб продукування антитіла, що містить легкий ланцюг, амінокислотна послідовність якого являє собою послідовність SEQ ID NO: 3 або послідовність SEQ ID NO: 15, і важкий ланцюг, амінокислотна послідовність якого являє собою послідовність SEQ ID NO: 1 або послідовність SEQ ID NO: 13, який включає культивування описаної вище клітини ссавця за таких умов, що згадане антитіло експресується, і виділення експресованого антитіла. Цим винаходом запропонований спосіб лікування неспецифічного виразкового коліту, раку нирки або раку яєчників, який включає введення пацієнту, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості антитіла за цим винаходом. Цим винаходом запропоноване антитіло за цим винаходом для застосування в терапії. Крім того, цим винаходом запропоноване антитіло за цим винаходом для застосування в лікуванні неспецифічного виразкового коліту, раку нирки або раку яєчників. На додаток до цього, цим винаходом запропоноване застосування антитіла за цим винаходом у виготовленні лікарського засобу для лікування неспецифічного виразкового коліту, раку нирки або раку яєчників. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція, яка містить антитіло за цим винаходом і один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв, розріджувачів або наповнювачів. + У значенні, вживаному у цьому описі, термін "людські ELR СХС-хемокіни" означає сім відомих СХС-хемокінів, які мають мотив E-L-R і які зв'язуються з рецептором CXCR1 та/або + CXCR2. Людськими ELR СХС-хемокінами є людський Gro-альфа (також відомий як CXCL1) (послідовність SEQ ID NO: 21), людський Gro-бета (також відомий як CXCL2) (послідовність SEQ ID NO: 22), людський Gro-гамма (також відомий як CXCL3) (послідовність SEQ ID NO: 23), людський ENA-78 (також відомий як CXCL5) (послідовність SEQ ID NO: 24), людський GCP-2 (також відомий як CXCL6) (послідовність SEQ ID NO: 25), людський NAP-2 (також відомий як CXCL7) (послідовність SEQ ID NO: 26) і людський IL-8 (також відомий як CXCL8) (послідовність + SEQ ID NO: 27). У сукупності, всі сім людських ELR СХС-хемокінів у цьому описі називаються + "підгрупою людських ELR СХС-хемокінів". Термін "антитіло" у значенні, вживаному у цьому описі, означає моноклональні молекули імуноглобуліну, що містять чотири поліпептидні ланцюги, два важкі (Н) ланцюги і два легкі (L) ланцюги, пов'язані між собою дисульфідними зв'язками. Кожен важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR) і константну ділянку важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга містить три домени, СН1, СН2 і СН3. Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної ділянки легкого ланцюга (LCVR) і константної ділянки легкого ланцюга, CL. HCVR і LCVR можуть далі підрозділятись на гіперваріабельні ділянки, які називають ділянками, що обумовлюють комплементарність (CDR), які чергуються з ділянками, які є більш консервативними і які називають каркасними ділянками (FR). Кожна HCVR і LCVR складається з трьох CDR і чотирьох FR, розмішених від аміно-кінця до карбокси-кінця у такому порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ділянки CDR HCVR називають HCDR1, HCDR2 і HCDR3. Ділянки CDR LCVR називають LCDR1, LCDR2 і LCDR3. CDR містять більшість залишків, які утворюють специфічні взаємодії з антигеном. На цей час існує три системи визначення CDR для антитіл, які використовуються для визначення послідовностей. Визначення CDR за номенклатурою Кебота (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological 2 UA 116008 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) грунтується на варіабельності послідовностей антитіла. Визначення CDR за номенклатурою Чотья (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901917 (1987); Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) грунтується на тривимірних структурах антитіл і топологіях петель CDR. Визначення CDR за номенклатурою Чотья є ідентичним визначенням CDR за номенклатурою Кебота, за винятком HCDR1 і HCDR2. Для цілей цього винаходу, для визначення CDR використовують гібрид визначень за номенклатурами Кебота і Чотья. Визначення амінокислот на ділянках HCVR і LCVR здійснюють у відповідності з номенклатурою Кебота. Крім того, зрозуміло, що термін "антитіло" охоплює будь-які клітинні посттрансляційні модифікації у антитілі, в тому числі, але не обмежуючись ними, ацилювання і глікозилування. У значенні, вживаному у цьому описі, термін "нейтралізуюче антитіло" означає антитіло, + наслідком зв'язування якого з ELR СХС-хемокіном є пригнічування біологічної активності, + індукованої цим хемокіном. Це пригнічування біологічної активності, індукованої ELR xeмокіном, може бути оцінено із застосуванням одного або більше стандартного(-их) in vitro аналіза(-ів), відомого(-их) в цій галузі (дивись Приклади). Крім того, зрозуміло, що терміни "пригнічувати" або "нейтралізувати" у значенні, вживаному у цьому описі по відношенню до активності антитіла за цим винаходом, означає здатність антагонізувати, зменшувати або порушувати розвиток, інтенсивність або ступінь біологічної активності, індукованої одним або + декількома ELR СХС-хемокіноми. У значенні, вживаному у цьому описі, термін "септаспецифічне антитіло" означає антитіло, + яке зв'язує всі сім людських ELR СХС-хемокінів з високою спорідненістю (наприклад, зі -11 -9 зв'язувальною спорідненістю (КD) в інтервалі від приблизно 5 × 10 Μ до приблизно 1 × 10 