Фрагмент днк, який має нуклеотидну послідовність, що кодує вегетативний інсектицидний білок, експресійна касета, векторна молекула, штам agrobacterium (варіанти), штам bacillus, вегетативний інсектицидний білок

1 Фрагмент ДНК, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую вегетативный инсектицидный белок или аналог, или активный фрагмент такого белка, характеризующийся тем, что он гомологичный молекуле ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO 1 ATCGATACAA TGTTGTTTTA CTTAGACCGG TAGTCTCTGT AATTTGTTTA ATGCTATATT 60 CTTTACTTTG АТАСЛТТТТЛ ATAGCCATTT CAACCTTATC AGTATGTTTt TGTGGTCT7C 120 .CTCCTTTTII TCCACGAGCT CTAGCTGCGT TTAATCCTGT TTTGGTACGT TCGCTAATAA 180 TATCTCTTTC TAATTCTGCA ATACTTGCCA TCATTCGAAA GAAGAATTTC CCCATAGCAT 2n Tyr 590 v * i Thr by» Tyr Slu Vil The Tyr S e r S*r Olu Leu Gly Pro Aan SJS GOO 60S Ser Asp Thr L*u Shi £10 Phe A S P Phe Т П Ї Lya 6Ї5 S*r Gly Leu Aan Trp (45 Ser A»p Lys l i e Tyr «IS туг S*r Ly» A»n Glu 630 Asp Ph* Ly» lie Asn 6S0 V«l Ly» Aap Gly Thr I I » Ly» 620 Gin S l y L*u Phe Tyr Aap 635 640 Ala H e Thr Туе А»р Gly 655 Lyi Glu Met Asn Vil ?he HU Xrs Tyr A*n bye, 660 665 11 Экспрессионная кассета, отличающаяся тем, что она включает фрагмент ДНК, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую вегетативный инсектицидный белок, или аналог или активный фрагмент такого вегетативного инсектицидного белка, причем указанный фрагмент гомологичный молекуле ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO 1, SEQ ID N0 9, SEQ ID N0 17 или SEQ ID N0 18, активно связанную с транскрипционными и трансляционными регуляторными сигналами для экспрессии указанных нуклеотидных последовательностей в организме-хозяине 12 Экспрессионная кассета по п 11, отличающаяся тем, что указанным организмом-хозяином является растение 13 Экспрессионная кассета по п 11, отличающаяся тем, что указанным организмом-хозяином является микроорганизм 14 Векторная молекула, отличающаяся тем, что содержит экспрессионную кассету нуклеотидной последовательности, кодирующей вегетативный инсектицидный белок, или аналог или активный фрагмент такого белка, причем указанная последовательность гомологична молекуле ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, 8 приведенную в SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 9, SEQ ID N0 17 или SEQ ID N0 18, активно связанную с транскрипционными и трансляционными регуляторными сигналами для экспрессии указанных нуклеотидных последовательностей в организмехозяине 15 Векторная молекула по п 14, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ДНК-последовательность, гомологичную последовательности в организме-хозяине, где и будет происходить интегрирование, и/или систему репликации, которая является функциональной в хозяине, где и будет происходить интегрирование и стабильное поддержание 16 Векторная молекула по одному из пп 14-15, отличающаяся тем, что содержит дополнительную экспрессионную кассету, включающую селектируемый маркерный ген, активно связанную с транскрипционными и трансляционными регуляторными сигналами для экспрессии указанного маркерного гена в организме-хозяине 17 Штамм Agrobactenum, характеризующийся тем, что включает экспрессионную кассету нуклеотидной последовательности, кодирующей вегетативный инсектицидный белок, или его аналог или активный фрагмент, причем указанная последовательность гомологична молекуле ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 9, SEQ ID N0 17 или SEQ ID N0 18, активно связанную с транскрипционными и трансляционными регуляторными сигналами для экспрессии указанных нуклеотидных последовательностей в организмехозяине 18 Штамм Agrobactenum, характеризующийся тем, что включает векторную молекулу с экспрессионнои кассетой нуклеотидной последовательности, кодирующей вегетативный инсектицидный белок, или его аналог или активный фрагмент, причем указанная последовательность гомологична молекуле ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID N0 1, SEQ ID N0 9, SEQ ID N0 17 или SEQ ID N0 18, активно связанную с транскрипционными и трансляционными регуляторными сигналами для экспрессии указанных нуклеотидных последовательностей в организме-хозяине 19 Штамм Bacillus, характеризующийся тем, что он трансформирован экспрессионнои кассетой по п 11 и продуцирует вегетативный инсектицидный белок или его аналоги и активные фрагменты 20 Штамм Bacillus по п 19, отличающийся тем, что он выбран из В megatenum, В cereus, В сегeus var mycoides, В thunngiensis, В hcheniformis, В subtihs, В pumilus, В firmus, В coagulans, В polymyxa, В macerans, В circulans, В stearothermophilus, В alvei, В laterosporus, В brevis, В pulvifaciens, В popilhae, В lentimorbus, В larvae, В sphaencus, В pasteuni, В apiarus, В fihcolomcus, В thiammolyticus, В alcalophilus, В cirroflagellosus, В chitmosporus, В lentus, В badius, В aneurmolyticus, В macroides, В freundenreichii, В pantothenticus, В epiphytus, В aminovorans, В globisporus, В msohtus, В psychrophilus, В psychrosaccharolyticus, В macquanensis 21 Вегетативный инсектицидный белок, характе 52579 24 Вегетативный инсектицидный белок по одному из пп 22-23, отличающийся тем, что указанный белок обладает способностью убивать насекомых, выбранных из отрядов Coleoptera или Lepidoptera 25 Вегетативный инсектицидный белок по п 24, отличающийся тем, что указанными Coleoptera является род Diabrotica 26 Вегетативный инсектицидный белок по п 25, отличающийся тем, что указанными Diabrotica являются Diabrotica virgifer virgifer или Diabrotica longicorms barben 27 Вегетативный инсектицидный белок по п 24, отличающийся тем, что указанными Lepidoptera является род Agrotis 28 Вегетативный инсектицидный белок по п 27, отличающийся тем, что указанным Agrotis является Agrotis ipsilon 29 Вегетативный инсектицидный белок по п 22, отличающийся тем, что он выделен в фазе вегетативного роста Bacillus cereus 30 Вегетативный инсектицидный белок по п 29, отличающийся тем, что указанным Bacillus cereus является Bacillus cereus, имеющий регистрационный номер NRRL В-21058 31 Вегетативный инсектицидный белок по п 22, отличающийся тем, что он выделен в фазе вегетативного роста Bacillus thunngiensis 32 Вегетативный инсектицидный белок по п 31, отличающийся тем, что указанным Bacillus thunngiensis является Bacillus thunngiensis, имеющий регистрационный номер NRRL B-21060 или Bacillus thunngiensis, имеющий регистрационный номер NRRL B-21225 33 Вегетативный инсектицидный белок по одному из пп 22-32, отличающийся тем, что указанный белок имеет молекулярный вес ЗОкДа или больше 34 Вегетативный инсектицидный белок по п 33, 10 отличающийся тем, что указанный белок имеет молекулярный вес от приблизительно 60 до приблизительно 100 кДа 35 Вегетативный инсектицидный белок по п 34, отличающийся тем, что указанный белок имеет молекулярный вес приблизительно 80 кДа 36 Вегетативный инсектицидный белок по п 35, отличающийся тем, что указанный белок имеет N-концевую последовательность NH2-Lys-Arg-Glu-lle-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-(X)Gly-Asp-Ser-lle-Pro1 10 ,где X=Asp или Asn (SEQ ID NO 8) 37 Вегетативный инсектицидный белок по п 22, отличающийся тем, что имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO 5 или SEQ ID NO 7 38 Вегетативный инсектицидный белок по п 21, отличающийся тем, что имеет аминокислотную последовательность, имеющую N-концевую аминокислотную последовательность Xaa-Glu-Pro-Phe-Val-Ser-Ala-Xaa-Xaa-Xaa-GlnХаа-Хаа-Хаа 1 5 10 (SEQIDNO10) 39 Пестицидная композиция, отличающаяся тем, что содержит вегетативный инсектицидный белок по п 21 40 Пестицидная композиция по п 39, отличающаяся тем, что указанный вегетативный инсектицидный белок выделен в фазе вегетативного роста штамма Bacillus по п 19 или 20 41 Способ обработки растений, предпочтительно кукурузы, отличающийся тем, что бактериальный штамм по одному из пп 17-20 применяют к указанным растениям 42 Способ получения вегетативного инсектицидного белка по п 21, который выделенный в фазе вегетативного роста видов Bacillus, или его аналогов и активных фрагментов, характеризующийся тем, что он предусматривает следующие стадии а) выращивание клеток Bacillus в культуральной среде, б) удаление клеток из супернатанта во время вегетативного роста, и в) выделение и очистку вегетативного инсектицидного белка или его аналогов или активных фрагментов от супернатанта 43 Способ получения трансгенного микроорганизма-хозяина, содержащего экспрессионную кассету нуклеотидной последовательности, кодирующей вегетативный инсектицидный белок, отличающийся тем, что указанный микроорганизм трансформируют при помощи экспрессионной кассеты фрагмента ДНК по п 1, активно связанной с транскрипционными и трансляционными регуляторными сигналами для экспрессии указанных нуклеотидных последовательностей в организме-хозяине, или с векторной молекулой, содержащей указанную экспрессионную кассету Настоящее изобретение является частично продолжающей заявкой заявки США № 08/037057, поданной 25 марта 1993г, описание которой включено в настоящую заявку в качестве ссылки Настоящее изобретение относится к способам и композициям, предназначенным для борьбы с ризующиися тем, что он кодируется молекулой ДНК, гомологичной нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 17 или SEQ ID NO 18 22 Вегетативный инсектицидный белок по п 21, отличающийся тем, что является частью мультимерного белка 23 Вегетативный инсектицидный белок по п 22, отличающийся тем, что он выделен в фазе вегетативного роста В megatenum, В cereus, В cereus var mycoides, В thunngiensis, В hcheniformis, В subtihs, В pumilus, В firmus, В coagulans, В polymyxa, В macerans, В circulans, В stearothermophilus, В alvei, В laterosporus, В brevis, В pulvifaciens, В popilhae, В lentimorbus, В larvae, В sphaencus, В pasteum, В apiarus, В fihcolomcus, В thiaminolyticus, В alcalophilus, В cirroflagellosus, В chitinosporus, В lentus, В badius, В aneurmolyticus, В macroides, В freundenreichu, В pantothenticus, В epiphytus, В ammovorans, В globisporus, В msohtus, В psychrophilus, В psychrosaccharolyticus или В macquanensis 52579 12 11 вредителями растений и другими вредителями циям и способам борьбы с вредителями растений и другими вредителями В частности, описаны Насекомые - вредители являются основным новые пестицидные белки, выделенные из Bacillus фактором потери урожая экономически важных на стадии вегетативного роста Описаны штаммы сельскохозяйственных культур во всем мире Для Bacillus, белки и гены, кодирующие эти белки борьбы и искоренения важных с сельскохозяйственной точки зрения вредителей используют шиСпособы и композиции по настоящему изорокий спектр химических пестицидов Однако субретению могут быть использованы в различных щественный интерес представляет разработка системах борьбы с вредителями растений и друэффективных альтернативных пестицидов гими вредителями Микробиологические пестициды играют сущеПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ственную роль в качестве альтернативы химичеПредложены композиции и способы борьбы с скому методу борьбы с вредителями Наиболее вредителями растений В частности, предложены широко применяемый микробиологический проновые пестицидные белки, производимые во вредукт основан на использовании бактерии Bacillus мя вегетативного роста штаммов Bacillus Эти thunngiensis (Bt) Bt является грам положительной белки пригодны в качестве пестицидных агентов спорообразующей бактерией рода Bacillus, обраНастоящее изобретение исходит из признания зующей во время споруляции инсектицидный критого факта, что пестицидные белки производятся сталлический белок (ИК-белок) во время вегетативного роста штаммов Bacillus В настоящем изобретении вегетативный рост опреИзвестно, что многочисленные разновидности деляется как период времени до начала споруляBt образуют более 25 различных, но родственных ции Для Bt этот вегетативный рост происходит ИК-белков ИК-белки, образованные Bt, токсичны перед образованием ИК-белков Гены, кодируюдля личинок определенных видов на секОмых яз щие такие белки, могут быть выделены, клонироотрядов Lepidoptera (чешуекрылых), Diptera (двуваны и трансформированы в различные средства крылых) и Coleoptera (жесткокрылых) Обычно, доставки с целью использования в программах при поедании ИК-белка чувствительным к нему регуляции численности вредителей насекомым, кристалл растворяется и превращается с помощью протеаз кишечника насекомого в В настоящем изобретении термин "вредители" токсичное производное Ни один из ИК-белков, включает в себя насекомых, грибы, бактерии, неактивных в отношении жуков, не показал сущестматоды, клещей, иксодовых клещей, паразитоввенной эффективности для рода Diabrotica, в чапростейших, паразитирующих на животных печестности, для Diabrotica virgifera virgifera, блошки ночных двуусток и т п , но не ограничивается ими длинноусой западной (БДЗ), или Diabrotica longiНасекомые-вредители включают насекомых corms barbed, блошки длинноусой северной представителей отрядов Coleoptera (жесткокрылый), Diptera (двукрылых), Hymenoptera (перепонBt во многом схожа с Bacillus cereus (Be) Осчатокрылых), Lepidoptera (чешуекрылых), Malloновным характерным отличием является отсутстphaga (пухоедов), Homoptera (равнокрылых), вие у Вс параспорального кристалла Вс является Hemiptera (полужесткокрылых), Orthoptera (пряшироко распространенной бактерией, обычно мокрылых), Thysanoptera (трипсов), Dermaptera присутствующей в почве и выделяемой из различ(уховерток), Isoptera (термитов), Anoplura (вшей), ных пищевых и лекарственных продуктов Этот Siphonaptera (блох), Tnchoptera (ручейников) и др организм принимает участие в порче пищи Хотя Bt очень полезна в борьбе с насекоВ таблицах 1-10 представлен список вредитемыми-вредителями, необходимо расширять колилей, связанных с основными сельскохозяйственчество потенциальных агентов, предназначенных ными растениями, и вредителей, имеющих медидля биологического метода борьбы цинское и ветеринарное, значение Указанные вредители включены в объем настоящего изобреКРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ тения Настоящее изобретение относится к композиТаблица 1 Lepidoptera (бабочки и моли) Ostrima nubilahs, мотылек кукурузный Agrotis ipsilon, совка-ипсилон Hehcoverpa zea, совка хлопковая Spodoptera frugiperda, совка травяная Diatraea grandiosella, огневка кукурузная Кукуруза юго-западная Elasmopalpus hgnoseljus, бабочка эласмопалытус Diatraea saccharahs, огневка сахарная Chilo partellus, огневка сорговая Spodoptera frugiperda, совка травяная Hehcoverpa zea, совка хлопковая Elasmopalpus hgnoseljus, бабочка эласмопальпус Feltia subterranea, совка Сорго зернистая Pseudaletia umpunctata, совка-походный червь Spodoptera frugiperda, совка травяная ElПшеница asmopalpus hgnosellus, бабочка эласмопальпус Agrotis orthogoma, совка прямоугольная Suleima hehanthana, листовертка почковая подсол неч ни ко вая Homoeosoma electellum, Подсолнечник мотылек подсолнечниковый Hehothis virescens, коробочный червь хлопчатника Hehcoverpa zea, совка хлопковая Хлопчатник Spodoptera exigua, совка -карадрина Pectmophora gossypiella, розовый коробочный червь хлопчатника 13 14 52579 Продлолжение таблицы 1 Lepidoptera (бабочки и моли) Рис Соя Ячмень Diatraea saccharahs, огневка сахарная Spodoptera frugiperda, совка травяная Hehcoverpa zea, совка хлопковая Pseudoplusia mdudens, пяденица соевая Anticarsia gemmatahs, бабочка-антикарзия Plathypena scabra, совка зеленая Ostnnia nubilahs, мотылек кукурузный Agrotis ipsilon, совка-ипсилон Spodoptera exigua, совка -карадрина Hehothis virescens, коробочный червь хлопчатника Hehcoverpa zea, совка хлопковая Ostnnia nubilahs, мотылек кукурузный Agrotis ipsilon, совка -ипсилон Таблица 2 Coleoptera (жуки) Diabrotica virgifera virgifera, блошка длинноусая западная Diabrotica longicorms barben, блошка длинноусая северная Diabrotica undecimpunctata howardi, блошка длинноусая южная Melanotus s p p , проволочники Cyclocephala boreahs, хрущ северКукуруза ный (личинка хруща) Cyclocephala Immaculata, хрущ южный (личинка хруща) Popillia japonica, хрущик японский Chaetocnema puhcana, жук-блошка Sphenophorus maidis, долгоносик кукурузный Phyllophaga cnnita, личинка хруща Eleodes, Conoderus и Aeolus spp, проволочники Oulema melanopus, листогрыз зерСорго новой Chaetocnema puhcana, жук-блошка Sphenophorus maidis, долгоносик кукурузный Oulema melanopus, листогрыз зерновой Hypera pifncrata, долгоносик точечПшеница ный Diabrotica undecimpunctata howardi, блошка длинноусая южная Zygogramma exclamatioms, совка Подсолнечник подсолнечниковая восклицательная Bothyrus gibbosus, жук морковный Anthonomus grandis, долгоносик Хлопчатник хлопковый Colaspis brunnea, виноградный колапсис Lissorhoptrus oryzophilus, долгоносик Рис рисовый водяной Sitophilus oryzae, долгоносик рисовый Epilachna vanvestis, жук фасолевый Соя мексиканский Пшеница Хлопчатник Рис Соя Ячмень Рапс Таблица 4 Hemiptera (клопы) Bhssus leucopterus leucopterus, клог белокрылый Bhssus lepcopterus leucopterus, клог Сорго белокрылый Хлопчатник Lygus hneolans, клопик луговой Bhssus leucopterus leucopterus, клог белокрылый Рис Acrosternum hilare, клоп-щитник Acrosternum hilare, клоп-щитник Соя Bhssus leucopterus leucopterus, клог белокрылый Acrosternum hilare, клоп-щитник Ячмень Euschistus servus, клоп-щитник коричневый Кукуруза Таблица 5 Orthoptera (Кузнечики, Сверчки и Тараканы) Кукуруза Таблица 3 Homoptera (белокрылки, тли и т д ) Кукуруза Сорго Rhopalosiphum maidis, тля кукурузная листовая Anuraphis maidiradicis, тля кукурузная корневая Rhopalosiphuffl maidis, тля кукурузная листовая Sipha flava, тля желтая сахарного тростника Русская пшеничная тля Chizaphis graminum, тля злаковая Macrosiphum avenae, тля зерновая Aphis gossypii, тля хлопковая Pseudatomoscehs senatus, клоп-слепняк Tnaleurodes abutilorjea, белокрылка окаймленная Nephotettix mgropictus, цикадка рисовая Myzus persicae, тля персиковая Empoasca fabae, цикадка картофельная Schizaphis graminum, тля злаковая (масличная культура) Brevicoryne brassicae, тля капустная Пшеница Хлопчатник Melanoplus ноногая Melanoplus гуинипес Melanoplus ноногая Melanoplus чительная Melanoplus гуинипес Melanoplus ноногая Melanoplus чительная femurrubrum, кобылка красsanguimpes, кобылка санfemurrubrum, кобылка красdifferentials, кобылка отлиsanguimpes, кобылка санfemurrubrum, кобылка красdifferentials, кобылка отли 15 16 52579 Продолжение таблицы 5 Таблица 9 Orthoptera (Кузнечики, Сверчки и Тараканы) Соя Предприятие/жилище Melanoplus femurrubrum, кобылка красноногая Melanoplus differentials, кобылка отличительная Penplaneta amencana, таракан американский Blatella germamca, таракан рыжий Blatta onentahs, таракан черный Таблица 6 Diptera (мухи и комары) Кукуруза Сорго Пшеница Подсолнечник Соя Ячмень Насекомые, нападающие на человека и животных, и переносчики болезней Hylemya platura, муха ростковая Agromyza parvicorms, мушка минирующая Contarima sorghicola галлица сорговая Mayetiola destructor, муха гессенская Sitodiplosis mosellana, комарик оранжевый Meromyza amencana, меромиза американская Hylemya coarctata, муха пшеничная Neolasioptera murtfeldtiana, галлица подсолнечниковая семенная Hylemya platura, муха ростковая Hylemya platura, муха ростковая Mayetiola destructor, муха гессенская Aedes aegypti, комар желтолихорадочный Aedes albopictus, комар лесной дневной Phlebotomus papatasii, москит обыкновенный Musca domestica, муха комнатная Tabanus atratus, слепень черный Cochhomyia homimvorax, муха мясная Таблица 7 Thysanoptera (трипсы) Anaphothnps obscurus, трипе бесщетинный Пшеница Franklmiella fusca, трипе табачный Thnps tabaci, трипе луковый Хлопчатник Franklmiella fusca, трипе табачный Sencothnps vanabihs, трипе соевый Соя Thnps tabaci, трипе луковый Кукуруза Таблица 8 Hymenoptera (пилильщики, муравьи, осы и т п ) Кукуруза Пшеница Solenopsis milesta, муравей-вор Cephus cinctus, пилильщик хлебный американский Другие отряды и их типичные представители Dermaptera (уховертки) Isoptera (термиты) Mallophaga (пухоеды) Anoplura (вши) Siphonaptera (блохи) Forficula auriculana, уховертка обыкновенная Reticuhtermes flavipes, термит желтоногий Cuclotogaster heterographa, пухоед куриный Bovicola bovis, вошь бычья Pediculus humanus, вошь головная Ctenocephahdes fehs, блоха кошачья Таблица 10 Асап (клещи и иксодовые клещи) Кукуруза Сорго Пшеница Хлопчатник Соя Ячмень Асап (клещи), имеющие важное медицинское и ветеринарное значение Tetranychus urticae, клещик паутинный двупятнистый Tetranychus cinnabannus, клещик паутинный карминовый Tetranychus unleae, клещик паутинный двупятнистый Асепа tuhpae, галловый клещ Tetranychus cinnabannus, клещик паутинный карминовый Tetranychus urticae, клещик паутинный двупятнистый Tetranychus turkestam, клещик паутинный туркестанский Tetranychus urticae, клещик паутинный двупятнистый Petrobia latens, клещик клеверный Demacentor vanabihs, иксодовый клещ изменчивый Agras persicus, персидский клещ Dermatophagoides fannae, клеш домашней пыли американский, Dermatophagoides pteronyssinus, клещ домашней пыли европейский В настоящее время установлено, что пестицидные белки могут быть выделены из Bacillus во время фазы вегетативного роста, другие штаммы могут быть выделены с помощью стандартных методик, и их активность может быть определена в отношении конкретных вредителей растений и других вредителей Обычно штаммы Bacillus могут быть выделены из любых объектов окружающей среды, включая почву, растение, насекомое, зерновую элеваторную пыль, другие объекты и т п с помощью методов, известных в данной области техники См , например, Travers и др (1987) Appl Environ Microbiol 53 1263-1266, Saleh и др (1969) Can J Microbiol 15 1101-1104, DeLucca и др (1981) Can J, Microbiol 27 865-870, и Norns и др (1981) "The genera Bacillus and Sporolactobacillus", в Starr и др (ред ), The Procaryotes A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria, том II, изд-во Sprmger-Verlag, Berlin-Heidelberg После выделения штаммы могут быть испытаны на пестицидную активность во время вегетативного рос 52579 18 17 та Таким способом могут быть определены новые быть очищены обычной хроматографией, вклюпестицидные белки и штаммы чающей гельфильтрирующую, ионообменную и иммуноафинную хроматографии, жидкостную Те микроорганизмы рода Bacillus, которые исхроматографию высокого давления, в частности, пользуются в настоящем изобретении, включают жидкостную хроматографию высокого давления с Bacillus cereus и Bacillus thunngiensis, а также виды обращенной фазой, ионообменную жидкостную Bacillus, перечисленные в таблице 11 хроматографию высокого давления, размерную вытеснительную жидкостную хроматографию выТаблица 11 сокого давления, хроматофокусирующую хроматографию высокого давления и хроматрграфию выСписок видов Bacillus сокого давления с гидрофобным взаимодействием и т д , электрофоретическим разделением, в частВ megatenum ности, одномерным гель-электрофорезом, двуВ Cereus* мерным гель-электрофорезом и т д Такие методы В cereus var mycoides известны в данной области техники, См,, наприВ Thunngiensis* Морфологисеская мер, Currant Protocols in Molecular Biology, Vols 1 и В hcheniformis група 1 2, Ausubel и др (редакторы), John Wiley & Sons, В Subtil is* NY (1988) Кроме того, могут быть приготовлены В pumilus антитела для практически чистых препаратов белВ Firmus* ка См , например, Radka и др (1983) J Immunol В coagulans 128 2804, и Radka и др (1984) Immunogenetics В polymyxa 19 63 Для очистки белка, имеющего пестицидные В macerans свойства, могут быть использованы любые комбиВ circulans нации вышеуказанных методов После того, как В stearothermophilus выбран протокол, пестицидную активность опреВ Alvei* Морфологическая деляют после каждой стадии очистки В Laterosporus* группа 2 В brevis В результате таких стадий очистки получается В pulvifaciencs практически очищенная белковая фракция Под В Popilhae* терминами "практически очищенный" или "практиВ чески чистый" понимается белок, в котором пракlentimorbus В тически отсутствуют любые компоненты, обычно Larvae* Морфологическая В связанные с белком в его естественном состояSphaencus* группа 3 В нии "Практически чистые" препараты белка могут pasteuni Неопределенные штаммы быть оценены по отсутствию других выявляемых В полос белков при анализе методом электрофореApiarus* В за в полиакриамидном геле с додецилсульфатом fihcolomcus Подгруппа А В натрия (ДСН-ПААГ), что определяется визуально thiaminolyticus или денсиометрическим сканированием С другой В alcalophilus стороны, отсутствие в очищенных препаратах друВ cirroflagellosus Подгруппа В гих амино-концевых последовательностей или Nв chitinosporus концевых радикалов может характеризовать уров lentus вень очистки Уровень очистки может быть провев badius рен с помощью рехроматографии "чистых" препав aneunnolyticus Подгруппа С ратов, показывающей отсутствие других пиков при в macroides ионообменном, с обращенной фазой или капилв freundenreichii лярном эле кто рофо резе Термины "практически в pantothenticus Подгруппа D чистый" или "практически очищенный" не означав epiphytus ют, что исключаются искусственные или синтетив aminovorans ческие смеси белков с другими компонентами в globisporus Подгруппа Е1 Указанные термины также не означают, что исв insolitus ключается присутствие минорных примесей, котов psych rophil us рые не взаимодействуют с биологической активв psych rosaccharolyticus Подгруппа Е2 ностью белка, и которые могут присутствовать, в macquanensis например, вследствие неполной очистки * = Штаммы Bacillus, которые ранее были обнаружеНекоторые белки представляют собой одины в насекомых Группировка дана согласно Parry, ночные полипептидные цепи, в то время как мноJ М и др (1983) Color Atlas Bacillus species, Wolfe гие белки состоят из более, чем одной полипепMedical Publications, London тидной цепи После того, как очищенный белок выделен, белок или полипептидыиз которых он В соответствии с настоящим изобретением состоит, могут быть охарактеризованы и секвенипестицидные белки, производимые во время вегерованы с помощью стандартных методов, известтативного роста, могут быть выделены из Bacillus ных в данной области техники Например, очиВ одном из примеров выполнения изобретения щенный белок или полипептиды, из которых он могут быть выделены инсектицидные белки, просостоит, могут быть разделены на фрагменты с изводимые во время вегетативного роста, обознапомощью дицианбромида или с помощью