Модифікована тест-система дот-іфа для виявлення специфічних антитіл (антигенів) збудників хвороб

1. Модифікована тест-система дот-ІФА для виявлення специфічних антитіл (антигенів) збудників хвороб, яка включає планшет або пластиковий гребінець, набір реагентів для імуноферментного аналізу, проявник, імунопероксидазний кон'югат, яка відрізняється тим, що як імунопероксидазний кон'югат використовують пероксидазний 3 41080 4 ля забійної діагностики туш конкретних тварин. Створений в процесі постановки реакції комДослідження проводилися застарілими методами, плекс антиген-антитіло виявляється за допомогою які є менш чутливими і не підлягають електроннокон'югата, що розщеплює субстрат, який характему протоколюванню результатів. Таку ситуацію ризується появою темно-коричневого забарвленповинно було змінити впровадження ІФА, але осня, яке може реєструватись візуально по титру новним недоліком ІФА була його видоспецифічдослідних сироваток або за допомогою спектроність іншими словами, тест-система для діагностифотометра., шляхом вимірювання оптичної щільки тварин конкретної тварини. Сьогодні виникла ності субстрату. потреба налагодити серійне виробництво універОписані етапи одержання компонентів для посальної тест-системи ІФА, яка б дозволила провостановки реакції ензимом мічених антитіл, особлидити аналіз у свиней, коней і м'ясоїдних та інших во трихінельозного антигену за двома етапами, ссавців. Використання цієї тест-системи дозволить досить трудомісткі і складні, крім того при викориспроводити дослідження сироваток крові живих танні фракціонованого антигену при постановці тварин та міжм'язової рідини заморожених туш на реакції зустрічаються помилково-позитивні рехворобу. зультати, реакція недостатньо специфічна, що Відома «Тест-система для специфічної імунозначно знижує цінність реакції ензимом мічених ферментної діагностики протибруцельозних антиантитіл при діагностиці трихінельозу. тіл у біологічних рідинах від тварин "ІФА-бруцела На сьогодні не існує жодної комерційної уніАВ" [пат. UA №58437, кл. А61К39/21, від версальної тест-системи для виявлення специфіч15.07.2003] яка включає планшет, набір реагентів них антитіл (антигенів) збудників хвороб. В основдля імуноферментного аналізу та проявник, яка ному тест-системи направлені на виявлення має імунопероксидазний кон'югат на основі монокантитіл у окремих видів тварин або ссавців - свині, лональних антитіл, універсальний розчин для розконі, м'ясоїдні, гризуни, тощо або людина. Це обуведення біологічних компонентів та розчин для мовлено конструкцією одного з критичних компопромивання. Недолік полягає в тому, що в тестнентів тест-системи, під назвою - пероксидазний системі видової належності присутні так звані анкон'югат. Тобто, в тест-системі видової належності тивидові кон'югати. присутні так звані антивидові кон'югати, а завдяки Відома реакція мікропреціпітації на живих лив тест-системі, що заявляється можливо дослічинках трихінел [Бессонов АС. Диагностика трихиджувати зразки різних видів тварин завдяки імунеллеза. Вильнюс, "Минтис", 1975, -с.383]. Принноферментному кон'югату на основі білка "G" цип реакції полягає в тому, що живі личинки чи Streptococcus spp., тобто діагностувати широкий статевозрілі трихінели, які вміщені в гомологічну спектр бактеріальних та вірусних інфекцій, зокреімунну сироватку, при температурі 37-40°С видіма вірус лейкозу великої рогатої худоби, без зміни ляють продукти життєдіяльності (секрети і екскрекомплектації. ти), котрі преципітуються антитілами імунної сироНайбільш близьким аналогом є розробка тестватки, створюючи преципітати, які чітко видно під системи фірми MycoDot "Mossman Associates", мікроскопом. США. Відмінністю цієї тест-системи є наявність у Негативна сторона методу полягає в тому, що комплектації концентрату розчину для відмивання, в реакції використовують живих личинок або стадетектуючим реагентом є колоїдне золото, наявтевозрілих трихінел, які можуть бути небезпечниність референтної шкали замість програмного зами для виконавців реакції, трудомісткість їх одербезпечення для обробки результатів. Тестжання та зберігання, недостатня специфічність, система призначена для виявлення тільки протиефективність та візуальний облік реакції. туберкульозних антитіл людини до ліпоарабімаВідома реакція ензимом мічених антитіл для нанного антигену збудника туберкульозу, чутлидіагностики трихінельозу [Белозеров С.Н. Гуданавість цієї тест-системи становить близько 75% а вичус Т.