М). У значенні, вживаному у цьому описі, термін "пацієнт" означає ссавця, переважно людину, із захворюванням, розладом або станом, для яких корисним було б зниження рівня людських + + ELR СХС-хемокінів або зменшення біологічної активності, індукованої людськими ELR СХСхемокінами. У значенні, вживаному у цьому описі, термін "лікування" або "лікувати" означає всі процеси, у разі яких може відбуватись уповільнення, регулювання або зупинення розвитку захворювань, що обговорюються у цьому описі, але не обов'язково означає повне усунення всіх симптомів розладу. Лікування включає введення антитіла за цим винаходом для лікування захворювання або стану у пацієнта, зокрема, у людини. + Антитіла за цим винаходом зв'язують підгрупу людських ELR CXC- хемокинів з високою + спорідненістю. Наприклад, згадані антитіла зв'язують всі сім людських ELR СХС-хемокінів зі -11 -9 зв'язувальною спорідненістю (КD) в діапазоні від приблизно 5 × 10 Μ до приблизно 1 × 10 М, -10 -10 наприклад, від приблизно 1,0 × 10 Μ до приблизно 8,6 × 10 М, як визначено із застосуванням поверхневого плазмонного резонансу, при експресії у вигляді непроцесованого антитіла IgG4. Крім того, антитіла за цим винаходом характеризуються тим, що в той час як вони специфічно + зв'язують підгрупу людських ELR СХС-хемокінів, з іншими СХС-хемокінами, наприклад, з фактором стромальних клітин 1-альфа (SDF-1, також відомий як CXCL12), вони не зв'язуються специфічно. У одному з варіантів здійснення цього винаходу антитіла за цим винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга, де варіабельна ділянка важкого ланцюга містить ділянки CDR з такими амінокислотними послідовностями: HCDR1 (послідовність SEQ ID NO: 10), HCDR2 (послідовність SEQ ID NO: 11) і HCDR3 (послідовність SEQ ID NO: 12); і де варіабельна ділянка легкого ланцюга містить ділянки CDR з такими амінокислотними послідовностями: LCDR1 (послідовність SEQ ID NO: 7), LCDR2 (послідовність SEQ ID NO: 8) і LCDR3 (послідовність SEQ ID NO: 9). У іншому варіанті здійснення цього винаходу антитіла за цим винаходом можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга, де варіабельна ділянка важкого ланцюга містить ділянки CDR з такими амінокислотними послідовностями: HCDR1 (послідовність SEQ ID NO: 10), HCDR2 (послідовність SEQ ID NO: 11) і HCDR3 (послідовність SEQ ID NO: 19); і де варіабельна ділянка легкого ланцюга містить ділянки CDR з наступними амінокислотними послідовностями: LCDR1 (послідовність SEQ ID NO: 7), LCDR2 (послідовність SEQ ID NO: 8) і LCDR3 (послідовність SEQ ID NO: 9). У ще одному варіанті здійснення цього винаходу антитіла за цим винаходом можуть містити варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2 або послідовність SEQ ID NO: 14, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4 або послідовність SEQID NO:16. 3 UA 116008 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У ще одному варіанті здійснення цього винаходу антитіла за цим винаходом можуть містити важкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1 або послідовність SEQ ID NO: 13, і легкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 3 або послідовність SEQ ID NO:15. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла складаються з двох ідентичних легких ланцюгів і двох ідентичних важких ланцюгів. За варіантом, якому віддається перевага, легкий ланцюг з амінокислотною послідовністю, представленою послідовністю SEQ ID NO: 3, кодується нуклеїновою кислотою, що містить полінуклеотидну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 6. За варіантом, якому віддається перевага, важкий ланцюг з амінокислотною послідовністю, представленою послідовністю SEQ ID NO: 1, кодується нуклеїновою кислотою, що містить полінуклеотидну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 5. За варіантом, якому віддається перевага, амінокислотна послідовність легкого ланцюгу, представлена послідовністю SEQ ID NO: 15, кодується нуклеїновою кислотою, що містить полінуклеотидну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 18. За варіантом, якому віддається перевага, амінокислотна послідовність важкого ланцюгу, представлена послідовністю SEQ ID NO: 13, кодується нуклеїновою кислотою, що містить полінуклеотидну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 17. Варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається найбільша перевага, є антитіло, що містить два ідентичні важкі ланцюги, що мають амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, і два ідентичні легкі ланцюги, що мають амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 3. Антитіла за цим винаходом можуть бути включені в фармацевтичні композиції, придатні для введення пацієнту. Зазвичай фармацевтична композиція містить антитіло за цим винаходом і фармацевтично прийнятний носій. У значенні, вживаному у цьому описі, термін "фармацевтично прийнятний носій" охоплює будь-які і всі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні та протигрибкові засоби, ізотонічні і затримуючі всмоктування засоби і т.