протеаз, чаемые ниже как ВИБ (вегетативные инсектицидтаких, как папаин, химотрипсин, трипсин, лизил-Сные белки) Методы выделения белка известны в эндопептидаза и т д (Oike и др (1982) J Biol данной области техники В общем белки могут 52579 20 цидных белков Эти белки называются далее "ауксилярными белками" Хотя механизм такого действия точно не выяснен, при совместном действии ауксилярного белка и рассматриваемого пестицидного белка инсектицидные свойства пестицидного белка увеличиваются в несколько раз Пестицидные белки по настоящему изобретению могут иметь различный молекулярный вес, молекулярный вес составляющих их полипептидов по крайней мере ЗОкДа или выше, предпочтительно около 50кДа или выше Ауксилярные белки по настоящему изобретению могут иметь различный молекулярный вес, их молекулярный вес составляет по крайней мере примерно 15кДа или выше, предпочтительно примерно 20кДа или выше Сами ауксилярные белки могут состоять из полипептидов Известно, что белки могут различаться по моВозможно, что пестицидный белок и ауксилекулярному весу, составу пептидов, активности в лярныи белок могут быть составляющими многоотношении определенных вредителей и другим мерного пестицидного белка Такой пестицидный характеристикам Однако с помощью описанных белок, включающий ауксилярные белки в качестве ниже способов могут быть выделены и охарактеодного или более составляющих его полипептиризованы белки, активные против разнообразных дов, может иметь различный молекулярный вес, вредителей его молекулярный вес может быть по крайней мере от 50кДа до по крайней мере 200кДа, предпочИзвестно, что после того, как очищенный бетительно примерно от ЮОкДа до 150кДа лок выделен и охарактеризован, он может быть видоизменен различными способами, включаюАуксилярныи белок может быть использован в щими аминокислотные замещения, удаления и комбинации с пестицидными белками по настоявнедрения Способы таких воздействий У широко щему изобретению для повышения активности известны в данной области техники Например, Для определения того, будет ли ауксилярныи беразличные варианты аминокислотных последовалок влиять на активность, пестицидный белок тельностей могут быть получены путем мутаций в можно экспрессировать отдельно и в комбинации ДНК Такие варианты будут обладать желаемой с ауксилярным белком, и соответствующие активпестициднон активностью Очевидно, что мутации, ности сравнивать при внесении в пищу с точки которые будут сделаны в ДНК, кодирующей данзрения увеличения пестицидной активности ный вариант, не должны приводить к расположеМожет быть полезно отбирать штаммы на понию последовательности вне считываемого остотенциальную пестицидную активность путем тесва цепи и предпочтительно не должны создавать тирования активности штамма отдельно и в комкомплементарные области, в которых может пробинации с ауксилярным белком В некоторых слуизводиться вторичная структура мРНК См, публичаях ауксилярныи белок в сочетании с нативными кацию заявки на Европейский патент 75444 белками штаммов проявляет пестицидную активность, которая не была выявлена при отсутствии Таким образом, настоящее изобретение ауксилярного белка включает пестицидные белки, а также их компоненты и фрагменты То есть признается, что могут Ауксилярныи белок может быть модифициробыть получены компоненты полипептидов или ван, как описано выше, с помощью различных фрагменты белков, которые сохраняют пестицидспособов, известных в данной области техники ную активность Эти фрагменты включают рассеСледовательно, в настоящем изобретении термин ченные последовательности, а также N-концевые, "вегетативный инсектицидный белок" (ВИБ) вклюС-концевые, внутренние аминокислотные послечает такие производимые во время вегетативного довательности белков и аминокислотные послероста белки, которые по отдельности или в комдовательности белков с внутренним удалением бинации могут быть использованы как средства, обладающие пестицидной активностью Это поняFie ожидается, что большинство удаленний, тие включает пестицидные белки, ауксилярные внедрений и замещений последовательностей в белки и такие белки, которые проявляют активбелке приведет к радикальным изменениям ханость только в присутствии ауксилярного белка, рактеристик пестицидного белка Однако, когда или полипетидные составляющие этих белков трудно заранее точно предсказать эффект замещения, удаления или внедрения, любой специаПризнается, что существуют альтернативные лист в данной области техники поймет, что эфспособы, пригодные для получения нуклеотидных фект может быть оценен с помощью традициони аминокислотных последовательностей указанных методов отбора ных белков Например, для получения нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидБелки или другие компоненты полипептидов, ный белок, из генной библиотеки могут быть выописанные в настоящем изобретении, могут быть делены космидные клоны, которые экспрессируют использованы отдельно или в комбинации Т е этот пестицидный белок Из более крупных активдля борьбы с различными насекомыминых космидных клонов могут быть созданы более вредителями могут быть использованы несколько мелкие субклоны и изучена их активность Таким белков Кроме того, некоторые белки по настояобразом, можно определить последовательность щему изобретению повышают активность пести 19 Chem 257 9751-9758, Liu и др(1983) Int J Pept Protein Res 21 209-215) Полученные пептиды разделяют предпочтительно с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД), или с помощью пептизации гелей и электроблоттинга на поливинилиденфторидных мембранах и подвергают секвенированию белков Для выполнения этой задачи пептиды предпочтительно анализировать с помощью автоматических секвенаторов Известно, что можно определить N- концевые, С-концевые или внутренние аминокислотные последовательности На основе аминокислотной последовательности очищенного белка может быть синтезирована нуклеотидная последовательность, которая может быть использована как образец для выделения гена, кодирующего пестицидный белок 52579 22 21 в клопах, экспрессирующих активный пестицидческой Это означает, что могут использоваться ный белок, для того, чтобы определить нуклеосинтетические или частично соптимизированные тидную последовательность в гене Затем для последовательности белка может быть установлена аминокислотная Подобным образом нуклеотидные последопоследовательность Для ознакомления с принявательности могут быть соптимизированы для тыми молекулярными методами см , например, экспрессии в любом микроорганизме ПредпочтиMolecular Clonmng, A Laboratory Manual, 2-е изд , тельное применение кодона для Bacillus см , натома 1-3, Sambrook и др (редакторы) Cold Spring пример, в патенте США 5024837 и Johansen и др Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), Gene, 65 293-304 (1989) и приведенные в этой публикации ссылки Методологии для конструирования полигенных экспрессирующих кластеров в растении, а Настоящее изобретение также включает нуктакже для введения чужеродной ДНК в растения, леотидные последовательности из организмов, описаны в данной области техники Такие полиотличных от Bacillus, где нуклеотидные послегенные экспрессирующие кластеры могут вклюдовательности могут быть выделены путем гибчать в себя промоторы, терминаторы, усилители, ридизации с нуклеотидными последовательфакторы инициации последовательностей, нитроностями Bacillus по настоящему изобретению Таны и другие регуляторы последовательностей, кие нуклеотидные последовательности могут быть действенно связанные с последовательностью, испытаны на цестицидную активность Изобретекодирующей пестицидный белок ние также включает белки, кодируемые нуклеотидными последовательностями Кроме того, изоОбычно при интродукции чужеродной ДНК в бретение включает белки, полученные из других растения в качестве вектора для доставки чужеорганизмов, отличных от Bacillus, в которых белок родной ДНК используют Ti-плазмидный вектор, а перекрестно реагирует с антителами, выделивтакже прямое поглощение ДНК, липосомы, элекшимися в ответ на белки по настоящему изобретропарацию, микроиньекцию и применение микротению И в этом случае выделенные белки могут снарядов Такие способы опубликованы в данной быть изучены на пестицидную активность с помообласти техники См , например, Guerche и др щью методов, описанных в настоящем изобрете(1987), Plant Science, 5211-116, Neuhause и др нии (1987), Theor Appl Genet, 75 30-36, Klein и др (1987), Nature, 327 70-73, Howeh и др (1980), SciПосле того, как нуклеотидные последовательence, 208 1265, Horsch и др (1985), Science 227 ности, кодирующие пестицидные белки по на1229-1231, DeBlock и др , (1989), Plant Physiology, стоящему изобретению, выделены, с ними можно 91 694-701, Methods Molecular Biology (Weissbach манипулировать и использовать для экспрессии и Weissbach, редакторы) Academic Press, Inc данного белка в различных хозяевах, включающих (1989) См, также описание ЗАЯВКИ на патент другие организмы, в том числе микроорганизмы и США 08/008374, включенную в настоящее описарастения ние в качестве ссылки См также описание заявки Пестицидные гены по настоящему изобретена Европейский патент 0193259 и описание заявки нию можно оптимизировать для увеличения эксна Европейский патент 0451878А1 Ясно, что мепрессии в растениях См , например, заявку на тод преобразования будет зависеть от растительпатент США 07/951715, описание заявки на Евроной клетки, которая должна быть преобразована пейский патент 0359472, описание заявки на Европейский патент 0385962, описание к междунаВ дальнейшем установлено, что компоненты родной заявке WO 91/16432, полигенных экспрессирующих кластеров могут быть модифицированы с целью усиления эксPerlak и др (1991), Proc NatJ, Acad Sei USA, прессии Например, могут быть использованы 88 3324-3328, и Murray и др (19S9), Nucleic Acids рассеченные последовательности, нуклеотидные Research, 17 477-498 Таким образом, могут быть замещения или другие модификации См , наприсинтезированы гены, использующие предпочтимер, Perlak и др (1991) Proc Natl Acad Sei USA, тельные для растения кодоны Таким образом, 88 3324-3328, Murray и др (1989), Nucleic Acid Reпредпочтительным кодоном для определенного search, 17 477-498, и Международную заявку WO хозяина является один кодон, который наиболее 91/16432 часто кодирует определенную аминокислоту в указанном хозяине Например, предпочтительный Конструкция также может включать другие некодон кукурузы для конкретной аминокислоты мообходимые регуляторы, такие, как терминаторы, жет быть установлен на основе известных генети(Guenneau и др (1991), Мої Gen Genet, 226,141ческих последовательностей кукурузы Использо144, Proudfoot, (1991), Cell, 64 671-674, Sanfacon и вание кодона кукурузы для 28 генов из растений др , (1991), Genes Dev, 5 141-149, Mogen и др кукурузы описано у Murray и др (J989), Nucleic (1990), Plant Cell, 2 1261 -1272, Munroe и др (1990), Acids Research, 17 477-498, раскрытие сущности Gene, 91 151-158, Ballas и др (1989), Nucleic Acids этого исследования включено в настоящее изоRes , 17 7891-7903, Joshi и др (1987), Nucleic Acid бретение в качестве ссылки Синтетические гены Res, 15 9627-9639), трансляционные согласоватакже могли быть созданы на основе распределетели последовательностей растения (Joshi, С Р , ния кодонов конкретного хозяина, используемого (1987), Nucleic Acids Research, 15 6643-6653), индля определенной аминокислоты троны (Luehrsen и Walbot, (1991), Мої Gen Genet, 225 81-93) и т п , действенно связанные с нуклеоТаким образом, нуклеотидные последоватидными последовательностями Может оказаться тельности могут быть соптимизированы для экспредпочтительным включать лидерные 5'прессии в любом растении Признается, что вся концевые последовательности в конструкцию поили любая часть генетической последовательнолигенного экспрессирующего кластера Такие листи может быть соптимизированной или синтети 23 дерные последовательности могут способствовать увеличению трансляции Трансляционные лидерные последовательности известны в данной области техники и включают лидерные последовательности пикорнавирусов, например, лидерная последовательность EMCV (энцефаломиокардитная 5'-некодирующая область) (ElroyStem О , Fuerst T R и Moss В (1989), PNAS USA, 86 0126-6130), лидерные последовательности потивирусов, например, лидерная последовательность TEV (вирус табачной гравировки) (Allison и др , (1986), лидерная последовательность MDMV (вирус мозаичной карликовости кукурузы), Virology, 154 920), и белок, связывающий тяжелую цепь человеческого иммуноглобулина (BiP), (Macejak D G и SarnowP,, (1991), Nature, 353 90-94, нетранслируемая лидерная последовательность из белковой оболочки мРНК вируса мозаичной болезни люцерны (AMV RNA 4), (Joblmg S А и Gehrke L , (1987), Nature, 325 622-625), лидерная последовательность вируса мозаичной болезни табака (TMV), (Gallic D R и др , (1989), Molecular Biology of RNA, стр 237-256, и лидерная последовательность вируса хлорозной пятнистости кукурузы (MCMV) (Lommel SA и др , (1991), Virology, 81 382-385 См также DellaСюрра и др , (1987), Plant Physiology, 84 956-968) В полигенных экспрессирующих кластерах может быть использован растительный терминатор См Rosenberg и др , (1987), Gene, 56 125, Guenneau и др (1991), Мої Gen Genet, 226 141144, Proudfoot, (1991), Cell, 64 671-674, Sanfacon и др , (1991), Genes Dev, 5 141-149, Mogen и др , (1990), Plant Cell, 2 1261-1271, Munroe и др, (1990), Gene, 91 151-158, Bailas и др , (1989), Nucleic Acid Res, 17 7891-7930, Joshi и др (1987), Nucleic Acid Res , 15 9627-9639 Для тканеспецифичной экспрессии нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут быть действенно связаны с тканеспецифичными промоторами См , например, описание заявки на патент США 07/951715, включенное в настоящее изобретение в качестве ссылки Установлено, что гены, кодирующие пестицид ные белки, могут быть использованы для трасформации патогенных для насекомых организмов Такие организмы включают бакуловирусы, грибы, простейших, бактерии и нематоды Штаммы Bacillus по настоящему изобретению могут быть использованы для защиты сельскохозяйственных культур и продуктов от вредителей Кроме того, ген, кодирующий пестицид, может быть введен с помощью подходящего вектора в хозяин -микроорганизм, и указанный хозяин внесен в окружающую среду, или растения, или животных Могут быть выбраны хозяева-микроорганизмы, для которых известна способность занимать "фитосферу" (поверхность листьев, сферу листьев, сферу корней и/или поверхность корней) одной или более представляющих интерес сельскохозяйственных культур, Эти микроорганизмы выбирают так, чтобы они были способны успешно конкурировать в определенной среде с микроорганизмами дикого типа, обеспечивать стабильное 52579 24 сохранение и экспрессию гена, обладающего способностью к экспрессии полипептидного пестицида, и желательно обеспечивать улучшенную защиту пестицида от разложения и инактивации в окружающей среде Такие микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы Особенный интерес представляют такие микроорганизмы, как бактерии, например, Pseudomonas, Erwima, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonus, Methyhus, Agrobactenum.Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcahgenes, грибы, особенно дрожжевидные грибы, например, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium Особенный интерес представляют такие виды бактерий фитосферы, как Pseudomonas syrmgae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylmum, Agrobactena, Rhodopseudomonus spheroides, Xanthomonas campestns, Rhizobium mehoti, Alcahgenes entrophus, Clavibacter xyh и Azotobacter vmlandn, и такие виды дрожжевидных грибов фитосферы, как Rhodotorula rubra, R glutnis, R marina, R aurantica, Cryptococcus albidus, С diffluens, С laurentii, Saccharomyces rosei, S pretonensis, S cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans Особенный интерес представляют пигментированные микроорганизмы Для введения гена, экспрессирующего пестицидный белок в хозяине-микроорганизме, в условиях, обеспечивающих стабильное сохранение и экспрессию гена, существует большое количество способов Например, могут быть сконструированы полигенные экспрессирующие кластеры, включающие представляющие интерес конструкции ДНК, действенно связанные с регуляторными сигналами транкскрипции и трансляции для экспрессии конструкций ДНК, и последовательность ДНК, гомологичная последовательности в организмехозяине, посредством чего достигается интеграция, и/или система репликации, которая функционирует в хозяине, посредством чего достигается интеграция или стабильное сохранение Регуляторные сигналы транскрипции и трансляции включают, но не ограничены ими, промотор, сайт инициации транскрипции, операторы, активаторы, усилители, другие регуляторные элементы, рибосомальные сайты связывания, кодон-инициатор, сигналы терминации (окончания) и т п См , например, патент США 5039523, патент США 4853331, выложенную заявку на Европейский патент 0480762А2, SambrooK и др , supra, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Maniatis и др (редакторы) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982), Advanced Bacterial Genetics, Davis и др (редакторы) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980), и помещенные в них ссылки Подходящие клетки хозяина, у которого содержащие пестицид клетки могут быть обработаны для того, чтобы пролонгировать активность токсина в клетке, когда обработанная клетка вносится в среду, окружающую вредителя (лей) мишень, могут включать как прокариот, так и эукариот, что обычно лимитируется теми клетками, 25 52579 26 лонгировать активность токсина, образованного в клетке, когда клетка внесена в среду, окружающую вредителя (лей) -мишень Кроме того, пестициды образуются благодаря интродукции гетсрологичного гена в клеткухозяина, Экспрессия гетсрологичпого гена приводит, прямо или косвенно, к внутриклеточному производству и сохранению пестицида Эти клетки затем обрабатывают в условиях, позволяющих пролонгировать активность токсина, образованного в клетке, когда клетка внесена в среду, окружающую вредителя(лей) мишень, Образовавшийся продукт сохраняет токсичность токсина Эти естественные инкапсулированные пестициды могут быть затем приготовлены по обычной технологии для внесения в естественное окружение вредителя-мишени например, почву, воду, листья растений См , например, описание заявки на ЕвPseudomonadaceae, таких, как, Pseudomonas и ропейский патент 0192319 и ссылки, приведенные Acetobacter, Azotobacteraceae и Nitrobacteraceae в ней СредІ эукариот - это грибы, такие, как Phycomy которые не производят веществ, токсичных для высших организмов, таких, как млекопитающие Однако можно использовать и организмы, образующие токсичные для высших организмов вещества, если токсины нестабильны или если норма расхода при использовании достаточно низка, что позволяет исключить любую возможность токсичности для хозяина-млекопитающего В качестве хозяев особенный интерес представляют прокариоты и низшие эукариоты, такие, как грибы Примеры прокариот как грамотрицательных, так и грам положительных, включают Enterobactenaceae, таких, как Eschenchia, Erwima, Shigella, Salmonella и Proteus, Bacillaceae, Rhizobiceae, таких, как Rhizobium, Spinllaceae, таких, как фотобактерия, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibno, Spirillum, Lactobacillaceae, cetes и Ascomycetes, которые включают дрожжевидные грибы, такие, как Saccharomyces и Schizosaccharromyces, и дрожжевидные грибы из Basidioinycetes, такие, как Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces и т п Особенно интересные характеристики при выборе хозяина для целей производства включают легкость введения белкового гена в хозяина, пригодность систем экспрессии, эффективность экспрессии, стабильность белка а хозяине и наличие ауксилярных генетических возможностей Характеристики, представляющие интерес при использовании пестицидных микрокапсул, включают защитные качества для пестицида, такие, как толстые клеточные стенки, пигментацию и внутриклеточную упаковку или образование включенных тел, сродство к листу, отсутствие токсичности для млекопитающих, привлекательность для вредителей при питании, легкость гибели и фиксацию без повреждения токсина, и т п Другие важные особенности включают простоту изготовления и использования, экономичность, стабильность при хранении и т п Организмы-хозяева, представляющие особенный интерес, включают дрожжевидные грибы, такие, как Rhodotorula sp , Aureobasidium sp , Saccharomyces sp и Sporobolomyces sp , или такие другие организмы, как Eschenchia, Lactobacillus sp , Baccillus sp и T п Конкретные виды включают Pseudomonas aeurgmosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thurmgiensis, Eschenchia coh, Bacillus subtihs и т п Общие способы применения штаммов по настоящему изобретению в качестве пестицидов для борьбы или для созданния других организмов в качестве пестицидных агентов известны в данной области техники См , например, патент США 5039523 и Европейский патент 0480762 А2 Штаммы Bacillus по настоящему изобретению или микроорганизмы, которые были генетически изменены, чтобы получить пестицидный ген, и белок могут быть использованы для защиты сельскохозяйственных культур и продуктов от вредителей Согласно одному из аспектов настоящего изобретения целые, т е неповрежеднные, клетки токсин (пестицид)-продуцирующего организма обрабатывают реагентами для того, чтобы про Активно-действующие вещества по настоящему изобретению обычно вносят в виде композиций, и они могут быть внесены на возделываемую посевную площадь или растения, которые должны быть обработаны, одновременно или в чередовании с другими веществами Эти вещества могут быть и удобрениями, и донорами микроэлементов или другими препаратами, влияющими на рост растения Это также могут быть определенные гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскициды или смеси нескольких этих препаратов при необходимости с добавочными приемлемыми для сельского хозяйства носителями, поверхностно-активными веществами или активирующими нанесение присадками, обычно применяемыми в области приготовления препаративных форм Пригодные носители и присадки могут быть твердыми или жидкими и являются веществами, обычно используемыми в технологии приготовления препаративных форм, например, природными или восстановленными минеральными веществами, растворителями, диспергирующими агентами, смачивающими агентами, веществами, повышающими клейкость, связующими или удобрениями Предпочтительные способы внесения активно-действующего вещества по настоящему изобретению или агрохимической композиции по настоящему изобретению, которая содержит по крайней мере один из пестицидных белков, произведенных бактериальными штаммами по настоящему изобретению, включают обработку листьев, покрытие семян или внесение в почву Количество обработок и норма расхода при обработке зависят от интенсивности заражения соответствующим вредителем В одном примере выполнения изобретения был выделен микроорганизм Bacillus cereus, обладающий способностью убивать Diabrotica virgifera virgifera и Diabrotica longicorms barbed Новый штамм В cereus AB78 был помещен в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Nothern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peona, IL 61604, USA (коллекцию патентных культур сельскохозяйственного исследовательского центра, Северный региональный исследовательский центр) и получил регистраци 27 52579 онный номер NRRL B-2105S Белок из штамма В cereus был практически очищен Очистка белка была проверена с помощью анализа методом электрофореза в ДСНПААГ и по биологической активности Белок имеет молекулярный вес от приблизительно 60 до приблизительно ЮОкДа, более конкретно от приблизительно 70 до приблизительно 90кДа и еще более конкретно приблизительно 80кДа Определение аминоконцевой последовательности показало, что N-концевая аминокислотная последовательность такова NH2-Lys-Arg-Glu-I1e-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-ThrAsx-Gly-Asp-Ser-I1e-Pro-(SEQ ID N0 8), где Asx представляет собой либо Asp, либо Asn Полная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO 7 Был приготовлен олигонуклеотидный образец области гена, кодирующего аминокислоты 3-9 NH2 -окончания Образец синтезировали путем использования кодона гена 5-токсина Bacillus thurmgensis (Bt) Нуклеотидная последовательность олигонуклеотидного образца, используемого для гибридизации с использованием саузернблоттинга, была следующей 5'-GAA ATT GAT CAA GAT CAN GAT-31 (SEQ ID N0 9), где N обозначает любое основание Кроме того, образец ДНК для ВИБ-1 гена Вс АВ78, описанного в настоящем изобретении, позволяет отобрать любой штамм Bacillus или других организмов для того, чтобы определить присутствует ли ген ВИБ-1 (или сходный ген) в естественном состоянии, или трансформированный специальным образом организм включает ген ВИБ-1 Выше было приведено описание основной части настоящего изобретения, ниже для лучшего понимания изобретения приведены более подробные примеры, которые представлены с целью иллюстрации и не могут рассматриваться как ограничивающие данное изобретение, если нет специального упоминания Экспериментальная часть Пример 1 Выделение и характеристика АВ78 Штамм Bacillus cereus AB78 выделяли в лабораторных условиях как контаминант при посеве на чашки в ТЗ-среде (на литр Згтриптона, 2гтриптозы, 1,5г дрожжевого экстракта, 0.05М фосфата натрия (рН 6,8) и 0,005г MnCL2, Travers, R S 1983) АВ78 проявил выраженную активность в отношении блошки длинноусой западной Была также продемонстрирована антибиотическая активность в отношении грам положительных Bacillus spp (таблица 12) Таблица 12 Антибиотическая активность супернатанта культуры АВ78 Испытываемые Зона ингибирования AB78 бактерии (см) Стрептомицин E coh 0,0 3,2 В megatenum 1,1 2,2 В mycoides 1,3 2,1 В cereus CB 1,0 2,0 В cereus 11950 1,3 2,1 28 В cereus 14579 В cereus AB78 Btvar isrealensis Bt var tenebnoms 1,0 0,0 1,1 0,9 2,4 2,2 2,2 2,3 Морфологические характеристики АВ78 следующие Вегетативные палочки прямые, длиной 3,15,0мм и шириной 0,5-2,0мм Клетки с закругленными концами, одиночные, собранные в короткие цепочки Из каждой клетки образуется одиночная субтерминальная, цилиндрически-овальная эндоспора Параспоральный кристалл не образуется Колонии непрозрачные, складчато-морщинистые, долевидные и плоские Не образуют пигментов Клетки