Спосіб морфо-хіміко-аналітичного дослідження проникнення хімічних речовин крізь шкіру

1. Спосіб морфо-хіміко-аналітичного дослідження проникнення хімічних речовин крізь шкіру, що складається з нетравматичного пошарового розподілу епідермісу за допомогою 3 26674 шкіру і потрапляння її у кров'яне русло, ємність депо у шкірі, морфологічні структури епідермісу, які є лімітуючими швидкість утвореннями і т. і. Особливе значення має запропонований підхід у методиці визначення ризику забруднення шкіри хімічною речовиною для здоров'я шляхом реконструювання поглиненої дози хімічної речовини і розрахунку ступеню ризику та прийняття рішень по управлінню ризиком. Ідентифікація клітин та шару епідермісу відбувається за звичайною процедурою світлової мікроскопії, як за методикою вітальної окраски, так і за класичною методикою фіксації, фарбування гематоксилін-еозином та азур-П-еозином, заливки в блоки, нарізки та перегляду зразків. При цьому звертають увагу на ступінь диференціювання ядра клітини. Належність клітини до того чи іншого шару епідермісу визначається за станом такого диференціювання: без'ядерних клітин рогового шару (поверхневий шар епідермісу) до зрілих клітин з розвиненим ядром (базальний і шипуватий шари). Визначення кількості речовини, що проникла у шкіру, відбувається за будь-яким аналітичним методом, який підходить до даної речовини. Науково практична значимість запропонованого способу полягає у безкровному і оперативному виявленні факту забруднення шкіри хімічною речовиною та проникнення її всередину шкіри по структурним утворенням епідермісу; при цьому необхідно підкреслити, що заявлений підхід дає можливість визначити безпосередньо поглинену дозу хімічної речовини, не вдаючись до складних процедур аналізу речовини у внутрішніх середовищах організму. Заявлений спосіб здійснюється у два етапи: відділення фрагментів епідермісу і гістологічна ідентифікація виділеного шару; хіміко-аналітичне визначення вмісту хімічної речовини у послідовно виділених фрагментах епідермісу. Відділення фрагментів епідермісу і гістологічна ідентифікація виділеного шару відбувається шляхом послідовного наклеювання на одне місце поверхні шкіри площею 3x3 см лейкопластиру розміром 3x3 см з наступним його зняттям разом із залишками епідермісу. Зазвичай, лабораторні тварини певного віку (маси тіла) мають однакову стр уктуру епідермісу; тому в однакових регіональних областях шкіри кількість послідовних відокремлень липкої стрічки за рахунок певного шару епідермісу завжди однакова. У людини липку стрічку попередньо накладають на бажану область шкіри (тильну поверхню долоні, передпліччя та інше), де буде проводитись дослідження проникнення хімічної речовини. Відокремлення фрагментів епідермісу від липкої стрічки проводиться зануренням її в гексан, гептан або бензин на 24 години до повного розчинення адгезивного шару; шматочки епідермісу вільно плавають у середовищі розчинника. Дані шматочки вміщують на предметне скло, підсушують і фарбують крапельним методом гематоксилін-еозином та азур-II-еозином для проведення гістологічного дослідження. Відділення фрагментів епідермісу з 4 використанням скотчу (розмір 1,5x2 см) відбувається у той же спосіб, що і при використанні лейкопластиру. Після пошарового зняття фрагментів епідермісу шматочки скотчу приліплюють до знежиреного предметного скла таким чином, щоб знятий фрагмент епідермісу був на поверхні скотчу. Наклеєні на скло шматочки епідермісу фарбують у той же спосіб, як і при використанні лейкопластиру. Після змиву фарби