п., які є фізіологічно сумісними. Фармацевтично прийнятні носії можуть крім того містити незначні кількості допоміжних речовин, що збільшує термін зберігання або ефективність антитіла. Композиції за цим винаходом можуть бути виготовлені у вигляді різноманітних форм. Форма, якій віддається перевага, залежить від запланованого способу введення і терапевтичного застосування. Типові композиції, яким віддається перевага, мають форму ін'єкційних або інфузійних розчинів, таких як композиції, подібні до тих, що використовують для пасивної імунізації людей. Способом введення, якому віддається перевага, є парентеральний (наприклад, внутрішньовенний, підшкірний, внутрішньочеревинний або внутрішньом'язовий). У одному з варіантів здійснення цього винаходу антитіло вводять шляхом внутрішньочеревинної або підшкірної ін'єкції. Однак, як буде зрозуміло фахівцю в цій галузі, шлях та/або спосіб введення буде змінюватися в залежності від бажаних результатів. До складу фармацевтичних композицій можуть також включатись додаткові активні сполуки. У деяких варіантах здійснення цього винаходу антитіло за цим винаходом включається до складу композиції разом з та/або вводиться разом з одним або більше додатковим(-ими) терапевтичним(-ими) засобом(-ами), який(-і) є корисним(-ими) для лікування розладів, в яких + шкідливою є активність ELR СХС-хемокінів. Наприклад, антитіло за цим винаходом може бути введене до складу композиції разом з та/або вводиться разом з одним або більше додатковими хіміотерапевтичними агентами (наприклад, сунітинібом (sunitinib) або цисплатином (cisplatin)). Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть включати "терапевтично ефективну кількість" антитіла за цим винаходом. Термін "терапевтично ефективна кількість" означає кількість, ефективну, в дозах і протягом необхідного періоду часу, для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість антитіла може змінюватись відповідно до певних факторів, таких як стан хвороби, вік, стать і маса індивідуума, і здатності антитіла викликати бажану реакцію у індивідуума. Терапевтично ефективною кількістю також є кількість, у разі якої будь-які токсичні або шкідливі впливи антитіла переважуються терапевтично корисними впливами. Схеми введення лікарського засобу можуть бути пристосовані для забезпечення оптимальної бажаної реакції (наприклад, терапевтичної реакції). Наприклад, може вводитись одна ударна доза, протягом певного періоду часу можуть бути введені декілька розділених доз або доза може бути пропорційно зменшена або збільшена, як показано вимогами терапевтичної ситуації. Величина дози може змінюватись у залежності від типу і тяжкості стану, що підлягає полегшенню. Крім того, слід розуміти, що для будь-якого конкретного суб'єкта конкретні режими 4 UA 116008 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дозування мають бути згодом скориговані відповідно до потреби пацієнта і професійної підходу особи, що вводить згадані композиції або наглядає за введенням згаданих композицій. + Специфічне зв'язування і нейтралізація антитілом за цим винаходом людських ELR СХСхемокінів дозволяє використовувати вказане антитіло як терапевтичний засіб для захворювань і + розладів, на які сприятливо впливає пригнічування біологічної активності людських ELR СХС+ хемокінів. З урахуванням їх здатності зв'язувати і нейтралізовувати всі сім людських ELR СХСхемокінів, антитіла за цим винаходом мають переваги перед монотерапією, спрямованою на + один з людських ELR СХС-хемокінів, і комбінованою терапією, спрямованою на декілька + людських ELR СХС-хемокінів. В одному з варіантів здійснення цим винаходом запропонований спосіб лікування неспецифічного виразкового коліту або раку, наприклад, раку нирки або раку яєчників. В іншому варіанті здійснення цим винаходом запропоноване антитіло для застосування при лікуванні неспецифічного виразкового коліту або раку, наприклад, раку нирки або раку яєчників. Далі цей винахід пояснений за допомогою наведених нижче необмежувальних прикладів. ПРИКЛАДИ Експресія і продукування антитіл Антитіла за цим винаходом можуть бути експресовані і очищені як показано далі. Вектор експресії, що містить послідовність ДНК SEQ ID NO: 5 (що кодує поліпептид важкого ланцюгу з послідовністю SEQ ID NO: 1) і послідовність SEQ ID NO: 6 (що кодує поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 3), використовують для трансфекції клітин NS0. Антитіло, яке одержують з цього вектора експресії, являє собою "Антитіло 1". Крім того, вектор експресії, що містить послідовність ДНК SEQ ID NO: 17 (що кодує поліпептид важкого ланцюгу з послідовністю SEQ ID NO: 13) і послідовність SEQ ID NO: 18 (що кодує поліпептид легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 15), використовують для трансфекції клітин NS0. Антитіло, яке одержують з цього вектора експресії, являє собою "Антитіло 2". Для будь-якого з Антитіла 1 або Антитіла 2 трансфековані пули висівають з низькою густиною для забезпечення можливості близького до клонального росту стабільно експресуючих клітин. Еталонні лунки піддають скринінгу на експресію антитіл, і потім масштабують у безсироваткових суспензійних культурах, які будуть використовуватися для продукування. Просвітлене середовище, до якого було секретоване антитіло, завантажують на колонку з протеїном А чи протеїном G, яка була урівноважена сумісним буфером, наприклад, забуференим фосфатом фізіологічним розчином (pH 7,4). Колонку промивають для видалення неспецифічних зв'язувальних компонентів. Зв'язане антитіло елююють градієнтом pH (наприклад, від 0,1 Μ розчину натрій-фосфатного буферу (pH 6,8) до 0,1 Μ розчину натрійцитратного буферу (pH 2,5)). Фракції антитіла виявляють із застосуванням SDS-PAGE (електрофорез в поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфата натрію), після чого об'єднують. Подальше очищення є необов'язковим, і залежить від запланованого використання. Антитіло може бути сконцентроване і/або відфільтроване за стерильних умов із застосуванням звичайних методів. Розчинний агрегат і мультимери можуть бути ефективно видалені із застосуванням звичайних методів, в тому числі шляхом гель-хроматографії за розміром молекул, гідрофобної хроматографії, іонообмінної хроматографії або хроматографії на гідроксилапатитній адсорбційній колонці. Чистота антитіла після цих хроматографічних стадій може бути більшою за 99 %. Продукт може бути негайно заморожений при температурі -70 °C або ліофілізований. + Зв'язувальна спорідненість до людських ELR СХС-хемокінів Для дослідження на основі поверхневого плазмонного резонансу використовують прилад Віасоrе 2000 і програмне забезпечення Віасоrе 2000 Evaluation Software, версія 4.1. Чіп СМ5 готують за методом зв'язування аміногруп з використанням EDC/NHS (N-етил-N(диметиламінопропіл)карбодіімід/N-гідроксисукцинімід), запропонованим виробником. Стисло, поверхні всіх чотирьох проточних кювет активують шляхом впорскування суміші (1:1) EDC/NHS протягом 7 хв при швидкості 10 мкл/хв. Білок А розбавляють до 100 мкг/мл в 10 мМ розчині ацетатного буферу, рН4,5, та іммобілізують до досягнення приблизно 10000 RU (резонансних одиниць) на всіх 4 проточних кюветах шляхом впорскування протягом 7 хв при швидкості потоку 10 мкл/хв. Ділянки, які не прореагували, блокують шляхом впорскування етаноламіну протягом 7 хв при швидкості потоку 10 мкл/хв. Для видалення будь-якого нековалентно зв'язаного білка здійснюють два впорскування гліцину (pH 1,5) тривалістю по 30 с при швидкості потоку 10 + мкл/хв. Буфером для електрофореза є HBS-EP . Антитіло 1 або Антитіло 2 розбавляють до 2 мкг/мл в буфері для електрофореза, і на проточній кюветі (Fc) іммобілізують приблизно 400-600 RU. Ліганди розбавляють з 100 мкг/мл 5 UA 116008 C2 5 10 до 50 нМ в буфері для електрофореза з подальшим подвійним послідовним розведенням в буфері для електрофореза до 3,125 нМ. Ліганд в кожній концентрації двічі впорскують зі швидкістю 100 мкл/хв протягом 150 с перед фазою дисоціації. Тривалість фази дисоціації дорівнює 1800 с для всіх лігандів. Регенерацію здійснюють шляхом впорскування в усі проточні кювети 10 мМ розчину гліцину (pH 1,5) протягом 60 с при швидкості 50 мкл/хв. Дані, з яких видалений еталон, збирають як Fc2-Fc1, Fc3-Fc1 і Fc4-Fc1. Вимірювання здійснюють при температурі 25 °C. Швидкість асоціації (kon) і швидкість дисоціації (koff) для кожного ліганду оцінюють із застосуванням моделі зв'язування "зв'язування 1:1 (масоперенос)". Спорідненість (КD) обчислюють за кінетикою зв'язування за співвідношенням: КD=koff/kon. + Людські ELR СХС-хемокіни спричинюють залежну від концентрації реакцію зв'язування з Антитілом 1 і Антитілом 2. Таблиця 1 і Таблиця 2 підсумовують значення kon, koff і kD для Антитіла 1 і Антитіла 2. Ці результати показують, що Антитіло 1 і Антитіло 2 зв'язують всі сім + людських ELR СХС-хемокінів з високою спорідненістю. 15 20 25 30 35 Оцінка фізичної стабільності Агрегація і самоасоціація білка є небажаною властивістю антитіла, оскільки це потенційно може посилити небажані впливи, наприклад, ініціювання імунної реакції. Тому дуже бажаним є утримування антитіла в мономерному стані. Відсоток високомолекулярного (% HMW) агрегату є покажчиком агрегації і самоасоціації білків. Більш високий відсоток високомолекулярного агрегату вказує на посилену агрегацію/самоасоціацію білка і підвищену фізичну нестабільність. Фізична стабільність Антитіла 1 і Антитіла 2 визначається так, як наведено нижче. Антитіло піддають діалізу протягом ночі при температурі 4 °C в 10 мМ розчині цитрату, pH 6, ±150 мМ розчин NaCl. Наступного ранку зразки концентрують до 50 мг/мл, фільтрують через 0,2 мкм фільтри, після чого додають Tween-80 до кінцевої 0,02 % концентрації. Кожен зразок інкубують при температурі 25 °C протягом визначеного періоду часу. Утворення розчинного агрегату відслідковують із застосуванням аналітичного гель-хроматографування за розміром молекул (SEC) з використанням 5 мкм колонки TSK3000SWXL з розмірами 30 см х 0,78 см. Рухомою фазою є 50 мМ розчин фосфату натрію, рН7, 175 мМ розчин NaCl, при швидкості потоку 0,5 мл/хв. Зразки вводять у вигляді 1 мкл впорскувань, і контролюють при 280 нм для визначення збільшення відсотку високомолекулярного агрегата (Таблиця 3). 6 UA 116008 C2 5 Композиції з концентрацією антитіла 50 мг/мл інкубують протягом 1 тижня і 4 тижнів при температурі 25 °C для оцінки довгострокової стабільності в умовах стресу. Дельту % HMW агрегату визначають шляхом віднімання % HMW агрегату в момент часу нуль (в Таблиці 3 позначений як "Вихідний") від % HMW в момент часу 1 тиждень або момент часу 4 тижні. Після 1 тижня і 4 тижнів Антитіло 1 і Антитіло 2 демонструють значення дельта % HMW нижче 1 %, що свідчить про хорошу фізичну стабільність. 