Тест-система для виявлення антитіл проти вірусу гепатиту с(іфа-нcv)

Винахід відноситься до галузі медицини, а точніше, вірусології і може використовува тись для проведення імунологічних досліджень, діагностичних аналізів інфікованості окремих людей та скринінгових досліджень груп населення на інфікованість вірусом гепатиту C. Відома тест-система [1] для проведення імуноферментного виявлення антитіл (AT) проти вірусу гепатиту C в сироватках чи плазмі людей. В основі тест-системи лежать рекомбінантні протеїни аналоги антигенів pNS4, pNS3, pCore з імунодомінантними епіотопами, що реагують з антитілами проти цього вірусу. Вітчизняною промисловістю такі рекомбінантні протеїни не випускаються. Відома тест-система для імуноферментного виявлення AT [2] на основі рекомбінантних поліпептидів, фіксованих на твердій фазі - поверхні лунок полі-стиролових планшет. Для промислового виробництва потрібно закутати велику кількість дорогих препаратів цих рекомбінантних поліпептидів за кордоном. В основу винаходу поставлено завдання створити імуноферментну тест-систему на основі нових рекомбінантних поліпептидів аналогів pNS4, pCore і за рахунок цього забезпечити виявлення антитіл проти вірусів, не зменшуючи надійність та специфічність систем. Поставлене завдання вирішують шляхом використання в імуноферментній системі аналогів злитного поліпептиду pNS4- pCore, фіксованих в лунках полістеролових чи поліхлорвінілових планшетів для імуноаналізу. Приклад 1. Визначення антитіл до антигенів вірусу гепатиту C в сироватці крові пацієнта К. Визначення проводять по відомій методиці [3] імунодефіцитного аналізу (ІФА). Для цього сироватку крові пацієнта розводять фосфорно-натрієвим буфером у співвідношенні 1 : 10. Планшетімуносорбент з фіксованими аналогами антигенів pNS4, pCore двічі промивають, вносять в лунки 90мкл розчину для розведення сироваток та 10мкл сироватки. У 3 вільні лунки планшета вносять по 50мкл розчину та по 50мкл негативного контролю, в 3 інші лунки вносять 100мкл позитивного контролю, а дві вільні лунки залишають контрольними. Планшет витримують 40хв при 37°C, потім 4 рази промивають, висушують, вносять в лунки по 100мкл кон'югату, інкубують планшет у повітряному термостаті 30хв при 37°C, знову промивають 6 разів і висушують. Потім вносять в усі лунки проявник з хромогеномортофенілендіаміном (ОФД) та гідроперитом, витримують 30хв при кімнатній температурі в темному місці, зупиняють пероксидазну реакцію внесенням в усі лунки по 50мкл розчину сірчаної кислоти і не більш ніж через 1хв вимірюють оптичну щільність (ОЩ) при довжині 492нм. Величина ОЩ в цьому діапазоні світла пропорційна концентрації антитіл до вірусу гепатиту C у зразках сироватки чи плазми. Сироватку пацієнта для порівняння досліджували на вміст антитіл до вірусу гепатиту C відомими тест-системами фірми Sanofy Diagnostic Pasteur (Франція) і науково-виробничого об'єднання "Диагностические системы" (Н. Новгород). Дослідження тест-системами сироватки пацієнта ідентифіковані як позитивні на вміст антитіл проти антигенів вірусу гепатиту C. Приклад 2. Визначення надійності та специфічності запропонованої тест-системи. Досліджують сироватки із станції переливання крові 11 інфікованих і 11 негативних сироваток тест системами. Усі сироватки досліджувались в 4-х повторах кожною тест-системою по описаній методиці. Дослідження тест-системами 11 інфікованих сироваток дало позитивний результат на наявність в них антитіл проти антигенів вірусу гепатиту C при 100% відтворенні результатів, а також негативні результати досліджень 11 негативних сироваток при 100% відтворенні. У 1 пацієнта була відмічена розбіжність з результатами, отриманими на тест-системі виробництва "Диагностические системы", яка дала 10 позитивних результатів на сироватках інфікованих пацієнтів. Таким чином, запропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл проти антигенів гепатиту C, має високу специфічність, надійна у використанні.