подвижные Имеются жгутики Характеристики роста AB7S следующие Факультативный анаэроб с оптимальной температурой для роста 21-30°С Может расти при 15, 20, 25, 30 и 37°С Не может расти при температуре свыше 40° Растет в среде с 5 7% NaCL В таблице 13 представлен биохимический профиль АВ78 Таблица 13 Биохимические характеристики штамма АВ78 В cereus Кислота арабинозы из L Газ из L-арабинозы Кислота из D - ксилозы Газ из D-ксилозы Кислота из D глюкозы Газ из D-глюкозы Кислота из лактозы Нитрат восстановлен- + - ный N03 восстановленный + до N02 - Винилпиридин + - Н202 разложенный + + Индол - Тирозин разложенный - Дигидроксиацетон Лакмусовое молоко Газ из лактозы - кислое Лакмусовое молоко Кислота из сахарозы коагулированное Лакмусовое молоко Газ из сахарозы - щелочное Кислота из DЛакмусовое молоко - пептонизированное маннитола Лакмусовое молоко Газ из D-маннитола - восстановленное Утилизация проприо- + Казеин гидролизованната ный Крахмал гидролизоУтилизация цитрата + ванный Гидролиз гиппурата с Желатин сжиженный Метилен голубой вос- + Лецитиназа образостановленный ванная Метилен голубой пе- + реокисленный + — + + + с С = слабая реакция Пример 2 Бактериальная культура Субкультуру штамма АВ78 Вс использовали для инокуляции в следующую среду, известную как ТВ-бульон 29 Триптон 12г/л Дрожжевой экстракт 24г/л Глицерин 4мл/л КН2Р04 2,1 г/л К2НР04 14,7г/л рН7,4 Фосфат калия добавляли к автоклавированному бульону после охлаждения Колбы инкубировали при 30°С на ротационном шейкере при 250об/мин в течение 24 - 36 часов Вышеописанная процедура легко может быть адаптирована для ферментеров больших размеров с помощью способов, хорошо известными в данной области техники Во время фазы вегетативного роста, обычно в течение 24 - 36 часов после начала культивирования, бактерии штамма АВ78 были отцентрифугированы от супернатанта культуры Супернатант культуры, содержащий активный белок, использовали для определения биологической активности Пример 3 Определение биологической активности для насекомых АКТИВНОСТЬ штамма АВ78 В cereus в отношении различных насекомых испытывали в соотвтствии с описанным ниже Западная, северная и южная блошки длинноусые, Diabrotica virgifera virgifera D longicorms barben и D undecempiinctata howardi соответственно из супернатанта культуры АВ78, выращенной в течение 24-36 часов, приготавливали растворы, смешивали с искусственной питательной жидкой средой (Marrone и др ,(1985), J of Economic Entomology, 78 290-293) и давали возможность отвердеть Отвердевшую среду разрывали и помещали в чашки Новорожденных личинок помещали на питательную среду и выдерживали при 30°С Учет гибели проводили через 6 дней Биоанализ клона Ecoh Ecoh выращивали в течение ночи в L-Amp100 при 37°С 10мл культуры разрушали ультразвуком 3 раза по 20сек, 500мл разрушенной ультразвуком культуры добавляли к жидкой питательной среде для блошки длинноусой западной Колорадский жук, Leptmotarsa decemlmeata из супернатанта культуры АВ78, выращенной в течение 24-36 часов, приготавливали растворы в Тритоне Х-100 (до получения конечной концентрации 0,1% ТХ-100) Кусочки картофельного листа размером 5см 2 погружали в эти растворы, высушивали на воздухе и помещали на влажную фильтровальную бумагу в пластиковые чашки Новорожденных личинок помещали на кусочки листьев и выдерживали при 30°С Учет гибели проводили через 3 - 5 дней Большой мучной хрущак, Tenebrio mohtor из супернатанта культуры АВ78, выращенной в течение 24-36 часов, приготавливали раствор, смешивали с жидкой искусственной питательной средой (Bioserv #F9240) и давали возможность отвердеть Отвердевшую среду разрывали и помещали в пластиковые чашки Новорожденных личинок помещали на питательную среду и выдержали при 30°С Учет гибели проводили через 6-8 дней Кукурузный мотылек, совка-ипсилон, коробочный червь хлопчатника, бражник и совкакарадрина, Ostrmia nubilahs, Agrotis ipsilon, Hehothis virescens, Manduca sexta и Spodoptera 52579 ЗО exigua соответственно из супернатанта культуры AB7S, выращенной в течение 24-36 часов, приготавливали растворы в ТХ-100 (до получения конечной концентрации 0,1% ТХ-100) С помощью пипетки 100мл помещали на поверхность площадью 18см2 отвердевшей искусственной питательной среды (Bioserv #F9240) и давали возможность высохнуть на воздухе Затем новорожденных гусениц помещали на поверхность питательной среды и выдерживали при 30°С Учет гибели проводили через 3-6 дней Комар обыкновенный Culex pipiens из супернатанта культуры АВ78, выращенной в течение 24 - 36 часов, приготавливали растворы С помощью пипетки 100мл помещали в 10мл воды в пластиковую чашку объемом 30мл Личинок третьей возрастной стадии выпускали в воду и выдерживали при комнатной температуре Учет гибели проводили через 24 - 48 часов Спектр энтомологической активности АВ78 представлен в таблице 14 Таблица 14 Активность супернатанта культуры АВ78 в отношении различных видов насекомых Виды насекомых, испыты- Отряд Активность ваемых за период Блошка длинноусая запад- Col + ++ ная (Diabrotica virgifera virgifera) Блошка длинноусая север- Col + ++ ная (Diabrotica longicorms barben) Блошка длинноусая южная Col (Diabrotica imdecimpimctata howardi) Колорадский жук (Leptmo- Col tarsa decemlmeata) Большой мучной хрущак Col (Tenebrio mohtor) Мотылек кукурузный (Os- Lep tnma nubilahs) Коробочный червь хлопчат- Lep ника (Hehothis virescens) Бражник (Manduca sexta) Lep Совка -карадрина Lep (Spodoptera exigua) Совка -ипсилон (Agrotis Lep ipsilon) Комар обыкновенный (Culex Dip pipiens) Показано, что впервые описанный штамм АВ78 В cereus обладает спектром инсектицидной активности, существенно отличным от известных, активных в отношении жесткокрылых, 5эндотоксинов из Bt В частности, АВ78 показал более селективную активность в отношении жуков по сравнению с известными, активными в отношении жесткокрылых, штаммами Bt, в частности, он показал специфическую активность для Diabrotica spp Более конкретно, он оказался наиболее активным в отношении D virgifera virgifera и D longicorms barbed, но не для D undecimpunctata howardi 52579 32 31 Была определена биологическая активность в пропуская через обессоливающую колонку течение вегетативного роста нескольких штаммов Обессоленное вещество титровали до рН 3,5 Bacillus в отношении блошки длинноусой западной при помощи 20мМ цитрата натрия, рН 2,5 После (таблица 15) Из результатов видно, что уникаль30 минутной инкубации при комнатной температуная активность АВ78 в отношении блошки длинре раствор центрифугировали при ЗОООхд в теченоусой западной не является общим явлением ние 10 минут На этой стадии супернатант содержал самое большое количество активного белка, Таблица 15 После нейтрализации, до значения рН 7,0 супернатант вносили в Mono-Q, анионообменник, колонку уравновешивали при помощи 20мМ Активность супернатантов культур различных ТРИС, рН 7,5 при скорости потока ЗООмл/мин КоBacillus spp в отношении блошки длинноусой лонку проявляли ступенчато с применением лизападной (БДЗ) нейного градиента 400мМ NaCL в 20мМ ТРИС, рН 7,5 Процент гибели Штамм Bacillus Определение биологической активности БДЗ фракций колонки и анализ методом электрофореBcereusAB78 (Bat1) 100 за в ДСН-ПДАГ использовали для выявления акВ cereus AB78 (Bat 2) 100 тивных фракций Анализ методом электрофореза В cereus (Carolina Bio ) 12 в ДСН-ПААГ выявил биологически активный белок В cereus ATCC 11950 12 с молекулярным весом в области 80кДа В cereus ATCC 14579 8 Пример 5 Анализ последовательности белка, В mycoides (Carolina Bio ) 30 активного в отношении блошек длинноусых В popilhae 28 Белок с молекулярным весом 80кДа, выдеBthunngiensisS HD135 41 ленный с помощью анализа методом электрофоВ thunngiensis HD191 9 реза в ДСН-ПААГ, переносили на мембрану из В thunngiensis GC91 4 ПВДФ (поливинилиденфторид) и производили В thunngiensis isrealensis 24 определение аминоконцевых последовательноВодный контроль '4 стей путем применения повторных циклов Эдмана на имульсно-жидкостном определителе последоСпецифическая активность АВ78 в отношении вательностей ABI 470 Перенос проводили в ЮмМ блошки длинноусой западной представлена в CAPS-буфере с 10% метанолом, рН 11,0 следуютаблице 16 щим образом Инкубацию геля после электрофореза Таблица 16 проводили в гибридизационном буфере в течение пяти минут Активность супернатанта, культуры АВ78 в отноМембрану из ПВДФ ProBlott слегка смачивали шении новорожденных личинок блошки длинно100% МеОН и затем уравновешивали гибридизаусой западной ционным буфером Делали многослойную структуру между вспеКонцентрация супернатанта Процент гибели ненной губкой и квадратиками из фильтровальной культуры (мкл/мл) БДЗ бумаги с конфигурацией Катод-Гель-Мембрана100 100 Анод Перенос был выполнен в течение 1 часа при 25 87 постоянном напряжении 70В, После переноса 10 80 мембрану промывали водой и окрашивали в тече5 40 ние двух минут 0,25% кумассином синим R-250 в 2,5 20 50% МеОН 1 6 Обесцвечивание осуществляли путем не0 0 скольких промывок смесью 50% МеОН, 40% воды и 10% уксусной кислоты Вычисленное значение CKso составило 6,2мкл ПОСЛЕ обесцвечивания мембрану высушивасупернатанта культуры на мл шпательной среды ли на воздухе перед вырезанием полос для анаблошки длинноусой западной лиза последовательности Для получения максиПример 4 Выделение и очистка белка из мальной эффективности и выхода использовали АВ78, активного в отношения блошек длинноусых блотт-картридж и соответствующие циклы Для Культуральная среда без клеток и их остатков идентификации и количественен оценки произбыла насыщена до 70% путем добавления тверводных РТН-аминокислот в каждом последовадого сульфата аммония, т е (472г/л) Растворение тельном цикле анализ данных выполнили с испроводили при комнатной температуре с послепользованием модели 610 математического обесдующим охлаждением в ледяной бане и центрипечения анализа последовательности фугированием при ЮОООхд в течение тридцати N-концевую последовательность определи минут для комкования осажденных белков как Супернатант удаляли и комочек растворяли в NH2-Lys-Arg-Glu-I1e-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr1/10 от первоначального объема с помощью 20мМ Asx-Gly-Asp-Ser-1le-Pro-(SEQ ID N0 8), где Asx ТРИС-HCL при рН 7,5 обозначает Asp или Asn Пример 6 Строение обРастворенный комочек обессоливали либо пуразца ДНК тем диализа в 20мМ ТРИС-HCL при рН 7,5, либо Был создан образец олигонуклеотида для об 33 52579 ласти гена, кодирующей аминокислоты 3-9 Nконцевой последовательности (пример 5) Образец синтезировали на основе использования кодона гена 5 -эндотоксина Bacillus thunngensis (Bt) Нуклеотидную последовательность 5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-31 (SEQ ID NO 9) использовали в качестве образца в гибридизациях с использованием саузерн-блоттинга Олигонуклеотид синтезировали с использованием стандартных способов и оборудования Пример 7 Определение изоэлектрической точки белка, активного в отношении блошек длинноусых Очищенный белок после стадии 5 процесса очистки анализировали на изоэлектрическом фокусирующем геле 3-9 pi с использованием системы для электрофореза Phastgel (Pharmacia) Для процессов как разделеления, так и окрашивания серебром, выполняли стандартные для этого устройства действия Значение pi было равно приблизительно 4,9 Пример 8 Данные полимеразной цепной реакции АВ78 Для того, чтобы проверить, что штамм АВ78 В cereus не содержит каких-либо генов инсектицидного кристаллического белка В thunngensis или В sphaencus, использовали анализ полимеразной цепной реакции (П Ц Р) (см , например, описание заявки на патент США 08/008006, и Carozzi и др (1991), Appl Environ Microbiol 57 (10 3057-3061, включенные В настоящее описание в качестве ссылок) (таблица 17) Таблица 17 Затравки гена инсектицидного кристаллического белка Bacillus, испытанные с помощью ПЦРв отношении ДНК АВ78 Испытываемые затравки Полученный результат 2 набора, характерные для Отрицательный CrylllACrylllB 2 набора, характерные для Отрицательный CrylA CrylA (a) Отрицательный CrylA(b), характерный Отрицательный CrylB Отрицательный CrylC, характерный Отрицательный CrylE, характерный Отрицательный 2 набора, характерные для В Отрицательный sphaencus 2 набора, характерные для Отрицательный CrylV Контроль Bacillus (PI-PLC) Положительный Пример 9 Космидное клонирование общей ДНК из штамма АВ78 В cereus Ген ВИБ-1 клонировали из общей ДНК, полученной из штамма АВ78, следующим образом Выделение ДНК АВ78 производят следующим образом 1 Выращивают бактерии в 10мл L-бульона в течение ночи (Использовать 50мл стерильную центрифужную пробирку) 2 Добавляют 25мл свежего L-бульона и ампи 34 циллин (30мг/мл) 3 Выращивают клетки, встряхивая в течение 2-6 часов при 30°С 4 Вращают клетки, помещенные в 50мл полипропиленовую оранжевую закрытую пробирку, в усовершенствованной клинической центрифуге IEC при 3/4 скорости 5 Ресуспендируют клеточный комочек в 10мл TES 6 Добавляют 30мг лизоцима и инкубируют 2 часа при 37°С 7 Добавляют 200мл 20% ДСП и 400мл протеиназы К (20мг/мл), Инкубируют при 37°С 8 Добавляют 200мл свежей протеиназы К Инкубируют 1 час при 55°С Добавляют 5мл TES (TES = 50мМ трис рН 8,0, ЮОмМ ЭДТУ (этилендиаминтетрауксусная кислота), 15мМ NaCI), чтобы получить в результате 15мл