10 15 20 25 30 Картування епітопу для Антитіла 1 Для визначення характеристик епітопу для Антитіла 1 застосовують числені методи, у тому + числі вестерн-блотинг, спільну кристалізацію антитіла з декількома ELR СХС-хемокінами і мутаційний аналіз зв'язування і нейтралізації. Вестерн-блотинг Для визначення того, чи є Антитіло 1 здатним зв'язувати лінійний або конформаційний епітоп, вестерн-блотинг виконують із застосуванням відновлювальних і невідновлювальних ® умов. Електрофорез білків здійснюють з використанням готових NuPAGE 4-12 % Bis-Tris гелів. У обидві камери мінікювет, як у внутрішню (200 мл), так і у зовнішню (щонайменше 600 мл), ® ® додають- буфер для електрофореза NuPAGE MES SDS. В буфері для зразків NuPAGE LDS 4Х виготовляють послідовно розведені розчини людського CXCL8 (400 нг, 100 нг або 25 нг на ® смугу) з або без відновника зразків NuPAGE 10X. Зразки прогрівають при температурі 95 °C протягом 2 хв. Об'єми навантаження становлять 10 мкл на смугу для зразків, і 5 мкл на смугу для попередньо забарвленого стандартного маркеру SeeBlue Plus2. Процедуру розподілу на гелях здійснюють при 200 В протягом 35 хв при кімнатній температурі. ® Білки переносять на PVDF із застосуванням системи електроблотингу білків iBlot Dry ® Blotting System з нітроцелюлозною мембраною iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose, Mini. Вказану мембрану блокують у блокувальному розчині (3 % знежиреного молока в забуференому фосфатом фізіологічному розчині) протягом 1 год. при кімнатній температурі. До вказаного блокувального розчину додають Антитіло 1 до кінцевої концентрації 1 мкг/мл, після чого 7 UA 116008 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інкубують протягом 2 год. при кімнатній температурі. Після первинної інкубації суміш антитіло/блокувальний розчин видаляють, і мембрану промивають 3 рази по 15 хв в промивному буфері (забуферений фосфатом фізіологічний розчин + 0,05 % Tween 20). Потім мембрану інкубують кон'югованим з пероксидазою хрону вторинним ослячим специфічним IgG проти людського Fc антитілом (0,1 мкг/мл в блокувальному розчині) протягом 1 год. при кімнатній температурі. Після видалення вторинного антитіла, мембрану промивають 4 рази протягом 10 хв промивним буфером. Потім мембрану інкубують зі стабільним робочим розчином пероксиду, і розчином люмінолу/енхансера (хемілюмінесцентний субстрат Super Signal West Pico) протягом 5 хв. Мембрану розміщають в пластиковому захисному контейнері в касеті для рентгенівської плівки з плівкою CL-X Posure™ на 30 с Плівку проявляють із застосуванням системи Konica SRX-101. За невідновлювальних умов, при концентрації CXCL8 400 нг, дві зони з'являються при приблизно 17 кДа і приблизно 10 кДа. При концентрації CXCL8 100 нг, одна зона з'являється при приблизно 10 кДа. При концентрації CXCL8 25 нг, зони не з'являються. За відновлювальних умов, зони не з'являються при будь-якій з досліджуваних концентрацій. Результати показують, що Антитіло 1 здатне зв'язувати невідновлений денатурований людський CXCL8, але нездатне зв'язувати відновлений денатурований людський CXCL8. Отже два дисульфідні зв'язки CXCL8 необхідні для утримування епітопу антитіла. Ці результати показують конформаційний епітоп для Антитіла 1. Аналіз кристалічної структури Кристалічні структури комплексів Fab-фрагмент/антиген для людського CXCL8 і CXCL2, CXCL3 і CXCL7 макак-крабоїдів встановлюють для визначення повної поверхні зв'язування Антитіла 1. Скорочений людський CXCL8 1-66 дикого типу, точкові мутанти людського CXCL8 і CXCL7 макак-крабоїдів експресують в Е.соlі з N-кінцевими мітками His-SUMO. Ці білки піддають рефолдингу; мітки відщеплюють; і білки очищають стандартними методами очищення. CXCL2 і CXCL3 макак-крабоїдів експресують в клітинах НЕК293 EBNA, і очищають стандартними методами очищення. Утворення дисульфідних зв'язків підтверджується триптичним гідролізатом і мас-спектральним аналізом за методом "відбитків пальців", і активність підтверджується аналізом хемотаксису нейтрофілів. Fab-фрагмент Антитіла 1 експресують в клітинах НЕК293 EBNA, і очищають стандартними методами очищення. Комплекси Fabфрагмент/антиген створюють шляхом додавання невеликого молярного надлишку антигену до Fab-фрагмента з подальшим очищенням із застосуванням гель-хроматографії за розміром молекул для видалення надлишку вільного антигену. Комплекси кристалізують, і кристалічні структури визначають шляхом молекулярного заміщення з використанням Buster 2.9.5 (компанія Global Phasing Ltd.). + Ці кристалічні структури підтверджують, що епітоп для Антитіла 1 містить N-кінець ELR СХС-хемокінів, але вони також показують контакти між Fab-фрагментом і петлею 1-2 та + ланцюгами 2 і 3 ELR СХС-хемокінів. Згадані кристалічні структури також показують, що + згадане антитіло специфічно розпізнає складку ELR СХС-хемокінів, оскільки кристалічні структури є такими, що можуть бути суміщені. Зареєстровані також численні водневі зв'язки і Ван-дер-Ваальсові взаємодії. Зокрема, збережений бічний ланцюг R6 мотиву ELR розташований у глибокій зв'язувальній "кишені", утвореній важким ланцюгом Fab на залишках W33, Υ102 та Υ110 і легким ланцюгом Fab на залишку W94. Скорочений людський хемокін CXCL8 також сполучається водневими зв'язками як з важким ланцюгом Fab на залишку Е99, так і з легким ланцюгом Fab на карбонілі скелета N91. Інші водневі зв'язки зареєстровані між карбонілом скелета L5 скороченого людського хемокіну CXCL8 дикого типу і амідом скелета W94 легкого ланцюгу Fab; карбонілом скелета 110 скороченого людського хемокіну CXCL8 дикого типу і бічним ланцюгом S52 важкого ланцюгу Fab; бічним ланцюгом К11 скороченого людського хемокіну CXCL8 дикого типу і бічними ланцюгами Т30 та S31 важкого ланцюгу Fab; бічним ланцюгом Н33 скороченого