Спосіб виділення зооспорангіїв збудника раку картоплі synchytrium endobioticum (schilb.) perс. з грунту

Спосіб виділення зооспоранпів збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. з грунту, що включає в себе просушування грунту, Винахід відноситься до галузі сільського господарства, зокрема до виділення структурних елементів мікроорганізмів з грунту. Відомі способи виявлення зооспорангіїв збудника раку картоплі з грунту, в яких запропоновано просіювати ґрунтову наважку через сита 0,5 мм та 0,25 мм, змішувати з хлороформом або з диброметаном, або сумішшю чотирихлористого вуглецю з ефіром. При цьому зооспорангії збудника спливають на поверхню, де їх збирають і підраховують під мікроскопом [1, 2]. Відомий також спосіб відділення патогену з допомогою суміш» 3% мінеральної ол>, та 3% автомобільної олії з водою [3]. Зооспорангії', що спливають, розбавляються лактофенолом і теж підраховуються. Відомий спосіб осадження зооспорангіїв збудника 1% розчином сірчанокислого натрію, після просіювання ґрунтової проби крізь сита 0,25 мм та 0,3 мм [4]. Також відомі способи виявлення патогену з допомогою 70% розчину сахарози та визначення його життєздатності фарбуванням флюорисцентними барвниками нітросинім тетразолієм та акридиновим оранжевим [5], а також бромистим етиДієм [в]. Відомий спосіб виявлення зооспорангіїв збудника хвороби, який теж заснований на просію» ванні грунту і центрифугування в чотирихлористому вуглеці [7]. Він є найбільш близьким технічним видається під відповідальність власника патенту РАКУ КАРТОПЛІ SYNCHYTRIUM ENDO розтирання гумовим пестиком, просіювання крізь сита, центрифугування, виявлення життєздатних зооспорангіїв, відрізняється тим, що просіювання грунту включає в себе застосування сита з порами 0,5 мм, 0,25 мм та 0,03 мм, промивання зразка грунту ефіром над останнім ситом (0,03 мм) для розчинення органічних речовин, центрифугування проводять в 48,5%-розчині натрію йодистого з питомою вагою 1,4 з одночасним фарбуванням зооспоранпів збудника хвороби тим же розчином, що дозволяє виявити життєздатні зооспорангії збудника хвороби. рішенням до способу, що заявляється, який використовується як прототип. Спосіб, що вирішується у прототипі, полягає в тому, що він включає у себе просушування грунту, його розтирання гумовим пестиком, просіювання крізь сита з порами 1,0 мм та 0,2 мм і центрифугування в чотирихлористому вуглеці з питомою вагою 1,54. Спорангії, що спливають, збирають на годинникове скельце, визначають їх життєздатність шляхом плазмолізу-деплазмолізу в 6-молярному розчині хлористого натрію, виділяють життєздатні від нежиттєздатних, під мікроскопом їх підраховують. Згадані способи та спосіб-прототип мають такі недоліки. 1. Відомі способи є надто трудомісткими і їх використання пов'язане з затратою часу. 2. Складові компоненти способів досить дефіцитні. 3. Основним недоліком всіх способів і в основному способі-прототипу є те, що для їх проведення застосовуються сполуки, які є високотоксичними і є небезпечними для оточуючого персоналу. В основу винаходу поставлено завдання розробити більш досконалий, екологічно безпечний, швидкий спосіб виділення зооспорангіїв збудника раку картоплі з фунтових зразків, який може бути використаний карантинною службою при виявленні вогнищ збудника хвороби. Поставлене завдання досягається тим, що у запропонованому способі шляхом здійснення ряду со со < 34865 прийомів у певній послідовності досягається результат, а саме, вдається виділяти зооспорангії збудника раку картоплі з грунту шляхом розтирання грунту, його просіювання крізь сита з порами 1,0 мм, 0,5 мм, 0,25 мм, 0,03 мм, промивання ефіром над останнім ситом (0,03 мм) для розчинення органічних сполук з грунту і центрифугування в 48,5%-ному розчині розчину натрію йодистого з питомою вагою 1,4, одночасного визначення життєздатності патогена, оскільки розчин натрію йодистого фарбує жиітєздатні зооспорангії збудника раку картоплі в жовтий копір Результат, що досягається внаслідок цього, перевищує результат, що досягається при здійсненні інших способів та способу-прототипу 1 Спосіб реалізується при використанні дешевого препарату 2 Запропонований спосіб займає набагато менше часу 3 Застосовуються сполуки, які не шкідливі для здоров'я людини Отже, спосіб, що заявляється, відповідає критерію винаходу "новизна" та "суттєві відміни". Приклади