препарат помішують у бальзам; при цьому бальзам необхідно капнути і під скотч для фіксації його до скла. Морфологічна ідентифікація фрагментів і окремих клітин епідермісу здійснюється за ознаками ступеню розвитку ядра клітин епідермісу. На підставі цього складають морфологічний профіль епідермісу, пов'язаний з порядковим номером пошарового відокремлення епідермісу. Хіміко-аналітичне визначення вмісту хімічної речовини у послідовно виділених фрагментах епідермісу проводиться з використанням прийнятого методу хімічного аналізу визначення вмісту хімічної речовини у воді або відповідному розчиннику. Для цього шматочки липкої стрічки (лейкопластирю або скотчу) з фрагментами епідермісу вміщують на 24 години у розчинник, в якому надалі буде проведено аналіз речовини. Аналіз речовини і розрахунки її вмісту в аналізованому шарі проводять за загальною схемою, яка притаманна даному методу аналізу. Суть корисної моделі пояснюється такими прикладами. Приклад 1. В дослідах на щура х віком 4 місяці з масою тіла 250-260 г повне видалення епідермісу співпадало з 20 аплікаціями лейкопластиру. При мікроскопічному дослідженні встановлено, що роговий шар визначався після 1-4 аплікації; зернистий - 5-12, шиловидний - 13-17; базальний 8-20 аплікації. Можливість хімічного аналізу окремих фрагментів епідермальної тканини випробувалися у дослідах з нашкірною аплікацією аскорбінової кислоти. При цьому поряд з вирішенням методичної хіміко-аналітичної задачі визначали реальні характеристики "шкіряного депо" для екзогенної аскорбінової кислоти при нашкірній аплікації 15%-го водного розчину. Розчин наносили на ділянку шкіри спинки тварини площею 3х3 см (шерсть із ділянки із неї видалялася ножицями) із розрахунку 0,01 мл/см 2 (контрольним тваринам наносили на шкіру дистильовану воду). Через 1 годину поверхню промивали водою, висушували ватним тампоном та проводили stripping, як вказувалося вище. Лейкопластир зі знятим епітелієм вкладали у бокс та заливали дистильованою водою (1 мл) на 24 години. Визначення аскорбінової кислоти у тканині проводили за методом [3]. Надходження та розподіл екзогенної аскорбінової кислоти у шарах епідермісу надійно визначається за допомогою методу хімічного аналізу (табл.1). 5 26674 6 Кількість аскорбінової кислоти (мкг/см 2) у послідовно відокремлених фрагментах епідермісу щурів після нашкірної аплікації 15% водного розчину (експозиція 1 година) Вміст аскорбінової кислоти у поверхневих шарах епідермісу лю Кількість аскорбінової кислоти аплікацій 0,5% водного розчину (мкг (мкг/см 2) Порядковий номер Структурний шар Приріст аплікацій чоловіки епідермісу контроль концентрацій лейкопластиру Шари Через 7 діб Через 14 діб Після дослідшкіри Після 20 після після аплікацій апліка 1 роговий 136,1 + 13,3 31,6 + 3,3 аплікацій 104,5 аплікацій 2 121,4+11,91 25,2 ±5,1 44,4 + 6,0 7,1±0,6 96,2 1,5±0,2 48,4 ± 3 113,4+14,73 30,5 ±3,2 82,9 37,8 ± 2,07 8,1±1,5 0,3± 0,04 46,6 ± 4 97,1 + 12,85 30,3 +±1,7 66,8 37,8 1,3 5,1±1Д 0 42,2 ± 5 зернистий 79,1 + 8,8 7 28,8 ±1,8 50,3 39,0 + 5,6 4,4±0,6 0 43,2 ± 6-7 51,5 ±9,5 9 24,0 ++2,5 27,5 37,6 6,6 4,1±0,2 0 46,4 ± 8-9 40,5 + 18,9 21,5 ±0,1 11 36,6 ±6,2 - 19,0 38,4±_ 10-11 43,1 + 14,1 24,0 +±2,5 13 34,8 7,2 - 17,1 34,4 ± 12-13 шипуватий 43,1 + 14,1 20,2 ±1,3 15 31,0 ±6,6 - 23,0 34,4 ± 14-15 40,7+15,517 17,2 ±2,1 22,2 ±10,6 - 23,5 31,2 ± 16-17 38,2 ±13,3 14,0 ±1,0 19 16,6 ±9,1 - 24,2 21,8 ± 18-19 базальний 38,2 ±13,1 14,0 ±1,0 24,2 Приклад 3. Концентраційний профіль пенетранту у шкірі У дослідах in vivo на добре поголену