людського хемокіну CXCL8 дикого типу і карбонілом скелета W94 легкого ланцюгу Fab; амідом скелета А35 і бічним ланцюгом N59 важкого ланцюгу Fab; і амідом скелета С50 скороченого людського хемокіну CXCL8 дикого типу і карбонілом скелета Υ104 важкого ланцюгу Fab. Крім того, N-кінцеві залишки з 5 по 13 скороченого людського хемокіну CXCL8 дикого типу утворюють численні контакти з Fab-фрагментом при знаходженні N-кінця у заглибленні між CDR2 і CDR3 важкого ланцюга Fab. На додаток до цього, петля CDR3 важкого ланцюга Fab відходить вбік від цього заглиблення і взаємодіє з He-N-кінцевим залишком 140 на ланцюзі 2 і залишками Glu48, Leu49 і Cys50 на ланцюзі 3 скороченого людського хемокіну CXCL8 дикого типу. Нарешті, залишки 33-36 петлі 1-2 скороченого людського хемокіну CXCL8 дикого типу пакуються проти CDR2 важкого ланцюгу Fab-фрагменту. Мутаційний аналіз 8 UA 116008 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 В кристалічній структурі спостерігаються декілька ключових контактів між Fab-фрагментом Антитіла 1 і людським CXCL8 дикого типу, які досліджують шляхом вивчення кінетики зв'язування і нейтралізації точкових мутантів людського CXCL8 із застосуванням флуоресцентного візуалізаційного планшет-рідера (FLIPR) U937-huCXCR2. Для вивчення цих ключових контактів одержали декілька точкових мутантів (R6A, І10А, А35Р, І40А і L49A) на основі послідовності людського CXCL8 (послідовність SEQ ID NO: 27). Точкові мутанти людського CXCL8 дикого типу, R6A, І10А, А35Р, І40А та L49A, експресують, піддають рефолдингу, і очищають за стандартними методами. Утворення дисульфідних зв'язків підтверджується триптичним гідролізатом і мас-спектральним аналізом за методом "відбитків пальців", та активність підтверджується дослідженням хемотаксису нейтрофілів. Кінетику зв'язування досліджують на приладі Віасоrе 2000 з програмним забезпеченням Віасоrе 2000 Evaluation Software, версія 4.1, як описано вище. Людський CXCL8 дикого типу і людський мутований CXCL8 досліджують щодо біологічної активності і нейтралізації Антитілом 1 із застосуванням дослідження на U937-huCXCR2. U937-huCXCR2 являє собою клітинну лінію моноцитів, трансдукованих ретровірусом для експресії людського CXCR2. Мутанти CXCL8 послідовно розбавляють в буфері для дослідження, що містить 0,2 % BSA, в лунках 96-лункових поліпропіленових планшетів з v-подібним дном. Концентрації лігандів у 3 рази перевищують кінцеву концентрацію для дослідження (кінцеві концентрації для дослідження знаходяться в діапазоні від 300 нМ до 0,0051 нМ). Планшет з клітинами і планшет з лігандом завантажують в флуоресцентний візуалізаційний планшет-рідер (FLIPR-3, компанія Molecular Devices), запрограмований на перенесення 50 мкл ліганда в лунки планшета з клітинами. Флуоресценція реєструється з інтервалом в 1 с протягом 90 с. Зміну флуоресценції [дельта відносних одиниць флуоресценції (DRFU), Max RFU-Min RFU] обчислюють по зображенням від 10 до 90. Накреслюють криву залежності "DRFU-log (концентрації ліганду)", і значення ЕС50 обчислюють шляхом нелінійної регресії з використанням програмного продукту Graph Pad Prism. Дослідження виконують тричі на трьох аналітичних планшетах. Антитіло 1 послідовно розбавляють в буфері для дослідження, що містить 0,2 % BSA. Концентрації антитіла у 3 рази перевищують кінцеву концентрацію для дослідження (кінцеві концентрації знаходяться в діапазоні від 10 мкг/мл до 0,0195 мкг/мл). Маточні розчини людського CXCL8 дикого типу і мутантів CXCL8 одержують в буфері для дослідження + 0,2 % BSA при 240 нМ (30х кінцевих концентрацій для дослідження, де кінцева концентрація для дослідження дорівнює 8 нМ). 20 мкл ліганда змішують з 180 мкл Антитіла 1 в лунках 96лункових поліпропіленових планшетів з v-подібним дном. Ліганд і антитіло інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хв. Планшет з клітинами і планшет з лігандом-антитілом завантажують в флуоресцентний візуалізаційний планшет-рідер (FLIPR-3, компанія Molecular Devices), запрограмований на перенесення 50 мкл ліганда-антитіла в лунки планшета з клітинами. Флуоресценція реєструється з інтервалом в 1 с протягом 90 с. Зміну флуоресценції (DRPU) обчислюють по зображенням від 10 до 90. Накреслюють криву залежності "DRFU-log (концентрації антитіла)", і значення ІС50 обчислюють шляхом нелінійної регресії з використанням програмного продукту Graph Pad Prism. Дослідження виконують тричі на трьох аналітичних планшетах. Результати дослідження кінетики зв'язування, біологічної активності і нейтралізації підсумовані в Таблиці 4. Вимірювання здійснюють при температурі 25 °C. Швидкість асоціації (kon) і швидкість дисоціації (koff) для кожного ліганду оцінюють із застосуванням моделі зв'язування "зв'язування 1:1 (масоперенос)". Спорідненість (КD) обчислюють за кінетикою зв'язування за співвідношенням: КD=koff/kon. Декілька мутацій втратили активність до рецептора (ЕС 50), і тому не могли випробовуватись на нейтралізацію. Слід зазначити, що мутація А35Р повністю усунула нейтралізувальну активність, незважаючи на незменшену активність до рецептора. Ці результати висувають на перший план ключові контакти (R6,I10, A35,140 і L49) в межах зв'язувальної поверхні антигену CXCL8, які є важливими для зв'язування антитіла. 