Н. Реакция ензимом меченых антител для специфічність 95% тобто дослідження є менш чутдиагностики трихинеллеза. Ж. "Ветеринария", ливими і не підлягають електронному протоколю1982, Изд. "Колос" М. -С.41-44]. Принципова схема ванню результатів. відтворення цієї реакції полягає в тому, що в лунки В основу корисної моделі поставлено задачу мікропланшета для імунологічних досліджень одстворення модифікованої тест-системи дот-ІФА норазового використання, які виконують роль інердля виявлення специфічних антитіл (антигенів) тного носія антигену і антитіл, послідовно вносятьзбудників хвороб шляхом сконструйованого перокся розчинний антиген, дослідна сироватка крові з сидазного кон'югату, завдяки чому система забезприпустимою наявністю антитіл, кон'югат і субпечує виявлення антитіл проти антигенів різних страт. Кон'югат це розчин антивидових антитіл, хвороб у майже всіх наземних тварин і людини, з мічених ферментом пероксидазою хрону, субстрат можливістю проведення одночасного дослідження - суміш 0,08%-ий 5-аміносаліцюювої кислоти з зразка для виявлення антитіл (антигенів) різної 0,05%-ого перекису водню у відношенні 9:1. В якоспецифічності, та можливістю використання для сті антигену використовується трихінельозний дослідження крім сироватки крові і молока, зразків фракціонований антиген, що готується із свіжоміжм'язової рідини (сукровиці), тест-система просодержаних або ліофілізованих личинок трихінел. та, надійна в роботі, та проявляє високу чутливість Антиген одержують в 2 етапи, спочатку готується та специфічність. цільний екстракт личинок трихінел, потім він фраПоставлена задача вирішується таким чином, кціонується методом гель-хроматографії на сефащо у відомій тест-системі яка включає набір реадексі G-200. гентів для імуноферментного аналізу, згідно з корисною моделлю, в якості одного з інгредієнтів 5 41080 6 використовують кон'югат на основі білка «G» ряд В з дистильованою і ретельно проводять проStreptococcus spp. мивку, виймаючи і вставляючи гребінець в лунки Розроблена тест-система більш підходе до (операцію виконують не менш 10 сек). Переносять практичної діяльності тому, що в разі виникнення гребінець в ряд С і інкубують при кімнатній темпепотреби діагностування окремого виду, чи декілька ратурі (18-20)°С 20 хвилин. Після закінчення інкувидів ссавців вона може оперативно використовубації гребінець переносять у ряд D з дистильоваватися в осередках інфекції або для поточного ною і ретельно проводять промивку, виймаючи і моніторингу за епізоотичною ситуацією. вставляючи гребінець в лунки (операцію виконуЗавдяки використанню імунопероксидазного ють не менш 10 сек.), в рядах D після чого заликон'югату на основі білка G тест-система дозволяє шають гребінець в ряду Е на час приготування без зміни комплектації проводити діагностику різрозчину і внесення проявника в ряд F. Вносять по них хвороб використовуючи різні біологічні проби 0.3 см3 розчина проявника в кожну луку ряду F. від тварин. Переносять гребінець в ряд F та інкубують при До складу тест-системи входять слідуючи викімнатній температурі (18-20)°С до 5 хвилин, контди сировини (таблиця). ролюючи розвиток кольорової реакції по позитивКон'югат - специфічний рекомбінантний білок ному (К+) контролю (чітка крапка 0 3 мм синього до імуноглобулінів тварин, що кон'югований із пекольору), а також по відсутності пофарбованої роксидазою хрону". плями на зубці з негативним (К-) контролем. РеакПозитивний контроль - сироватка крові тварин, цію зупиняють переносячи гребінець у дистильояка специфічні антитіла до відповідних антигенів вану воду ряду Е і бережно промивають 10 сек. та позитивно реагує у ІФА. Отримують в лабораВиймають гребінець з планшету і підсушують на торних умовах згідно з вимогами технологічних повітрі до 2 хвилин, після чого проводять облік інструкцій. результатів. Планшет для проведення аналізу Негативний контроль - сироватка крові тварин, багаторазового застосування. Для подальшого що не містить антитіл до відповідних антигенів. його використання необхідно не пізніше 30 хвилин Отримують в лабораторних умовах згідно з вимопісля закінчення досліджень п'ятикратно ретельно гами технологічних інструкцій. прополоснута його проточною і однократно дистиХромоген ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, льованою водою. Після чого висушити планшет імпортований, фірми Clinical science product inc., при кімнатній температурі або в термостаті. кат. № 