объема 9 Экстрагируют дважды фенолом (10мл фенола, вращают при комнатной темцературе при 3/4 скорости в усовершенствованной клинической центрифуге IEC) Переносят супернатант (верхнюю часть) в чистую пробирку пипеткой с широким отверстием 10 Экстрагируют один раз смесью 1 1 по объему фенола хлороформа/изоамилового спирта (соотношение 24 1) 11 Осаждают ДНК равным объемом холодного изопропилового спирта, центрифугируют до комкования ДНК 12 Ресуспендируют комочек в 5мл ТЕ 13 Осаждают ДНК с помощью 0,5мл ЗМ NaOAc, рН 5,2 и 11мл 95% этилового спирта Помещают на 2 часа в холод при -20°С 14 "Вытаскивают" ДНК из пробирки с помощью пластиковой петельки, переносят в микроцентрифужную пробирку, вращают, удаляют пипеткой избыток этилового спирта, высушивают в вакууме 15 Ресуспендируют в 0,5мл ТЕ Инкубируют 90 минут при 65°С для облегчения возвращения ДНК в раствор 16 Определяют концентрацию, используя стандартные методы Космидное клонирование АВ78 Все процедуры, если не указано иное, выполнялись в соответствии с Stratagene Protocol, Supercos 1 Instruction Manual, Cat №251301 Обычно стадии были следующими А Частичное рассечение ДНК АВ78 ферментом SAU ЗА Б Подготовка вектора ДНК В Сшивание и упаковка ДНК Г Формирование космидной библиотеки 1 Начинают разведение культуры клеток НВ101 путем помещения 50мл выдержанной в течение ночи культуры в 5мл ТВ с 0,2% мальтозой Инкубируют 3,5 часа при 37°С 2 Растягивают клетки и ресуспендируют в 0,5мл ЮмМ MgS04 3 Добавляют вместе 100мл клеток 100мл растворенной упаковочной смеси 100мл ЮмМ MgS04 30мл ТВ 4 Адсорбируют при комнатной температуре в течение 30 минут без встряхивания 5 Добавляют 1 мл ТВ и осторожно смешивают 35 52579 Инкубируют в течение 30 минут при 37°С 6 Высеивают 200мл на L-amp чашки Инкубируют в течение ночи при 37°С По меньшей мере 400 космидных клонов отобрали для изучения активности в отношении блошки длинноусой западной, как описано в примере 3 ДНК из 5 активных клонов и 5 неактивных клонов использовали в гибридизации с использованием саузерн-блоттинга Результаты показали, что гибридизация с использованием вышеописанного олигонуклеотидного образца коррелировала с активностью в отношении блошки длинноусой западной (таблица 18) Космидные клоны РЗ-12 и Р5-4 были помещены в Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) и получили регистрационные номера В-21061 и В-21059 соответственно Таблица 18 Активность космидных клонов АВ78 в отношении блошки длинноусой западной Клоны, которые были гибридизированы с образцом Р1-73 Р1-83 Р2-2 РЗ-12 Р5-4 Клоны, которые не были гибридизированы с образцом Р1-2 РЗ-8 РЗ-9 РЗ-18 Р4-6 Средний процент гибели (N = 4) 47 64 69 85 97 5 4 12 0 9 Пример 10 Идентификация области размером 6 т п н, активной в отношении блошки длинноусой западной ДНК из РЗ-12 частично рассекали с помощью рестриктазы Sau3A, связывали с вектором pUC19 Е coli и переносили в Ecoh Образец ДНК, специфичный для белка с 80кДа, синтезировали путем амплификации П Ц Р части ДНК РЗ-12 Олигонуклеотиды МК113 и МК117, которые гибридизируют с частями ВИБ-1, синтезировали с использованием неполной аминокислотной последовательности белкд с молекулярным весом 80кДа Плазмидные субклоны идентифицировали с помощью колониальной гибридизации с образцом ПЦР и определяли биологическую активность в отношении блошки длинноусой западной Один из этих клонов, PL2, гибридизирован с фрагментом ПЦР его активность в отношении блошки длинноусой западной определялась, как описано выше Отсеченный от PL2 рестрикционный фрагмент Clal размером 6 т п н клонировали в положение Smal "челночного" вектора рНТ 3101 Е coh-Bacillus (Lereclus D и др , 1989, FEMS Microbiology Letters, 60 211-218), чтобы получить рСВ6201 Эта структура обладает активностью в отношении блошки длинноусой западной и в штаммах Bacillus, и в штаммах Е coli в любой ориентации 36 pCIB6022 содержит тот же самый фрагмент Clal размером 6 т п н в pBluescnpt SK( + ) (Sfratagene), образует эквивалентный белок ВИБ-1 (показано вестерн-блоттингом) и также активен в отношении блошки длинноусой западной Нуклеотидную последовательность pCIP6022 определеляли с помощью метода дидеоксидных окончаний по Sanger и др , Proc Natl Acad Sei , USA, 74 5463-5467 (1977) с использованием, наборов PRISM Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kits и набора PRISM Sequenase® Terminator Doudle-Stranded DNA Sequencing Kit и анализировали на автоматическом определителе последовательности ABI 373 Последовательность представлена в SEQ ID N0 1 рС1В6022 поместили в Agncaltural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815, North University Street, Peona, Illinois 61604, USA, и ей присвоен регистрационный № NRRL B-21222 Пример 11 Функциональное расщепление ВИБ-1 области ДНК Для подтверждения, что открытая рамка считывания (ОРС) ВИП-1 необходима для инсектицидной активности, в гене была создана трансляционная мутация со сдвигом рамки Рестриктаза Bg1ll распознает точное месторасположение 1758 т п н в области, кодирующей ВИБ-1 рС1В6201 расщепляли с помощью Bglll и концы одиночных спиралей подвергали воздействию ДНКполимеразы (фрагмент Кленова) и dNTPS Плазмишювторно сшивали и трансформировали в Е COJI Образовавшаяся плазмидй,рС1В6203, содержала четыре нуклеотидных включения в области, кодирующей ВИБ-1 рС1В6203 не обладает инсектицидной активностью, подтверждая этим, что ВИБ-1 является основным компонентом активности в отношении блошки длинноусой западной Для дальнейшего определения области, необходимой для кодирования ВИБ-1, сконструировали области субклонов ВИБ-1 и ВИБ-2 (ауксилярный белок) и определяли их способность комплементировать мутацию в рС1В6203 рС1В6203 содержит фрагмент Xba l-EcoRV размером 3,7 т п н в pBluescnpt SK(-b) (Stratagene) Вестернблоттинг показывает, что рС1В6203 производит белок ВИБ-1 такого же размера и в таком же количестве, что и клоны PL2 и pCIB6022 рС1В6023 содержит полный ген для белка с 80кДа рС1В6023 поместили в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection, (NRRL), Nothern Regional Center, 1815 North University Street, Peona, Illinois 61604, USA и присвоили регистрационный номер № NRRL B-21223 pCIB6023 проявляет некоторую активность в отношении блошки длинноусой западной Однако уровень активности ниже, чем у рС1В6022 Смесь клеток, содержащих pCIB6203 (ВИБ-1 мутированный и ВИБ-2), и клеток, содержащих pCIB6023 (только ВИБ-1) проявляет высокую активность в отношении блошки длинноусой западной Таким образом, pCIB6023 должен производить функциональный ВИБ-1 генетический продукт, a pCIB6203 должен производить функциональный ВИБ-2 генетический продукт Эти результаты позволяют предположить, что для по 37 52579 38 лучения максимальной активности в отношении дополнительный генетический продукт(ы) из обблошки длинноусой западной необходимо иметь ласти ВИБ-2 в сочетании с ВИБ-1 См таблицу 19 Таблица 19 Характеристики рСЇВ6022 ї и а Испытываемая (іде) кокєїрукщін(и) рстьогг 500 пар нуклеоїидов К Актив«ость для БДЗ + ++ рСіВбДОЗ рсшшз РСЇВ62ОЗ Ш Прямоугольные области обозначают положение ВИБ-1 Светлое окрашивание обозначает области, кодирующие белок с 80кДа, выявленные у Bacillus Темное окрашивание обозначает Nконцевые аминокислоты, определяемых последовательностью ДНК ВИБ-1 Большая буква "X" обозначает месторасположение введенной в ВИБ-1 мутации со сдвигом рамки Стрелки показывают конструкции, транскрибируемые промотором бетагалактосидазой Сайты рестрикции С - Clal, X Xbal, S - Seal, Rl - EcoRI, В -Bglll, RV - EcoRV Пример 12 Получение антител АВ78 Продуцирование антител начинали в 2 крысах Lewis для того, чтобы иметь , возможность перейти к получению линий клеток гибридомов (гибридных клеток, продуцирующих антитела) и получить достаточное количество сыворотки для ограниченного отбора библиотеки кДНК Другим фактором было очень ограниченное количество доступного антигена, и тот факт, что он мог быть получен только путем очистки с помощью электрофореза в ПААГ и с последующей электротрансферрацией на нитроцеллюлозу Вследствие ограниченной доступности антигена на нитроцеллюлозе нитроцеллюлозу эмульгировали в диметилсульфоксиде (ДМСО) и инъецировали в подушечки на лапках задних ног животных для того, чтобы вызвать продуцирование В-клеток в вышележащих подколенных лимфатических узлах С помощью вестерн-а нал и за из первой порции крови получали сыворотку, обладающую сильной реакцией Последующие несколько инъекций и кровопускания позволили получить достаточное количество сыворотки, чтобы довести до конца весь требуемый отбор Затем в одной из крыс начинали продуцирование гибридомов Подколенные лимфатические узлы вырезали, измельчали и полученные клетки соединяли с мышиной миеломой P3x63Ag8 653 Последующий отбор клеток выполняли как описано ниже Выбирали первые четыре источника, которые давали наиболее сильную реакцию эмулированного антигена, чтобы подойти к ограниченному сокращенному клонированию Дополни рС!Вб(Ш тельные 10 источников выбирали для расширения и консервации при низкой температуре Процедура эмульгиррвания АВ78 на нитроцеллюлозе в ДМСО для отбора с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) После электротрансферации на нитроцеллюлозу образцов АВ78, прошедших электрофорез в ПААГ, используют обратимый штамм Ponceaus для визуализации всех перенесенных белков Полосу, соответствующую ранее идентифицированному токсину АВ78, у которого определены Nконцевые последовательности, определяют и вырезают из нитроцеллюлозы Каждая полоса имеет размер примерно 1мм х 5мм для того, чтобы снизить до минимума количество эмульгируемой нитроцеллюлозы Одну полосу помещают в микроцентрифужную пробирку с 250мкл ДМСО и измельчают с помощью пластикового пестика (Копtes, Vmeland, NJ) Для эмульгирования смесь с ДМСО нагревают в течение 2-3 минут при 37°С45°С После нагревания может потребоваться дополнительное измельчение, однако вся нитроцеллюлоза должна быть эмульгирована Когда АВ78 сэмульгирован, образец помещают на лед При приготовлении покрытия из эмульгированного антигена для пластинок для микротитрования образец должен быть растворен в боратном буферном растворе (ББР) в соотношениях 15, 1 10, 1 15, 1 20, 1 30, 1 50, 1 100 и 0 Покрывающий антиген должен быть приготовлен непосредственно перед применением Протокол ELISA 1 Покрывают АВ78/ДМСО в ББР Инкубируют в течение ночи при 4°С 2 Трижды промывают пластинку промывочным буфером IX ELISA 3 Блокируют (1% албумин бычьей сыворотки и 0,05% Твин 20 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР)) на 30 минут при комнатной температуре 4 Трижды промывают пластинку промывочным буфером IX ELISA 5 Добавляют крысиную сыворотку Инкубируют 1,5 часа при 37°С 39 52579 6 Трижды промывают пластинку промывочным буфером IX ELISA 7 Добавляют козлиный антикрысиный фермент в концентрации 2мкг/мл в растворителе ELISA Инкубируют 1 час при 37°С 8 Трижды промывают пластинку промывочным буфером IX ELISA 9 Добавляют кроличью антикозлиную щелочную фосфатазу в концентрации 2мкг/мл в растворителе ELISA Инкубируют 1 час при 37°С 10 Трижды промывают пластинку промывочным буфером IX ELISA 11 Добавляют субстрат Инкубируют 30 минут при комнатной температуре 12 Прекращают с помощью ЗН NaOH через 30 минут Пример 13 Усиление инсектицидной активности неактивных штаммов Bt с помощью клонов ВИБ АВ78 Добавление pCIB6203 вместе с культуральным супернатантом из штамма GC91 Bt вызывает 100%-ную гибель Diabrotica virgifera virgifera Ни pCIB6203, ни GC91 не оказывают воздействия на Diabrotica virgifera virgifera по-отдельности Результаты приведены ниже Испытываемый материал Процент гибели Diabrotica PCIB6203 0 GC91 16 pCIB6203 + GC91 100 Контроль 0 Пример 14 Выделение и биологическая активность штамма АВ81 В cereus Второй штамм В cereus, названный АВ81, выделяли из образцов элеваторной зерновой пыли с помощью стандартной методики Субкультуру АВ81 выращивали и подготавливали к биоанализу, как описано в примере 2 Биоактивность оценивали, как описано в примере 3 Результаты оказались следующими 40 Ostrima nubilahs Agrotis ipsilon Diabrotica virgifera, virgifera 0 0 55 Пример 15 Выделение и биологическая активность штамма АВ6 В thunngiensis Штамм В thunngiensis, названный АВ6, выделяли из образцов элеваторной зерновой пыли стандартными методами, известными в данной области техники Субкультуру АВ6 выращивали и подготавливали для биоанализа, как описано в примере 2 Половину образца автоклавировали в течение 15 минут для того, чтобы установить присутствие ^-экзотоксина Биологическую активность оценивали аналогично описанному в примере 3 Результаты оказались следующими Испытываемые виды насекомых Процент гибели Ostrima nubilahs 0 Agrotis ipsilon100 Agrotis ipsilon (автоклавированный 0 образец) Diabrotica virgifera virgifera 0 Штамм АВ6 поместили в Agricultural Research Service» Patent Culture Collection (NRRL), Nothern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peona, Illinois 61604, USA и присвоили регистрационный номер № NRRL B-21060 Пример 16 Выделение и биологическая характеристика штамма АВ88 В thunngiensis Штамм Bt, названный АВ88, выделяли из образцов элеваторной зерновой пыли с помощью стандартной методики Субкультуру АВ88 выращивали и подготавливали для биоанализа, как описано