9 UA 116008 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Загалом, аналіз картування епітопів для Антитіла 1 показує, що поверхня зв'язування + антигену містить N-кінець ELR СХС-хемокінів (амінокислоти 5-13), петлю 1-2 (амінокислоти 33-36), і ланцюги 2 і 3 (амінокислоти 40, 48-50). Ключові контакти в межах цієї поверхні, важливі для зв'язування антитіла, охоплюють амінокислоти R6, I10, A35, 140 та L49 CXCL8 (послідовність SEQ ID NO: 27). Дослідження нейтралізації + In vitro нейтралізація людських ELR СХС-хемокінів з використанням людських клітин НМЕС, трансфекованих CXCR2 + Оскільки всі ELR СХС-хемокіни можуть зв'язувати рецептор CXCR2, для in vitro досліджень були відібрані клітини, які експресують CXCR2. HMEC-huCXCR2 являє собою імморталізовану лінію людських ендотеліальних клітин, трансдукованих ретровірусом для експресії людського рецептора CXCR2. Клітини НМЕС, які експресують людський CXCR2, здатні індукувати 2+ + внутрішньоклітинний приплив Са у відповідь на ELR СХС-хемокіни людини, макак-крабоїдів, 2+ пацюків і мишей. Внутрішньоклітинний приплив Са може бути виявлений із застосуванням флуоресцентного візуалізаційного планшет-рідера (FLIPR). Крім того нейтралізація хемокінів 2+ має також нейтралізувати внутрішньоклітинний приплив Са , індукований цими хемокінами. HMEC-huCXCR2 утримують в середовищі MCDB 31, доповненому 10 % зародкової бичачої сироватки, 2х GlutaMAX, їх замінних амінокислот, 1 мкг/мл гідрокортизону, 10 нг/мл фактора росту епідермісу людини і 0,4 мкг/мл пуроміцина при температурі 37 °C в 5 % СО2. Культури утримують на рівні субконфлюентної густини (50-80 % злиття). Клітини збирають із 5 застосуванням TrypLE Express, густину клітин доводять до 3  10 клітин/мл в культуральному середовищі повного складу, і 100 мкл клітинної суспензії висівають в лунки чорних аналітичних планшетів з прозорим дном. Планшет з клітинами інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хв, щоб дозволити клітинам осісти на дно лунок, перед тим, як планшети інкубують протягом ночі при температурі 37 °C в 5 % СО2. Для кожного аналітичного планшета, вміст одного флакону засобу Fluo-4NW суспендують у 10 мл буфера для дослідження та 100 мкл пробенециду для одержання їх реагенту Fluo-4NW. Після інкубації культуральне середовище видаляють, і в кожну лунку аналітичного планшета додають 100 мкл розчину Ix Fluo-4NW. Планшети інкубують протягом 30 хв при температурі 37 °C, після чого інкубують ще 30 хв при кімнатній температурі, захищеними від світла. Антитіло 1 послідовно розбавляють в буфері для дослідження, що містить 0,2 % BSA. Концентрації антитіла у 3 рази перевищують кінцеву концентрацію для дослідження (кінцеві концентрації знаходяться в діапазоні від 10 мкг/мл до 0,195 мкг/мл). Маточні розчини лігандів одержують в буфері для дослідження + 0,2 % BSA при 300 нМ (30х кінцевих концентрацій для дослідження, де кінцева концентрація для дослідження дорівнює 10 нМ). 20 мкл ліганда змішують з 180 мкл антитіла в лунках 96-лункових поліпропіленових планшетів з v-подібним дном. Ліганд і антитіло інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хв. Планшет з клітинами і планшет з лігандом-антитілом завантажують в флуоресцентний візуалізаційний планшет-рідер (FLIPR-3, компанія Molecular Devices), запрограмований на перенесення 50мкл ліганда-антитіла в лунки планшета з клітинами. Флуоресценція реєструється кожної секунди протягом 90 с Зміну флуоресценції (DRFU) обчислюють по зображенням від 10 до 90. Накреслюють криву залежності "DRFU-log (концентрації антитіла)", і значення IC50 обчислюють шляхом нелінійної 10 UA 116008 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 регресії з використанням програмного продукту Graph Pad Prism. Дослідження виконують тричі на трьох аналітичних планшетах. Дані виражають як середнє повторів. Результати підсумовані в Таблиці 5. Ці результати показують, що Антитіло 1 здатне + нейтралізувати всі сім людських ELR СХС-хемокінів. Значення ІС50 виражені в мкг/мл антитіла (середні квадратичні відхилення наведені в дужках). Були використані як 72-амінокислотна, так і 77-амінокислотна форми CXCL8. Дані являють собою середнє 2-5 повторів. In vitro нейтралізація людського CXCL8 або CXCL1-індукованого хемотаксису з використанням первинних людських нейтрофілів Хемотаксичний аналіз з використанням нейтрофілів людини був обраний для визначення нейтралізувальної активності Антитіла 1 в клітинах, природно експресуючих як CXCR1, так і CXCR2. Периферичну кров від здорових волонтерів відбирають в дві 10 мл пробірки з гепарином натрію. Для ізоляції нейтрофілів, 5 мл крові нашаровують на 5 мл Polymorphprep в чотирьох 15 мл пробірках. Пробірки центрифугують протягом 30 хв при 470 g і 18 °C. Плазму і верхній шар клітин (мононуклеари) видаляють і викидають. Другий шар (нейтрофіли) об'єднують з 4 пробірок, і додають такий самий об'єм PBS. Пробірку центрифугують протягом 10 хв при 400 g і 18 °C. Осад промивають 12 мл PBS, центрифугують так само як перед цим, і осад ресуспендують в 11 мл суміші HBSS (збалансований сольовий розчин Xeнкca)/BSA 6 (бичачий сироватковий альбумін) (7,5 мг/мл BSA, HBSS). 