01016-1. Облік результатів. Можливість практичного використання тестРезультати аналізу враховуються якщо: системи, що заявляється, ілюструється прикладом - на зубці, в місті реакції із позитивним (К+) коконкретного виконання з використанням повної нтролем з'явилась чітка синя крапка; сукупності ознак корисної моделі. - на зубці, в місті реакції із негативним (К-) конПриклад тролем крапка відсутня , Якщо хоча б одне з цих Модифікована (дот-ИФА) тест-система, за доумов не виконано то результати вважаються невіпомогою якої можна проводити досліди на наяврними і дослід потрібно повторити. ність антитіл до збудника лейкозу ВРХ. Результати враховують залежно від ступеня Тест-система являє собою імуносорбент у визабарвлення крапок в хрестах (один хрест - 25% гляді гребінки і набора компонентів. Тест-система забарвлення), приймаючи інтенсивність забарврозрахована на проведення 50 аналізів. лення крапки позитивного контролю за чотири Для проведення аналізу необхідно приготувахреста (100%). Зразок вважається позитивним ти робочі розчини. Для приготування розчину якщо інтенсивність забарвлення крапки більш ніж кон'югату вміст ампули з кон'югатом розчиняють в один хрест (25% від позитивного контролю). Відсу4 мл розчину № 1 для розведення сироваток та тність або контурне забарвлення крапок свідчить кон'югату. Розчин №1 для розведення сироваток про відсутність антитіл до відповідних антигенів. та кон'югату вносять по 0,25см2 в кожну лунку ряду Слабке забарвлення плями на + або +/- повинно А планшета. Дистильовану воду для промивання розглядатись, як можлива наявність позитивної зубців вносять в ряди В, D, Е по 0,3 см3 на лунку. реакції. У цьому випадку тварина повинна підтягаРозчин кон'югату вносять по 0,3 см3 в кожну лунку тись повторному дослідженню за допомогою верряду С планшета. сифікаційного або альтернативного тесту". ІнтенПроведення аналізу. сивність забарвлення оцінюють візуально по 3-х В лунку А1 вносять 0,05 см3 позитивного контбальній шкалі ролю (К+), в лунку А2 0,05 см3 негативного контро- Невизначена (+) - потребує перестановки. лю (К-), в інші лунки відповідно - по 0,05 см3 дослі- Слабопозитивна (++). джуваних зразків. Гребінець виймають з упаковки, - Позитивна (+++). тримаючи за верхню частину, розвертають підпиМожливий варіант електронного обліку в висом до себе і вставляють в лунки ряду А.. Гребігляді оптичної щільності забарвлених крапок. нець залишають в лунках ряду А на 20 хвилин при Таким чином, запропонована тест-система закімнатній температурі (18-20) °С. безпечує виявлення антитіл проти антигенів різних По закінченні інкубації позбавляються зайвої хвороб у різних видів тварин використовуючи різні вологи з зубців, тримаючи гребінець перпендикубіологічні проби від цих тварин, простотою і дешелярно до фільтрувального паперу і обережно торвизною, завдяки використанню стандартних 96каючись кінчиками зубців гребінця до фільтрувалункових планшетів, які можна використовувати льного паперу (не доторкуючись до робочої багаторазово. Вона надає можливість варіантів поверхні зубців), після чого гребінець переносять у нанесення декількох антигенів на носій краплями, 7 41080 8 смугами і можливістю кількісного дозування сорводопровідної води та можливо використання тесбованого антигену, також етапи відмивання нету при кімнатній температурі. Проста і надійна в специфічно зв'язаних реагентів можуть бути зароботі, проявляє високу чутливість та специфічбезпечені використанням дистильованої або ність. Таблиця Назва показника Характеристика та норма Зовнішній вигляд, колір - кон'югат Світло-солом'яна опалесцентна рідина імуноферментний + - позитивний контроль(К ) Світло-солом'яна трохи опалесцююча рідина - негативний контроль (К-) Світло-солом'яна трохи опалесцююча рідина - хромоген ТМБ Прозора безбарвна рідина - імуносорбент по Пластиковий гребінець з сорбованим на ньому відповідними антигенам, не повинен мати тріщин та ушкоджень Номінальний об'єм, см3 - кон'югат Від 0,3 до 2,0 імуноферментний + - позитивний контроль (К ) 0,1 або 0,3 - негативний контроль (К-) 0,1 або 0,3 - хромоген ТМБ 12 або 22 Чутливість та специфічність: - чут- Не нижче 98 %, при визначені методом імуноферментного аналізу з ливість використанням стандартного набору позитивних сироваток . - специфічність Не нижче 95 %, при визначені методом імуноферментного аналізу з використанням стандартного набору негативних сироваток Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601