Спосіб біодозиметрії радіаційного впливу

Спосіб біодозиметрії радіаційного впливу шляхом дослідження хромосомних аберацій в лімфоцитах периферичної крові і співвідношення рівня нестабільних обмінних аберацій з даними дозоефектної кривої, який відрізняється тим, що до датково враховують швидкість елімінації аберантних клітин при екстраполяційній оцінці рівня хромосомних аберацій на момент закінчення радіаційного впливу, який розраховують за формулою: Винахід належить до радіобіології, а саме біодозиметрії, і може бути використаний для ретроспективної біодозиметрії радіаційного впливу у осіб, які були в контакті з джерелами радіації, зокрема, ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС. На сучасному етапі розвитку техніки відбувається постійне розширення контакту людей з променевим чинником, в той же час за останні десятиріччя на ядерних об'єктах відбувся ряд аварій, що призвело до забруднення радіонуклідами довкілля і опромінення населення. Для України ця проблема стала життєвою після Чорнобильської катастрофи. Відомо, що при опроміненні в малих дозах виникають пошкодження генетичного матеріалу соматичних і статеви х клітин, які викликають індукцію злоякісних новоутворень і спадкову патологію. Тому є актуальною оцінка впливу на геном людини, прогнозування ранніх та віддалених наслідків опромінення, розробка інформативних критеріїв для визначення ступеня променевого ураження організму для своєчасної профілактики і лікування радіаційне зумовлених патологій. Відомий спосіб автоматизованої біодозиметрії малих доз іонізувальних випромінювань. Згідно до відомого способу для виявлення пошкоджень генетичного матеріалу лімфоцитів периферичної крові при хронічному низькоенергетичному опроміненні людини використовують аналіз мікроядер (МЯ) у клітинах периферичної крові. Тест частоти МЯ в лімфоцитах периферичної крові дозволяє визначити вплив надфонового ни зькопотужного випромінювання в малих дозах на групи людей, які проживають на територіях, забруднених радіонуклідами або працюють в умовах професійного опромінення (Романова О.П. Оцінка впливу на людину низькопотужного іонізуючого випромінювання в малих дозах за тестом частоти мікроядер у лімфоцитах периферичної крові: Автореф. дис...канд. біол. наук. - Київ, 1999. – С. 19). До недоліків даного способу треба віднести придатність мікроядерного тесту ли ше для групової біоіндикації низькопотужного опромінення і непридатність його для індивідуальної біодозиметрії. Окрім того, в дозах, менше 250-300 мГр, обраний показник (МЯ) не має ексклюзивної специфічності до іонізувального випромінювання. Ці недоліки обмежують можливості широкого застосування відомого способу. Відомий спосіб біодозиметрії радіаційного впливу шля хом визначення хромосомних аберацій дицентричного типу у лімфоцитах периферичної крові. При реалізації відомого способу визначають і вміст фракції Е-37-розежоутворюючих лімфоцитів у відсотках та при їх кількості менше середніх значень, які визначають у здорових осіб, роблять висновок про факт радіаційного впливу в діапазоні до 0,2 Гр, причому визначення Б-37-розетко-утворюючих лімфоцитів проводять не раніше 6 місяців після опромінення (Заявка № 97116659 RU, МПК 6 G01N33/53. Способ биологической индикации радиационного воздействия / Центральный НИ рентгено-радиологический институт MB РФ. Заявл. 9.10.97; Опубл. 20.04.99). Y0 = Yt - C , e - kt (19) UA (11) 40409 (13) A де: Y0 - первісно індукована частота аберацій; Yt частота аберацій в термін t після експозиції; С спонтанний рівень аберацій; k - коефіцієнт регресії, що визначає швидкість елімінації аберантних клітин. 