в примере 2 Половину образца автоклавировали в течение 15 минут для того, чтобы установить присутствие li-экзотоксина Биологическую активность в отношении различных видов насекомых оценивали аналогично описанному в примере 3 Результаты оказались следующими Испытываемые виды насекомых Процент гибели Исследованные виды насекомых Agrotis ipsilon Ostrima nubilahs Spodoptera frugiperda Hehcoverpa zea Hehothis virescens Lcptmotarsa decemlmeata Diabrotica virgifera virgifera Отряд Lepidoptera Lepidoptera Lepidoptera Lepidoptera Lepidoptera Coleoptera Coleoptera Кристаллы дельта-эндотоксина очищали от штамма АВ88 при помощи стандартных методик При изучении биологической активности не выявили активности очищенных кристаллов в отношении Agrotis ipsilon Пример 17 Очистка ВИБ-ов из штамма АВ88 Бактериальную жидкую культуру выращивали в течение ночи при 30°С в ТВ-среде Клетки центрифугировали и сохраняли супернатант Белки осаждали с помощью сульфата аммония (70% Процент гибели культуры супернатанта Неавтоклавированная Автоклавированная 100 5 100 0 100 4 100 12 100 12 0 0 0 5 насыщения), центрифугировали и сохраняли комочек Комочек ресуспендировали в начальном объеме 20мМ Трис, при рН 7,5 и подвергали диализу с помощью этого же самого буфера Диализат АВ88 оказался более мутным, чем соответствующий материал из АВ78, После осветления белки АВ88 разделяли с помощью нескольких различных методов, включающих изоэлектрическое фокусирование (Rotofor, BioRad, Hercules, СА), осаждение при рН 4,5, ионообменную хрома 41 52579 тографию, размерную вытеснительную хроматографию и ультрафильтрацию Белок, активный для кукурузного мотылька (КМ), сохранился в комочке, полученном при осаждении диализата при рН 4,5 Когда выполняли препаративнеє изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) диализата с использованием амфотерных электролитов при рН 3-10, инсектицидную активность в отношении КМ обнаруживали во всех фракциях с рН 7 или выше Электрофорез в ДСНПААГ этих фракций выявил полосы белка с MB ~ бОкДа и ~ 80кДа Полосы с MB бОкДа и 80кДа разделяли с помощью анионообменной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке Poros-Q (PerSeptive Biosistems, Cambridge, MA) Nконцевую последовательность получали из двух фракций, содержащих белки со слегка различным молекулярным весом, но примерно равным бОкДа Полученные последовательности оказались сходными между собой и с некоторыми 6эндотоксинами Анионобменная фракция 23 (меньшая) xEPFVSAxxxQxx (SEQ ID NO 10) Анионобменная фракция 28 (большая) xEYENVEPFVSAx (SEQ ID N0 11) Когда комочек (активный) при рН 4,5 далее разделяли с помощью анионного обмена на колонке Poros-Q, активность обнаруживали только в фракциях с основной полосой ~ бОкДа Активный белок совки-ипсилон также сохранялся в комочке, когда рН диализата АВ88 снижали до 4,5 При препаративном ИЭФ с использованием амфотерных электролитов с рН 3-10 активность не обнаруживали в КМ-активных фракциях ИЭФ, вместо этого она оказалась самой высокой во фракции с рН 4,5-5,0 Ее основные компоненты имеют молекулярные веса -35 и ~80кДа Комочек с рН 4,5 отделяли с помощью анионобменной ЖХВД с целью получения фракций, содержащих только материал с 35кДа и фракций, содержащих полосы как 35кДа, так и 80кДа Пример 18 Характеристика ВИБ АВ88 Фракции, содержащие вегетативные белки, активные в отношении различных чешуекрылых, приготовливали аналогично описанному в примере 17, Анализ активных фракций показывает, что различные ВИБы ответственны за активность в отношении разных видов чешуекрылых Активность для Agrotis ipsilon определяется белком с 80кДа и (или) с 35кДа, взятых либо по отдельности, либо в комбинации Эти белки не похожи на любые 5-эндотоксины из Bt, поскольку установлено, что они лишены последовательности, гомологичной известным последовательностям 5-эндотоксина Bt Кроме того, эти белки не обнаружены в кристаллах 5-эндотоксина АВ88 Nконцевые последовательности основных белков 5эндотоксина сравнивали с N-концевыми последовательностями с 80кДа и с 35кДа ВИБ, и они показали отсутствие гомологии последовательности Основные результаты оказались следующими N-концевая последователь- N-концевая последоность у ВИБ Agrotis вательность основного белка 5 эндотоксина 130кДа MDNNPNINE 42 (SEQIDN0 14) кДа 80 кДа MDNNPNINE 80 MNKNNTKLPTRALP (SEQ (SEQ ID N0 15) ID N0 12) 60 кДа MNVLNSGRTTI (SEQ ID N0 16) 35 кДа ALSENTGKDGGYIVP(SEQIDN0 13) Активность для Ostrma nubilahs определяется ВИБ с бОкДа, а активность для Spodopera frugiperda определяется ВИБ неизвестного размера Штамм АВ88 Bacillus thurmgiensis поместили в Agricultural Research Service, Parent Culture Collection (NRRL), Nothern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peona, Illinois 61604, USA, и присвоили регистрационный номер № NRRL B-21225, Пример 19 Выделение и биологическая активность других Bacillus spp Были выделены также другие виды Bacillus, которые образуют во Время вегетативного роста белки, обладающие инсектицидной активностью Эти штаммы выделяли из образцов, взятых из окружающей среды с помощью стандартных методик Выделенные штаммы подготавливали для биоананализа и изучению аналогично описанному в примерах 2 и 3 соответственно Те из них, которые, как показал биоанализ, образовывали инсектицидные белки во время вегетативного роста, обладающие активностью в отношении Agrotis ipsilon, представлены в таблице ниже Выделенный Наличие кристалла 5штамм Bacillus эндотоксина АВ6 + АВ53 АВ88 + АВ195 АВ211 АВ217 АВ272 АВ279 АВ289 + АВ292 + АВ294 АВЗОО АВ359 Процент гибели 100 80 100 60 70 83 80 70 100 80 100 80 100 Выделенные штаммы АВ289, АВ294 и АВ359 были помещены в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Nothern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peona II 61604, USA, и получили регистрационные номера NRRL B-21227, NRRL B-21229 и NRRL B21226 соответственно Выделенные штаммы Bacillus, производящие белки, обладающие инсектицидной активностью в отношении Diabrotica virgifera virgifera, приведены в таблице ниже Выделенный Наличие кристалла 5штамм Bacillus эндотоксина АВ52 Процент гибели 50 43 AB59 AB68 AB78 AB122 AB218 AB256 52579 + 71 60 100 57 64 64 Выделенные штаммы АВ59 и АВ256 были помещены в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Nothern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peona Illinois 61604, USA, и получили регистрационные номера NRRL B-21228 и NRRL B-21230 соответственно Все публикации и заявки на патент, отмеченные в настоящем описании изобретения, являются показателем уровня техники для специалистов, компетентных в данной области техники, для которых предназначено данное изобретение Все публикации и заявки на патент включены в настоящее описание в качестве ссылок в той степени, в какой каждая отдельная публикация или описание патента, взятые конкретно и по отдельности, должны были бы быть включены в качестве ссылки В Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Nothern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peona Illinois 61604, USA были помещены следующие штаммы Регистрационный 1 E coll PL2 № NRRL B-21221 Регистрационный 2 E coll pCIB 6022 № NRRL B-21222 • с і ,-ю с т о э 3 E col, рСІВ 6023 4 Bacillus thurmgiensis HD73-78VIP Регистрационный № NRRL B-21223 Регистрационный № NRRL B-21224 5 Bacillus thurmgiensis AB88 6 Bacillus AB359 7 Bacillus AB289 thurmgiensis Регистрационный № NRRL B-21226 thurmgiensis Регистрационный № NRRL B-21227 Регистрационный 8 Bacillus sp AB59 № NRRL B-21228 Регистрационный 9 Bacillus sp AB294 № NRRL B-21229 Регистрационный 10 Bacillus sp AB256 № NRRL B-21230 Регистрационный 11 Ecoh P5-4 № NRRL B-21059 12 Ecoh P3-12 Регистрационный № NRRL B-21061 13 Bacillus cereusAB78 Регистрационный № NRRL B-21058 14 Bacillus thur,ng,ens,sAB6 NaNRRL В^ІОбО Хотя вышеприведенное изобретение описано достаточно детально с помощью иллюстраций и примеров с целью облегчения понимания, очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть осуществлены на практике в рамках прилагаемых пунктов формулы изобретения СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 44 (1) Общая информация (і) Заявитель (A) Название CIBA-GEIGYAG (B) Улица Klybeckstrasse 141 (C) Город Basle (E) Страна Switzerland (F) Почтовый индекс, СН=4002 (G) Телефон (061)6961111 (Н) Телефакс (061)6967976 (A) Имя Gregory W Warren (B) Улица 324 Bond Lake Drive (C) Город Сагу (D) Штат NC (E) Страна USA (F) Почтовый индекс 27513 (A) Имя Michael G Koziel (B) Улица 509 Carolyn Court (C) Город Сагу (D) Штат NC (E) Страна USA (F) Почтовый индекс 27511 (A) Имя Martha A Mulhns (B) Улица 104 Countrybrook Lane (C) Город Youngsville (D) Штат NC (E) Страна USA (F) Почтовый индекс ZIP 27596 (A) Имя Gordon J Nye (B) Улица 1001 BrayCourt (C) Город Apex (D) Штат NC (E) Страна USA (F) Почтовый индекс 27502 (A) Имя Brian Carr (B) Улица 110 D Lady's Slipper Ct (C) Город Raleigh (D) Штат NC (E) Страна USA (F) Почтовый индекс 27606 (A) Имя Nalmi Manaj Desai (B) Улица 107 Silverwood Lane (C) Город Сагу (D) Штат NC (E) Страна USA (F) Почтовый индекс 27511 (A) Имя N Knsty Kostichka (B) Улица 5017Wineberry Dr (C) Город Durham (D) Штат NC (E) Страна USA (F) Почтовый индекс 27713 (м) Название изобретения Новые пестицидные белки и штаммы (ш) Количество последовательностей 18 (iv) Форма представления для компьютера (A) Тип носителя, гибкий диск (B) Компьютер IBM PC Совместимый (C) Операционная система PC-DOS/MS-DOS (D) Математическое обеспечение Patentm Release #1 0, Version #1 25 (ЕРО) (vi) Сведения о предыдущих заявках (A) Номер заявки, США 08/037057 (B) Дата подачи 25 марта 1993 (2) Информация для последовательности SEQ ID NO 1 45 ATCGA'ACAA TGTTGtTTTA CTOGACCGG TAGTCTCTGT AATTTGTTTA ATGCTATATT Й0 CTTTACTTTG АТАСАТТЇТА ATASCCATTT СААССТТЛТС AGTATGTTTT TGTGGTCTTC 120 с т с с т т т т т ? T A T C T C T T T C T C C A C G A G C T T A A T T C T G C A C T A G C T G C G T A S A C T T G C C A T TA A T C C T G T T C A T T C G A A A T T T G G T A C G T G A f i S A A T T T C T C G C T A A T A A C C C A T A G C A T г 2 е 4 о 0 TAGAGGTATC AATGTTGTCA TGAATAGAAA ТААЛАТСТДС ACCTAGCTCT TTGAATTTTT 300 CACTTAAC1C AATTAGGTGT TTTGTAGAGC GAGAAATTCG ATCAAGTTTG TAAACAACTA 3S0 tcraxcecc TTTACGTAAT ACTTTTSGCA ACTCTTCGAG TTGAGGSCGC TCTTTTTTTA 420 TTCCTCTTAT TTTCTCCTGA TATAGCCTTT CTACACCATA TTGTTGCAAA GCATCTA1TT 480 GCAWCGAG ДЇЇТОТТСТ TCTGTGCTS* C C R C T T АССМАААЇЄ М А Ї Ї Ш Ї Ї A G S AF Ш САСТТССЇАТ CTAAATATAT СТАТТААААТ AGCACCAAAA АСЄТТАТТАА АТТЬАААТАА 600 GGFCACTTTGT TTTTGGATAT GGATTTTGGT ACTCAATATG GATGAGTTTT ТААСЄСТТТТ 6Є0 GTTAAAAAAC RAACAAGTGC CATAAACGGT CGTTTTTGGG ATGACATAAT AAATAATCTG 720 TTTSATTAAC CTAACCTTGT ATCCTTACAG CCCAGTTTTA ТТТЄТЙСТТС AACTSACTGA 730 ATATGAAAAC AACATGAAGG ТТТСАТААЛА TTTATATATT TTCCATAACG GATGCTCTAT BSD CTTTAGGTTA TAGTTAAATT ATAAGAAAAA 46 52579 (і) Хараісгеристики последовательности (A) Длина 6106 пар оснований (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Количество цепей одноцепочная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (vi) Первоначальный источник (A) Организм Bacillus cereus (B) Штамм АВ78 (C) Конкретный изолят NRRL В-21058 (їх) Признаки (A) Название/ключ CDC (B) Положение 1082 1810 (D) Прочая информация /продукт^ "ВИБ-2" /метка = ORF-1 (їх) Признаки (A) Название/ключ CDC (B) Положение 1925 2470 (D) Прочая информация /продукт» "ВИБ-2" /метка = ORF-2 (xi) Описание последовательности SEQ Ю N0 1 AACAAACGGA GGGAGTGAAA ААААЄСАТСТ 900 TCTCTATMT TTTACAGGCT CTTTAATAAG AAGGGGGGAG ATTAGATAAT AAATATGAAT 960 ATCTATCTAT AASTGTTTSC ТТСТАСЙАТА ACTTATCTAS CTTTCATATA CAACAACAAA 1020 ACAGACTAUA TCCAGATTGT ATATTCATTT TCAGTTGTTC COTATAAAA TAATTTCATA A AIS AAA AGA ATG GAG GGA AAG TTG TTT ATG GTG ГСА SAA ААД ТТЛ fee Lys Arg Mat Glu Gly Lys Leu Phe Met IOSO 1126 ACC TAT AAS AAT GTC GAA CCG АСА АСА ATT GGA TTT AAT AAA TCT TTA Thr Tyr Lvs Asn Vsl Glu Pio T>it Thr lie Gly Phe Asn Lys Sec L«u 45 150 I5S А А SM §§? m С. ^s m ш ?ет § Т e a m% §sn еш ТІЇ Ш т. Й Tiir Glti Gly Asrs TftS lie A£n Sec Asp Ala Met Ala Gin Рїіе Lys Glu 160 165 170 175 ISOS CAA TTT TTA GAT AGG GAT ATT AAG TTT GAT AGT TAT СТА GAT ACG CAT Gin Phe Lou Asp Acg Asp lie Lys Ptie Asp £sr Tyt Leu Asp The His 180 185 190 1654 TTA ACT GCT CAA CAS GTT TCC AGT AAA GAA AGA GIT ATT 3TG ЛАС GTT Leu Thr Ala Gin G W Val Sec Sec bys Glu Arg Val lie Leu Lys Val Hi Z00 205 1702 ACG GTT CCG AGT GGS AAA GGT TCT ACT ACT CCA АСА AAA GCA GGT GTC ЇПе Val Pro Set Gli'L V S sl2 E e c ^ r ? h t P r 0 T t l t ь ї 3й і а ir Asp Sec Glu H e Lys Gin H e Tyr Ser AtCf Tyc Gly H e Lys 545 550 555 560 1 m ЄАА 8АЇ G a И Є til ATI СА-Ї AAA AAA SGT GGG ATT CAT TAT GGT Leu CluftspGly H e Leu H e Asp Lys Lys Gly Gly H e His Tyr Gly 565 570 575 G M TTT ATT AAT GAA GCT AGT TTT AAT АГГ GAA CCA TTG CCA AAT TAT Glu Phe lie AST Glu Ala Ser Phe Asn H e Glu Pro Leu Pro Asn Tyr 560 S85 590 CTG ACC AAA TIT СУ1 GTT ACT TAT AGT AGT GAG TTA GGA CCA AAC GTG Val Tht Lys Tyc Glu Val Tiir Туї Sat Eer Glu Leu Gly Pro Asn Val 595 600 60S AGT GAC АСА СЇТ GAA AGT GA1 AAA ATT TAC AAG GAT GGG АСА ATT AAA Ser Asp Thr Leu Clu Ser Asp Lys H e Tyr Lys Asp Gly Thr H e Lys 610 61S «0 TTT GAT TTT ACC АЛА ЇАЇ AGT M A BAT GAS C M GGA TTA TTT TAT GAC Phe Asp Phe Tftr Lys Tyr Ser Lys Asn Glu Gin Gly Leu Pha Tyr Asp 625 630 635 640 AGT GGA TTA M T TGG GAC TTT A M ATT AAT GCT ATT ACT TAT GAT GGT Ser Gly Leu Asn тер Asp phe Lys H e А Е П Ala lie Thr Tyr Asp Gly 645 650 655 A M GAG ATG AAT GTT TTT CAT AGA TAT AAT AAA TAG Lys Glu Hat Asn val pha His Arg Tyr Asn Lys 6SS 665 (2) Информация SEQ ID NO 7 для последовательности 55 56 52579 Thr Ser Pne Val Leu Asn Asn asp Thr lie Ala Thr H e The Ala Lys 195 200 2Q5 Leu Glu Asp Gly H e len 565 Ear Asn Ser Thr Ala Leu Asn їіє Ser Pro Gly Glu Set Tyr Pro Lys 210 215 220 Glu Phe H e Asn Glu Ala Ser Phe Asn H e Glu Pro Leu P r o Asn 560 585 590 Tyr Lys Gly Gin Asn Gly H e Ala H e The Sec Met Asp Asp Phe Asn Ser 225 230 23S 240 Val 1hz Lys Tyr Glu Val Tftr Tyr Ser Ser Glu Leu Gly P r o Asn 595 600 605 Val His Pro H e Thr Leu Asn Lys Lys Gin Val Asp Asn Leu Leu Asn Asn 245 250 255 Ser Asp Thr Leu Glu Ser Азр Lys H e Tyr Lys Asp Gly Tnr H e 610 615 620 Lys Lys Asp 640 Pro Met Met Leu Glu The Asa 260 Lys Asp Tht His Gly Asn l i e 275 He Gin Gin 290 Glu Arg Val 305 He Lya Ala Glu Ala Gin Tftr Asp Gly Val 2£5 Val Thr Gly Gly 2S0 Lys 3hr Ala 295 Lys Arg Val 310 lyr Lys 270 Ue Phe Asp Phe Thr Lys Tyr Ser Lys Asn Glu Gin Gly Leu Phe Tyr 625 630 635 Glu Trp Asn Gly 285 Val Ser Gly l e u ?