ділянку відповідає теоретичній уяві про проникнення як шкіри щура (3x3 см) наносили 1% розчину динамічний процес, який проходить у напрямку біхромату калію із розрахунку 0,01 мл/см . Через 1 градієнту концентрації та з локалізацією годину поверхню шкіри промивали водою, максимуму у вер хніх шарах епідермісу - роговому підсушували та відділяли фрагменти епідермісу шарі. скотчем розміром 1,5x2 см. Вміст біхромату калію Приклад 2. в шара х шкіри визначали методом атомноДосліди на людині проведені на авторахадсорбційної спектроскопії. розробниках корисної моделі. При цьому 0,5% Результати досліджень зведені у таблиці 3. розчин аскорбінової кислоти наносили на шкіру Представлені дані (табл. 3) доводять про кистей рук вмивальними рухами з орієнтовною достатньо швидке надходження хрому у шкіру та нормою витрати 0,01 мл/см поверхні шкіри його рівномірне поширення на всій глибині (приблизно 5 мл на піддослідного). Упродовж 2-3 аналізованих шарів. хвилин оброблена поверхня висушувалась Таким чином, наведені приклади свідчать про вільним випаровуванням. Процедуру проводили ефективність та перспективність заявленого дворазово з інтервалом в 1 годину на добу способу у вивченні проникнення крізь шкіру упродовж 2-х тижнів (5 діб на тиждень - 20 аплікацій). Визначали вміст аскорбінової кислоти у поверхневих шарах епідермісу шкіри рук шляхом послідовних накладень скотчу розміром 1,5x2 см Кількість біхромату калію у кожному шарі епідермісу шкіри щура на оброблену ділянку дорсальної поверхні кисті з аплікації 1% розчину біхромату кал послідовним аналізом аскорбінової кислоти. Встановлено, що аскорбінова кислота Порядковий номер І II III IY Υ ΥΙ характеризується високою здатністю проникати аплікації крізь шкіру. Вміст аскорбінової кислоти у шкірі Структурний шар Роговий людини після повторних аплікацій стабільно епідермісу визначається у всі х піддослідних та відображає Вміст хрому 0,56 1,61 2,45 1,55 1,30 1,20 експоненціальний характер концентраційного профілю речовини (табл..2). Різниця між вмістом хімічних речовин, оскільки він дозволяє аскорбінової кислоти у досліджуваних шарах поєднувати кількісний розподіл та накопичення епідермісу шкіри чоловіків та жінок при даному речовини у шарах шкіри з точним визначенням об'ємі вибірки не носить достовірного характеру. морфологічних структурних елементів кожного Через 1-2 тижні після завершення циклу нашкірних шару, що важливо для аналізу потенційного аплікацій вітаміну, він ще визначався у тканині: ризику крізьшкірної дії на здоров'я. його кількість складала 10-20% через 1 тиждень і Джерела інформації 1-7% - через 2 тижні. Отримані дані однозначно 1. Rougier Α., Dupuis D. & Lotte С. Stripping свідчать про сформоване у шкірі депо method for measuring percutaneous absorption in аскорбінової кислоти, яке зберігається протягом 2 vi vo. In Percutaneous Absorption. Mechanismsтижнів при відносно слабкій концентрації діючого Methodology-Drug Delivery, 2nd Edition (ed. R.L. агенту в нанесеному на шкіру розчині, що Bronaugh & H.I. Maibach)// New-York: Marcel обумовлює швидке створення та функціонування Dekker.-1989.- P.415-434. захисного шару у шкірі. 2. G. Potard, С Laugel, H.Schaefer, J.-P. Marty The Stripping Technique: In vitro Absorption and 7 Penetration of Five U V Filters on Excised Fresh Human Skin / Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology.-2000.-l.-№ 6.- P. 336-344. 3. Roel J.C., Kuether A.M. Quantative determination of ascorbic acid in biological matherial /Biol.Chem.-1943.-147.- №1.- P.3-11. 26674 8