40409 Відомий спосіб дозволяє встановити факт радіаційного впливу у діапазоні до 0,2 Гр, простий і доступний, може використовуватися для обстеження населення. Проте, точність відомого способу невисока, розрахунки не дозволяють визначити дозу радіаційного впливу, крім того при дослідженні визначено часовий поріг 6 місяців, з якого можна проводити дослідження цим способом. Ці недоліки обмежують можливість широкого використання відомого способу біологічної індикації радіаційного впливу. Найближчим до даного тпособу, за технічною суттю та ефектом, який досягається, є спосіб біодозиметрії радіаційного впливу шля хом дослідження хромосомних аберацій в лімфоцитах периферичної крові і співвіднесення рівня нестабільних обмінних аберацій з даними дозоефектної кривої (прототип - Biological dosimetry: chromosomsl aberration analysis for dose assessment. - IAEA Techn. Report Series № 260. - Vienna, 1986. - 69 p.). Відомий спосіб дозволяє використати результати віддаленого цитогенетичного обстеження для ретроспективної біодозиметрії, а саме - визначення дози опромінення за відносними показниками виходом дицентриків і кілець на клітину з дицентриками і кільцями та виходом дицентриків і кілець на клітину з абераціями хромосомного типу (Qdr). До недоліків відомого способу треба віднести той факт, що, виходячи із закономірностей утворення радіаційно-індукованих аберацій, показник Qdr має перебувати постійним з часом в лімфоцитах крові людини при опроміненні in vivo. Але , як показали наші дослідження, у ліквідаторів протягом перших дво х років після перебування в зоні ЧАЕС спостерігався накопичувальний тренд у динаміці вільних ацентричних фрагментів, пов'язаний з трансформацією хроматидних делецій в ході проліферації лімфоцит-прекурсорів. Синхронність зростання частоти ацентриків та елімінації клітин з дицентриками і кільцями привели до нестабільності показника Qdr, що засвідчило неправоможність його використання дня ретроспективної біодозиметрії у випадках поєднаного впливу променевого чинника і мутагенів хімічної природи. В основу винаходу поставлене завдання створення способу біодозиметрії радіаційного впливу, в якому використання додаткового незалежного прогнозного чинника і оцінка рівня хромосомних аберацій на момент закінчення радіаційного впливу з його використанням дозволить з великим ступенем точності здійснювати ретроспективну біодозиметрію радіаційних впливів. Поставлене завдання вирішується таким чином: у відомому способі біодозиметрії радіаційного впливу шляхом дослідження хромосомних аберацій в лімфоцитах периферичної крові та співвіднесення рівня нестабільних обмінних аберацій з даними дозо-ефектної кривої додатково враховують швидкість елімінації аберантних клітин при екстраполяційній оцінці рівня хромосомних аберацій на момент закінчення радіаційного впливу, який розраховують за формулою: Y0 = де: Y0 - первісно індукована частота аберацій; Yt частота аберацій в термін t після експозиції; С спонтанний рівень аберацій; k - коефіцієнт регресії, що визначає швидкість елімінації аберантних клітин. Швидкість елімінації аберантних клітин, як показали наші емпіричні дослідження, є незалежним прогнозним фактором, урахування якого забезпечує точність ретроспективної дозиметрії. Використання розробленого математичного апарату дозволило здійснити екстраполяційну оцінку рівня хромосомних аберацій на момент закінчення радіаційного впливу. Використання всієї сукупності даних суттєви х ознак, забезпечило можливість здійснити точну ретроспективну біодозиметрію радіаційного впливу у будь-які терміни після його закінчення до моменту нормалізації цитогенетичних показників що визначається як досягнення частотою аберацій верхньої межі контрольного рівня. Цей спосіб реалізують таким чином. У індивідуума, який у минулому мав контакт з іонізувальною радіацією, визначають частоту нестабільних обмінних аберацій хромосомного типу із супутніми ацентричними фрагментами у метафазах першого мітоза 48-50 мл годинної культури лімфоцитів периферичної крові. Культивування лімфоцитів периферичної крові проводиться за стандартною методикою. Цільну гепаризовану кров переносять до культурального флакону, додають середовище Ігла та сироватку великої рогатої худоби у співвідношенні 4:1, вносять фітогемаглютинін і культивують в термостаті при 37°С протягом 5 годин. На 47 годині додають розчин колхіцину у фінальній концентрації 0,1 мкг на 1 мл культури. Фіксацію клітин проводять у суміші метанолу і крижаної оцтової кислоти (у співвідношенні 3:1). Суспензію клітин наносять на предметне скло і фарбують за Гїмза. Аналіз препаратів проводять під світловим мікроскопом з масляною імерсією. Розпізнання цитогенетичних порушень проводять за відомими світовими