здійснення способів. Приклад 1 (прототип) Ґрунтовий зразок (10 г; просушують, розтирають гумовим пестиком, просіюють крізь сита з порами 1,0 мм та 0.2 мм, центрифугують на протязі 2 хвилин при 800 об./хв у чотирихлористому вуглеці (питома вага - 1,54). При цьому зооспоранпї збудника раку спливають на поверхню (в центрифугат), а грунтові суміші випадають в осад. Зооспорангії збирають на годинникове скельце. Виявлення життєздатних зооспорангіїв проводять за допомогою 6-молярного розчину хлористого натрію, при якому відбувається ппазмоліз-деплазмоліз спор (цитоплазма відстає від мембрани зооспорангіїв) їх підраховують під мікроскопом (таблиця 1, додаток 1). Приклад 2. Ґрунтовий зразок (1 г) просушують, розтирають гумовим пестиком, просіюють крізь сита з порами 1,0 мм, 0,5 мм, 0,25 мм та 0,03 мм. Над останнім ситом (0,03 мм) зразок промивають ефіром для розчинення органічних речовин грунту і центрифугують на протязі 1 хвилини при 3000 об /хв у 48,5% розчині натрію йодистого (нетоксичною речовиною, на відміну від попереднього прикладу, де використовується канцерогенна речовина чотирихлористий вуглець). При цьому зооспорангії' збудника раку спливають на поверхню (в центрифугат), а грунтові суміші випадають в осад. Зооспорангії збирають на годинникове скельце. Виявлення життєздатних зооспорангіїв проводять за допомогою їх фарбування за допомогою того ж розчину натрію йодистого. При цьому живі спорангії жовті, зернисті, а нежиттєздатні - порожні, деформовані - не фарбуються в жовтий колір. їх підраховують під мікроскопом. Ідентифікують зооспорангії збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilb) Регс. від інших видів (таблиця 1, додаток 1) Таким чином, одночасно визначається кількість зооспорангіїв лагогена, а також їх життєздатність в ґрунтових зразках. Отримані результати здійснення запропонованого способу виділення зооспорангіїв збудника раку картоплі з грунту не поступається прототипу. Спосіб, що заявляється, має переваги перед прототипом, оскільки його ефективність вища. Позитивний ефект запропонованого способу виділення патогену підтверджує експериментальна перевірка, яка здійснювалась при виявленні зооспорангії хвороби з різних регіонів України. Додаток 1 Кількість виділених зооспорангіїв збудника раку картоплі з ґрунтових зразків, що відібрані в різних регіонах України (по відношенню до способу-прототипу) Патотипи, Ізоляти Виявлено зооспорангіїв ССІ4 (прототип) Nal 48,5% (спосіб, що заявляється) Кількість 11 - Міжгірський агресивний (с. Майдан, Міжгірського району, Закарпатської обл.) t3 - Рахівський агресивний (м. Рахів, Закарпатської обл.) t8 - Ясинський агресивний (с. Ясиня, Рахівського району, Закарпатської обл.) КІЛЬКІСТЬ % 42,6+1,1 46,6±1,9 9,3 58,6+2,6 66,3+2,8 13,1 66,6±1,6 73,6±2,9 11,9 46,6±1,9 53,0±2,6 13,8 84,3±1,8 93.6±2,9 11,0 28,3±1,6 32,3±1,9 14,1 22 - бистрецький агресивний (с. Бистрець, верховинського району, Івано-Франківської обл.) Ді - звичайний (с. Буківка, Герцаївського району Чернівецької обл.) Ді - звичайний (с. Красноільськ, Сторожинецького району Чернівецької обл.) Літературні джерела. 1. владимирская Н.Н. Пленочный метод определения зараженности супесчаных почв возбудителем рака картофеля Synchytrium endobioticum (Schilb) Регс. Методические указания. - Л., 1952. 23 с. 2. Голик И.В. Состав для выделения зооспорангиев Synchytrium endobioticum (Schilb) Регс. из 34865 раковых наростов картофеля. Авторское своде* тельство СССР. NS 254944, 1970, МПК А 01 п Кп. 45л, 7/04,09,03, 1970 г. 3. Pratt M. The longevity of resting sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. In Soil. GPPO Bull. 1976. 6, 2: p. 107-108. 4. Marcus O. Untersuchungen zur Auszahlung von Daursporangien des Kartoffel krebserregers Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc in Bodenproben. Deutsch. Pflanzentzd, 1969, 21, 10. 5. Сурнакова Н.Е. Способ определения жизнеспособности возбудителя рака картофеля. Авторское свидетельство СССР, to 1014880. 03.01.1983 г. 6. Яковлева В.А., Карнаухов В.Н. Способ определения жизнеспособности зооспорангиев возбудителя рака картофеля Заявка to 3900318/3113/6061. 28.05 1986 г. 7 Шариков К.Е. Выявление картофельного рака микроанализом. Методические рекомендации. - Минск, 1954. - 24 с. Тираж 50 екэ. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 - 7 2 - 8 9 (03122) 2 - 5 7 - 0 3