$n Trp Asp Phe Lys H e Asn Ala H e Thr Tyr Asp Gly 645 650 655 Lys GlU Met Asn Val PHe His Arg Tyr Asn 660 665 Sec He H e Val 300 Asp Asp Gly Ala Ala Lys 315 Asp Tyr Glu Asn Pro 320 Glu Asp Lys ІЛҐ Pro Ser Leu TEir Leu Lys Asp Ala Leu Lys Leu Sec 32S 330 335 Tyr P r o Asp Glu H e Lys Glu H e Glu Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys 340 345 3S0 Asn l y s Pro H e l y r Glu Ser Ser Val Me£ їі»ї Tyr Leu Asp Gla Asn The 355 36Q 36S Ala Lys Glu v a l I h r Lys Gin l e u Asn Asp Thr Thr Gly Lys Phe Lys 370 375 380 Asp Val Ser His Leu Tyr ftsp Val Lys Leu Thr P r o Lys Met Asn ЗЄ5 390 395 Val 400 Thr H e Lys Leu Ser H e Leu t y r Asp Asn Ala Glu S e r Asn Asp Asn 405 410 415 See H e Sly Lys ! r p Thr Asn B i r Asn H e Val «О «5 l i e Asp Lys Lys Gly Gly H e His Tyr Gly 570 575 Ser GJy Gly Asn «о Aen Gly Lys Lys Gin Tyr Ser Ser Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr Leu 435 440 445 Asn Thr Asp Ala Gin Glu Lys Leu Asn Lys Asn Arg Asp Tyr Tyr He 450 455 460 Ser Leu !yr Het Lys Ser < 1 Lys Asn Thr Gin Cys Glu He Thr He 3u 465 410 475 430 Asp Giy 5І1Д H e Tyr Pro H e Thr The Lys Thr Val Asn Val Asn Lys 485 490 495 Asp Asn Tyc Lys Arg Leu Авр Н е H e Ala His Asn H e Lys Ser 500 505 510 Asn Lys (2) Инфомация для последовательности SEQ ID NO 8 (і) Хараісгеристика последовательности (A) Длина 16 аминокислот (B) Тип аминокислота (C) Количество цепей одноцепочная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы пептид (м) Гипотетичность нет (v) Тип фрагмента N-окончание (vi) Первоначальный источник (A) Организм Bacillus cereus (B) Штамм АВ78 (C) Конкретный изолят NRRL В-21058 (iv) Признаки (A) Название/Ключ Пептид (B) Положение 1, ,16 (D) Прочая информация /отметить = "Nконцевая последовательность белка, очищенного из штамма АВ78" (xi) Описание последовательности SEQ ID NO 8 Pro H e Ser Ser Leu His H e Lys T h t &sn Asp Glu H e K i r Leu Phe 515 520 525 Trp Asp Asp H e Ser H e Thr Asp Val Ala Ser H e Lys Pro Glu Asn 530 535 S40 Leu Thr Asp Sar Glu H e Lys Gin H e Tyr Ser Arg Tyr Gly H e 545 550 555 Lys 1 Arg Glu He Asp 5 Glu Asp Lys 560 Thr (2) Информация для SEQ ID NO 9 (1) Характеристика последовательности (A) Длина 21 основная пара (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Количество цепей одноцепочная (D) Топология линейная (и) Тип молекулы ДНК (геномная) (ш) Гипотетичность нет (ш) Антисмысловая нет (їх) Признаки (A) Название/Ключ признаки_отсутствуют (B) Положение 1 21 (D) Прочая информация /отметить = "образец олигонуклеотида, основанный на аминокислотах от 3 до 9 в SEQ ID NO 8, с использованием кодона Bacillus thurmgiensis" (xi) Описание последовательности SEQ ID NO 9 GAAATTGATGAAGATACNGA T (2) Информация для последовательности SEQ Asp Thr 10 Asx Gly Asp Ser He 15 Pro ID NO 10 (i) Характеристика последовательности (A) Длина 14 аминокислот (B) Тип аминокислота (C) Количество цепей одноцепочная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы пептид (ш) Гипотетичность нет (v) Тип фрагмента N-окончание (vi) Первоначальный источник (A) Организм, Bacillus cereus (B) Штамм АВ78 (їх) Признаки (A) Название/Ключ Пептид (B) Положение 1 14 (D) Прочая информация /отметить = "Nконцевая аминокислотная последовательность белка, известная как анионообменная фракция 23 (меньшая)" (xi) Описание последовательности SEQ ID NO 10 Xaa Glu Pro Phe 1 Val 5 Ser Ala Xaa Glu Туг Glu Asn 5 Val Asn Lys Asn Asn 5 Thr Lys Pro Leu Ser Glu Asn 5 Xaa Xaa Xaa Thr Gly Leu Val 10 Ser Ala Xaa Pro Thr 10 Arg Ala Leu Pro (В) Штамм АВ88 (їх) Признаки (A) Название/Ключ Пептид (B) Положение 1 15 (D) Прочая информация /отметить» "Nконцевая аминокислотная последовательность ВИБ с 35 кДа, активного в отношении Agrotis ipsilon" (xi) Описание последовательности SEQ ID NO 13 Lys (2) Информация для последовательности SEQ ID NO 14 (i) Характеристика последовательности (A) Длина 9 аминокислот (B) Тип аминокислота (C) Количество цепей одноцепочная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы пептид (ш) Гипотетичность нет (v) Тип фрагмента N-концевой Asp Met Asn Asn 1 (2) Информация для последовательности SEQ ID NO 15 (i) Характеристика последовательности (A) Длина 9 аминокислот (B) Тип аминокислота Phe (A) Организм Bacillus thunngiensis (B) Штамм АВ88 (їх) Признаки (A) Название/Ключ Пептид (B) Положение 1 14 (D) Прочая информация /отметить - "Nконцевая последовательность ВИБ с 80кДа, активного в отношении Agrotis ipsilon" (xi) Описание последовательности SEQ ID NO 12 (2) Информация для последовательности SEQ ID NO 13 (i) Характеристика последовательности (A) Длина 15 аминокислот (B) Тип аминокислота (C) Количество цепей одноцепочная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы пептид (ш) Гипотетичность нет (v) Тип фрагмента N-концевой (vi) Первоначальный источник (А) Организм Bacillus thunngiensis Ala 1 Gin (A) Организм Bacillus cereus (B) Штамм АВ88 (їх) Признаки (A) Название/Ключ Пептид (B) Положение 1 13 (D) Прочая информация /отметить = "Nконцевая аминокислотная последовательность белка, известная как анионообменная фракция 23 (большая)" (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 11 Glu (2) Информация для последовательности SEQ ID NO 12 (i) Характеристика последовательности (A) Длина 14 аминокислот (B) Тип аминокислота (C) Количество цепей одноцепочная (D) Топологія линейная (м) Тип молекулы пептид (ш) Гипотетичность нет (v) Тип фрагмента, N-КОНЦЕВОЙ (vi) Первоначальный источник Met 1 Xaa 10 (2) Информация для последовательности SEQ ID NO 11 (і) Хараісгеристика последовательности (A) Длина 13 аминокислот (B) Тип аминокислота (C) Количество цепей одноцепочная (D) Топология линейная (и) Тип молекулы пептид (ш) Гипотетичность нет (v) Тип фрагмента N- концевой (vi) Первоначальный источник Xaa 1 Xaa Asp Gly 10 Gly Tyr lie Val Pro 15 (vi) Первоначальный источник (А) Организм Bacillus thunngiensis (їх) Признаки (A) Название/Ключ Пептид (B) Положение 1 9 (D) Прочая информация /отметить» "Nконцевая последовательность дельта-эндотоксина со 130 кДа" (xi) Описание последовательности SEQ ID NO 14 Pro 5 Asn lie Asn (C) количество цепей одноцепочная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы пептид (ш) Гипотетичность нет (v) Тип фрагмента N-концевой Glu 59 (їх) Признаки (A) Название/Кпюч Пептид (B) Положение 1„ 9 (D) Прочая информация Met 1 Asp 5 2 5 7 9 /отметить» Asn "N Asn Pro 5 (2) Информация для последовательности SEQ IDNO 16 (і) Характеристика последовательности (A) Длина 11 аминокислот (B) Тип аминокислота (C) Количество цепей одноцепочная (D) Топология, линейная (v) Тип молекулы пептид (ш) Гипотетичность нет (v) Тип фрагмента N-концевой Met 1 Asp Val Leu Asn 5 (2) Информация для последовательности SEQ IDNO 17 (і) Характеристики последовательности (A) Длина 2655 основных пар (B) Тип аминокислота (C) Количество цепей одноцепочная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (ш) Гипотетичность нет (ш) Антисмысловая нет (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 17 TGAAGAAGAA GCTGGCCAGC GIGGIGACC? GCACCCIGCT 60 G CCCT GCCAG TTCCTGAACG GCAACGTCAA CGCCGTGTAC GCCGACAGCA AGACCAACCA GTA CC ACGAC 120 ACCAGCAGSA GGAGATGGAC CGCAAGG3CC TGCrGGGCTft CATCA TCTAG ! 8 0 TCAGCAACCT G A C C A T O T C GCCCCCAO3C GTGACSGCAC CT ACA CGTTC 240 G CA GC GAG AI GCGA A CCGCCSACAA GCTGCTGGAC SAGAAGCAGC AGGAGTACCA AC CG f TGATCCAGAG CIAGGAGACC GGCGACITCA CCTTCAACCT G CAG A GGA G C 360 T GT G C G AC G C TCATCGAGAT CAACGGCAAG ATCATCAGCA RCAAGGGCAA GAA C GGA A G G 420 GG A G C A CG C A CCCATC**GA TCGAGTACCA GGGCC A C AAC 480 GG T C C TGGSGftAGGG CAAGCTGGTG T GG A C . A G T A C TCGACAGCAA CACCTTCAAG GAGCTGAAGC 1TIICAAS&T C AA CA A TC A A GCGCG 540 W C G C C AGCAGGTCCA GCAGGACGAG CTGCGCAACC CCGAGTTCAA CAAGA CA CC AGAGG 600 ftGCCAGGPGT GCCCAGCAAG ATCAACCTGT ТСЛСССАССА GTAGG TCCTGGCCAA AGACC 660 G AC AGAGGACACCGA CflCCGftCGGC GACAGCATCC CCGACCTGTG GAGGA 3 TGC G . GGAAC GC-СТДСАССА TCCAGAACCG CATCGCCETG AAGTGGGSCG ACAGCCIGGC T C G G A A GC 180 GA ТЙСАССАЛЄЇ TCGTGAGCftA CCCCCTGGAG AGCCACACCG TGGGCGACCC CAAC A TCCGC 840 TPCGAGAAGG CCGCCCGCCA CCTGCACCTG BGCAACGCCA ASGAGACCTT CACCT ACCCG 900 GTGGCCGCCT TCCCCAGCGT GRACGTCAGG ATGGAGAAGG TGAICCTfiuG C C M G 960 CC C G t f AACCTGAGCA ACASCGTGGA QSGCCACTCG AGCSCCAACT GGAGCTftCAC C C C A A A GG 1 0 2 0 AC GGCGCCAGCG IGGAGGCCC-G CATCGGTCCC MGGGCATCA бСГЮЗССет G C T A A GGA 1080 G C GCGAGACCGT GftCCCAGGAG TACCAGCACA TGGGGCACCA бСАССЕЙСйА CCA CA ACGCG 1 1 4 0 CCAGCGCCGG CTACCTGAAC TIC«CACCG GCCAACGTGC GCTACASCM C T G C C GGGA C ігоо ACGACGTGSA GCCCACCACC GGCGCCATCT AGCTTCGTGC TGASCftACGA CCA GC AC1 C 3260 C CCAA5TCGAA TTCCftCCGCC ACCATCACCG CTGBACATCA GCCCCGGCGA GGTCC A CACC 1320 AAGAAGGGCC ACCCTGAACA SACCAGACCG GAGTGGAACG SGCGSGCGCQ ACCCCCAGCC ATCGftGGOCC AGAACGGGAT CGCCAICACC AGAAGCAGGT GGACSACCTG ACGGCGTCTA CAAGATCAAG GCGTGAICCA GGAGAICAAG TGGCCGAGAA GCGCGTGGCC TGACCCTG?J GGftCGCCCTS TGCTGTACTA CAAGAACAAG 6 0 концевая последовательность дельта эндотоксина с 80 кДа" (xi) Описание последовцтельности SEQ Ю N0 15 Asn lie Asn Glu (vi) Первоначальный источник (А) Организм Bacillus thunngiensis (їх) Признаки (A) Название/Ключ Пептид (B) Положение 1 11 (D) Прочая информация /отметить = "Nконцевая последовательность дельтаэндотоксина с 60 кДа" (xi) Описание последовательности SEQ ID N0 16 Ser Gly hCf-ccacc'fJ: Arg Thr Thr 10 iCSiCiCCAC CGGCAAGTtC C-CAGGIGACC lie 1300 ОССАССТ6ГА CGACGTGAnG CtGACCCCCA I860 ЇСТЛССАСА* CGCCGAGAGC AACGACMJTA GCATCGGCM OTGGSCCAAC 1920 АССАЛСАТС5 ТЕЙЗСвГСЙЗ CASCAACGGC МСААССАЙЇ SCSGCSGCAA CAACCCCGAC 1980 «гсАлсстйА cGAtacccfiG GACAAGCTGS АСл&ЗААССЙ СОАСГЙСТАС 2640 AIC^CCCTGT CGASAAGXSC ACCOGTGCG A3ATCACCAT CG«CGGCGA3 Ї100 А^ЛТЛССССА 1САССАССМ GACD3TGAAC GTSAA ДСАДСЇ ДТСАТС6ССС ACASCA1CAA GATCAAGCCC TGTTCTGGGA СаВСАЇЙТСй 2160 TGCACATCM GSCCAAC5AC ICGCCAGCAT САЙООЖЙАО AACCTGACCG ACiSCGSsCW CAAGCACAtA TBCAG^CGCT ДССССАЇСАА C C l ^ A G a A C GGCATCCIGA 7CGACAAGAA GGGCGGCATC CSCTACGGCG AGTTCATCAA CGAGGCCAGC 2340 24U0 ЇГСААСЧІСС "IGCCCCTGCA GAACIACGTG AGGMACCTA CAGCAGCGAG 2460 C1GGGCCCCA ACGTGAGCGA CACCCTCGW3 TITACAAGGA CGGCACCATC 2520 AACTTCGACT TCACCAAG"A CAGCAAGAAC GAGCAGGGCC TGTTCTACGA CAGCGGCCTG 25Э0 AiCIGGGACi: TCAAGATCAA CGCCATCACC TACGACGGCA AGGAGATGAA C G T G T K C R C 2640 C CA A C A T G G T C A A G& 2655 (2) Информация для последовательности SEQIDNO 18 (і) Характеристика последовательности (A) Длина 2010 основных пар (B) Тип аминокислота (C) Количество цепей одноцепочная (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (ш) Гипотетичность нет (ш) Антисмысловая нет (xi) Описание последовательности SEQ ID NO 18 G ACAG S C C A A CAGGA AC AAC AGCAA C CCGC GTCT A GGGGI GCBGC CGCCG CGGCG WCC A 60 C TG A G A AC GT CC A CG AGGAG C3GA T GAGCG 120 I C GG GAG CA S CI A AGCTG O AGG GCAAC G C T C GTGA A G CAA C A I GG S CACC G A A CA CCGGG I O I CA C G GTCC A G T GACCC t GGGC ACTGC S G C t GCCTC CGCC A G G CGC C C ACG ACGGA CCAGA ACCAA C AI G M GC C GGCT G CT A CA GCAGG 240 A АССЇТСААСС CCCTGGTGGC CGCCTTCCCC AGCGXGAACG TGRGCATGGA GAAGGTGATC 300 CTGAGCCCCA ACGAGAACGT GAGCAACAGC GTGGAGAGCC ftCTCGAGCAC CAACTGGAGC 360 SGCRTGGACG SCTICAACAG ССАССССАТС 1330 TACACCAACA CCGAGGGCGC CAaGTGGAG GCCGGCATCG GTCCCAAGGS CATCAGCTTC 420 CTGAACAACA AGCCCAIGAT SGTGGAGACC 1440 GGCGTGILGCG ГСААСТАССА GCACAGCGAG ACCGTGGCCC AGGAGTGGGG СДССАбСАСС 4В0 GACACCCACG GCAACSICGT GACCGCCGGC 1500 GGCAACACCft GCCAGTTCAA CACCGCCAGC GCCGGCTJVCC TGAACGCCAA CGTGCGCTAC 540 GCCaAGftCCG CCAGCAICAT CGTCGACGAC 1560 1620 AACAACGiGs eoo AACGACdCCA TCGCCACCAT CACCGCCAAG TCGAATTCCA CCGCCCTGAA CATGAGCCCC 660 J66O 1140 GGCGAGBGCT ACCCCAAGAA GGGCCAGAAC GGCATCGCCA TCACCAGCAT GGACGACTTC 720 AACAGCCACC CCATCACCCT GAACAAGAAG CJIGGTGGACA ACCTGCTGAA CAACAAGCGC 780 GCCMGGACT aCGAGAACCC CGAGGACAAG AAGCTGAGCT ACCCCGACGS GATCAAGGAG CCCATCTACG AGAGCAGCGT GATGACGTAT OCACCGGCGC C A T C T K ; G A G GTGAAGCCCA CCACCAGCTT CGTGCK;AAC ДївАЇССЧЗС АЄАССААССА GACCGACGGC GTCIuCAAGA TCAAGGACAC CCACGGCXAC 840 ATCGTGACCG GCGGCGAGTG GAACGGCGTG ДТССАССЙЄА ICAAGGCCAA GACCGCCAGC 900