60 × 10 клітин суспендують у 12 мл HBSS/BSA та 5 мкМ CMFDA (5-хлорметилфлуоресцеїн діацетат), і інкубують протягом 30 хв при 37 °C. Після інкубації пробірку центрифугують для осадження клітин, промивають один раз 12 6 мл HBSS/BSA, і потім клітини ресуспендують в 12 мл HBSS/BSA (5 × 10 клітин/мл). Антитіло 1 і ізотиповий контроль (людське IgG4-aнтитіло) розбавляють до 1495 нМ із застосуванням HBSS/BSA (Розбавлений розчині), після чого послідовно розводять 1:5 із застосуванням HBSS/BSA. GXCL8 розбавляють до 20 нМ із застосуванням HBSS/BSA. CXCL1 розбавляють до 10,1 нМ із застосуванням HBSS/BSA. 70 мкл Антитіла 1 або HBSS/BSA змішують з 70 мкл розчину CXCL8 або CXCL1, і інкубують при кімнатній температурі протягом ~30хв. 30 мкл суміші розподіляють в лунки нижньої камери планшету ChemoTx з потроєнням. Лунки, що містять тільки HBSS/BSA (без хемокіну або антитіла) покажуть фоновий сигнал. Фільтр ChemoTx розміщують над нижньою камерою, і 50 мкл (250000 клітин) розподіляють по кожній лунці. Планшет ChemoTx інкубують протягом 3 год. при 37 °C, 5 % СО2. Після інкубації клітини змивають PBS з верхньої поверхні, і фільтр ChemoTx 3 видаляють. Флуоресценцію зчитують (лічильник Wallac Victor 1420) при 485/535 нм, використовуючи тільки нижній детектор. Середнє значення флуоресценції фонових лунок (тільки HBSS/BSA) віднімають від флуоресценції досліджуваних лунок, і із застосуванням Excel обчислюють середнє і середню квадратичну помилку. При концентрації CXCL8 5 нМ, ІС50 для Антитіла 1 (молекулярна маса 150000 кДа) становить 26,4 (±0,236) нМ. При концентрації CXCL8 10 нМ, ІС50 для Антитіла 1 становить 43,7 (±0,086) нМ. При концентрації CXCL1 5 нМ, ІС50 для Антитіла 1 становить 18,5 (±0,158) нМ. При концентрації CXCL1 20 нМ, IC50 для Антитіла 1 становить 40,3 (±0,112) нМ. При всіх перевірених концентраціях CXCL1 і CXCL8 ізотипове контрольне антитіло не впливає на хемотаксис. Ці дані показують, що Антитіло 1 може блокувати хемотаксичну активність людських CXCL8 або CXCL1 11 UA 116008 C2 5 10 15 20 25 30 дозозалежним чином, у той час як ізотипове контрольне антитіло впливу на хемотаксичну активність не чинить. In vivo DSS модель гострого коліту у мишей Декстран сульфат натрію (DSS) є найбільш широко застосовуваною моделлю неспецифічного виразкового коліту (UC). У цій моделі DSS є хімічним подразником, який додають до питної води, щоб спричинити гостре захворювання, яке нагадує UC. Гостра фаза DSS коліту характеризується рекрутингом нейтрофілів до слизової оболонки та підслизової + основи і підвищеною експресією ELR СХС-хемокінів. Разом з тим, хронічний вплив DSS викликає тяжке пошкодження травного каналу і значну втрату ваги, що є неприйнятним у моделі коліту. Для адаптування різкого характеру цієї моделі, Антитіло 1 було використане як запобіжний засіб для перевірки його здатності до пригнічування рекрутингу нейтрофілів і розвитку коліту. В цій моделі слід звернути увагу на значне зростання рівня мишачого білка CXCL5 (LIX) в тканині ободової кишки (Kwon 2005); однак, Антитіло 1 не нейтралізує цей мишачий хемокін. Одержують мишей лінії C57BL/6 віком 8-10 тижнів, масою 18-22 г. Кров відбирають шляхом серцевої пункції, і аналізують для встановлення базового рівня. Для спричинювання коліту миші одержують 2,5 % DSS (молекулярна маса=36000-50000) з питною водою протягом 5 діб (доби 15) з подальшими 6 добами без DSS у воді (які відповідають гострому запаленню). Контрольні здорові миші одержують лише воду (група "без DSS"). Мишам, які одержують DSS, на 0, 2, 4 і 8 добу шляхом підшкірної ін'єкції вводять контрольне людське IgG4-aнтитілo (25 мг/кг) або Антитіло 1 (25 мг/кг). Масу тіла реєструють щодня. Кількість мишей, використовуваних для кожної обробки, дорівнює 9 (за винятком 5 здорових мишей, що використовуються в групі здорових мишей "без DSS"). Дослідження виконують чотири рази. Як показано в Таблиці 6, DSS миші, які одержували контрольне людське IgG4-aнтитілo, різко худнуть між 5 добою і 8 добою. У DSS мишей, які одержували Антитіло 1 до спричинювання коліту та під час гострої фази захворювання, спостерігається менша втрата маси між 5 добою і 8 добою, аніж у DSS мишей, які одержували контрольне людське IgG4-aнтитілo (94,0 % початкової маси тіла для Антитіла 1 проти 85,3 % початкової маси тіла для контрольного IgG4 на 8 добу). Ці результати показують, що системне введення Антитіла 1 ефективно зменшує втрату маси у разі DSS-індукованого коліту, що підтверджує висновок про те, що Антитіло 1 + нейтралізує активність певних мишачих ELR СХС-хемокінів, і знижує рекрутинг нейтрофілів в ободову кишку. 35 40 45 In vivo нейтралізація в 786-О світлоклітинній нирково-клітинній ксенотрансплантатній моделі Клітини лінії 786-О нирково-клітинної карциноми (RCC) змішують 1:1 з матрігелем, і підшкірно імплантують в праву задню бічну частину "голих" мишей-самиць з розрахунку 3,0 × 6 10 клітин на ін'єкцію. Мишам з ксенотрансплантатом 786-О, об'єм пухлин у яких досягає 100 3 мм , перорально через шлунковий зонд двічі на добу вводять 10 мг/кг сунітинібу за безперервною схемою приймання лікарського засобу, доки у мишей не розпочинається прогресування росту пухлин, подібне до контрольних мишей (IgG4 і 10 % носія), навіть у разі обробки сунітинібом. Мишей з розвитком росту пухлин при лікуванні сунітинібом довільно розподіляють на 2 групи. Одна група одержує сунітиніб в дозі 10 мг/кг два рази на добу плюс контрольне IgG4-aнтитілo в дозі 20 мг/кг один раз на тиждень. Інша група одержує сунітиніб в дозі 10 мг/кг два рази на добу плюс Антитіло 1 в дозі 20 мг/кг один раз на тиждень. В Таблиці 7 12 UA 116008 C2 наведені середні об'єми пухлин (середня квадратична помилка в дужках). Додання Антитіла 1 до лікування сунітинібом значно знижує ріст пухлин з перебігом часу (р