критеріями. Враховують дицентричні і кільцеві хромосоми, вільні ацентричні фрагменти, хроматидні делеції, хроматидні обміни, гіперплоїдні та поліплоїдні клітини, для кожної особи аналізують до 500 метафаз. Відзначають частоту цитогенетичних пошкоджень на 100 клітин. При дослідженні індивідуальної динаміки цитогенетичних ефектів в репрезентативній рандомізованій групі ліквідаторів, яга зазнали опромінення в малих дозах, було встановлено, що з часом після променевого впливу відбувається елімінація лімфоцитів з маркерами опромінення - нестабільними обмінними абераціями хромосомного типу. Було емпірично показано, що швидкість елімінації аберантних клітин в діапазоні малих доз не залежала від дози опромінення та тривалості експозиції, становлячи 24,8% за рік. Коефіцієнт експозиційної регресії, який відповідає даній швидкості (k=-0,285) можна вважати універсальним параметром при екстраполяційних розрахунках первісного рівня аберацій, індукованих пролонгованим впливом радіації в малих дозах. Частота аберацій, яка спостерігається, конвертується у первісно-індукований рівень на момент закінчення опромінення за формулою: Yt - C , e - kt 2 40409 Y0 = Y -C Y0 = t - kt , e Yt - C e- kt (0,18 - 0,08%) : e-0,285 ´10 = 1 = ,73% . Виходячи з даного значення первісного індукованого рівня нестабільних обмінних аберацій хромосомного типу, доза опромінення, що розраховувалася за методичними рекомендаціями МАГ АТЕ (IAEA, 1986) з використанням інтралабораторної кривої "доза-ефект", дорівнювала 0,57 Гр тотального пролонгованого гамма-опромінення. Дане значення дози добре відповідало клінічній симптоматиці у пацієнта і практично співпадало з результатом прямої цитогенетичної біодозиметрії, проведеної у 1986 році (0,53 Гр). Для доказу переваг способу біодозиметрії радіаційного впливу, були проаналізовані результати обстеження трьох ідентичних груп учасників ліквідації аварії на ЧАЕС, в І та II групі (30 чоловік) біодозиметрію було проведено відповідно до аналогу і прототипу, а у III гр упі (45 чоловік) - згідно до способу. Результати порівняльного аналізу наведено в таблиці. Дані порівняльного аналізу, наведені в таблиці, свідчать про те, що використання способу, для біодозиметрії радіаційного впливу забезпечує: високу точність дозиметрії (98,7%); вимірювання впливу малих доз радіації (0,05-0,1 Гр); розширений часовий діапазон ефективного застосування (20 років); можливість детекції пролонгованого випромінювання; застосування при поєднаному хіміо-променевому діянні. де: Y0 - первісно індукована частота аберацій; Yt частота аберацій в термін t після експозиції; С спонтанний рівень аберацій; k - коефіцієнт регресії, що визначає швидкість елімінації аберантних клітин. Далі екстраполяційне оцінене значення первісно-індукованого рівня аберацій співвідноситься з дозоефектною кривою, що одержана in vitro для відповідних умов опромінення. Нижче наведено приклад конкретного виконання способу. Приклад 1. Громадянин Тр-ов С.А. 1953 р. н. I. x. № 80881. Ліквідатор з терміном перебування в зоні ЧАЕС з травня до гр удня 1986 р. Звернувся до IMP АМНУ (м. Харків) у січні 1997 р. Для верифікації дози опромінення було призначено проведення цитогенетичного аналізу. Інтервал між опроміненням і обстеженням становив 10 років. Проведений аналіз на виявлення нестабільних аберацій хромосом показав, що у даного індивіда був присутній підвищений рівень нестабільних обмінних аберацій (дицентриків з супутніми ацентричними фрагментами): Частота даних аберацій становила 0,18% призначенні 0,08% в контролі. Екстраполяційне визначення первісно-індукованого рівня дицентриків і кілець мало вигляд: 3 40409 Таблиця Характеристика способів біодозиметрії радіаційного впливу Показники Точність Дозовий діапазон ефективного застосування, Гр (нижня межа) Часовий діапазон ефективного застосування Застосування при пролонгованому опроміненні Застосування при поєднаному хіміопроменевому діянні Спосіб біодозиметрії радіаційного впливу прототип n=30 аналог n=30 що заявляється n=45 87,5 75,2 98,7 0,05-0,1 0,2 0,05-0,1 до 1 місяця не раніше 6 місяців 20 років з моменту опромінення ні так так ні ні так __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4