Короткотерміновий спосіб виявлення канцерогенності хімічних речовин

Короткотерміновий спосіб виявлення канцерогенності хімічних речовин, який полягає у використанні як об'єкта дослідження дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК), який відрізняється тим, що досліджується комплекс фізико-хімічних властивостей нативної ДНК in vitro (наприклад, стабільність вторинної структури, характеристична в'язкість, оптичні, полярографічні, хемілюмінесцентні, окисно-відновні властивості). (19) (21) u200901573 (22) 23.02.2009 (24) 12.10.2009 (46) 12.10.2009, Бюл.№ 19, 2009 р. (72) МАЗЕПА ІВАН ВІЦЕНТОВИЧ, МАЗЕПА МАРІЯ АНДРІЇВНА, МАЗЕПА АНДРІЙ ІВАНОВИЧ (73) ПРИКАРПАТСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ВАСИЛЯ СТЕФАНИКА 3 порівняльний аналіз фізико-хімічних властивостей основного об’єкту в розвитку злоякісного процесу дезоксирибонуклеїнову кислоту - ДНК. При розробці даного способу використані препарати ДНК промислового виробництва спеціалізованими фірмами (Sigma, Merck та отримані авторами методом Мармура в умовах лабораторії кафедри біохімії Прикарпатського національного університету імені Василя Стефаника з тканин здорових (контрольних) та поражених лейкозним процесом тварин. Препарати ДНК для вивчення канцерогенних властивостей хімічних речовин повинні бути чисті від домішок та нативні. Дослідження проводяться на ДНК, розчиненій в стандартному солевому розчині (ССР). Концентрації ДНК в дослідах використовувалися у відповідності до вимог конкретної методики. Хімічні речовини, що досліджуються на канцерогенність розчиняються в ССР. Визначення концентрації білка в ДНК проводиться по методу Лоурі, вмісту РНК - орциновим методом. Хімічні реактиви, що використовуються при виділенні ДНК та виконанні хімічних аналізів були марки ХЧ або ОСЧ. Порівняльний аналіз фізико-хімічних властивостей ДНК проведений з використанням ультрафіолетового спектрофотометра - Спекорд М400, інфрачервого спектрофотометра - Спекорд М82, віскозиметра Зімма-Крозерса, квантометричної установки для визначення хемілюмінесценції, полярографа ПА-2, потенціометра М160. Приклад конкретного виконання тестування хімічних речовин на канцерогенність: 1. Отримання нативних препаратів ДНК з тканин здорових та ушкоджених злоякісним ростом експериментальних тварин; 2. Дослідження чистоти і нативності препаратів ДНК; 3. Вивчення стабільності вторинної структури та характеристичної в’язкості ДНК; 4. Вивчення оптичних, полярографічних хемілюмінесцентних та окисно-відновних властивостей ДНК; 5. Статистичний аналіз та обгрунтування висновку про канцерогенність чи її відсутність у досліджених речовин. Приклади результатів дослідження чистоти і нативності, температури плавлення і ширини температурного переходу та характеристичної в’язкості препаратів ДНК з тканин нормальним і уражених лейкозним процесом та під впливом канцерогенних речовин представлені в таблиці 1. При аналізі результатів таблиці можна констатувати, що препарати ДНК з печінки здорових щурів є чисті від домішок, нативні з гіперхромним ефектом 37,5±0,3%, температурою плавлення 86,2±0,1°С, ширина температурного переходу 8,50±0,09°С, характеристичною в’язкістю 68,28±1,64дл/г. В умовах формування лейкозного процесу ДНК містить статистично достовірно більшу домішку білка, РНК, має нижчий гіперхромний ефект і величину температури плавлення, які свідчать про зниження стабільності вторинної структури ДНК. 44433 4 Під впливом неорганічного та органічного канцерогенів зміни чистоти, нативності та стабільності вторинної структури препаратів ДНК аналогічні тим, які встановлені для препаратів ДНК з лейкозних тварин (таблиця 1). При аналізі УФ-спектрів препаратів ДНК із печінки здорових щурів встановлено, що пік максимального поглинання локалізований в області 258260нм, тоді як мінімальний пік розміщений в області 228-233нм. Спектрограми препаратів ДНК печінки та пухлини уражених лейкозом щурів по харааналогічні контрольним ктеру поглинання препаратам ДНК з вираженим гіпсохромним зсувом. При дії на ДНК здорових щурів неорганічного та органічного канцерогенів зміни в УФ-спектрах аналогічні тим, які констатовані для ДНК лейкозних тварин. При аналізі інфрачервоних спектрів препаратів ДНК інтактних (здорових) тварин виділено поглинання на частотах 3900-2850см-1 (перша смуга), -1 1730-1515см (друга смуга) та ряд менш виражених смуг поглинання, локалізованих в інших ділян-1 ках спектру (1390-1310, 1230-1215, 1090-1040см ). Порівнюючи характер поглинання препаратів ДНК, отриманих із тканин здорових і поражених лейкозом тварин, записаних в умовах різної відносної вологості (в.в.) показано, що в препаратах ДНК із лейкозних тканин поглинання в першому -1 діапазоні розтягнуто до 2610см . Співвідношення величин поглинання цієї смуги при різних значеннях в.в. в принципі зберігають взаємовідношення, які характерні для контрольних зразків. Друга смуга частот в спектрі з максимумом -1 1705±5см , характеризуючи процес комплементарного спарювання азотистих основ, є диференціальною характеристикою при оцінці стану вторинної структури ДНК. При злоякісній трансформації тканин в ІЧ-спектрі ДНК в смузі поглинання 1705±5см 1 наступають істотні зсуви, що проявляються порушенням структури піку, дифузному збільшенні смуги по ширині і зміщенням піку максимального -1 поглинання до 1715±6см . Залежність смуги -1 1705см від функціонального стану ДНК дозволяє допустити, що виявлені відмінності в характері взаємодії ДНК лейкозних тканин з інфрачервоним випромінюванням можуть бути використані як для оцінки бластомогенної дії хімічних речовин, так і для визначення лікувального ефекту протипухлинних препаратів. Ефекти неорганічного та органічного канцерогенів на оптичні властивості ДНК здорових тварин аналогічні тим, які виявлені для нуклеїнових кислот лейкозних тварин. Встановлено, що препарати нативної ДНК із тканин здорових щурів проявляють слабку полярографічну активність, яка описується одним, в окремих випадках, двома слабкими піками, які не перевищують фонової активності. В препаратах ДНК із тканин лейкозних особин достовірно фіксуються два піки в області від'ємного потенціалу: пік І від 1,05 В до 1,30 В і пік II від 1,45 В до 1,60 В. Оскільки походження піків в препаратах ДНК пов'язане з активністю вільних груп макромолекул, 5 які або взагалі не приймали участі в утворенні структурних зв'язків, або утворювались внаслідок їх розриву, то для посилення наявного ефекту в препаратах ДНК була використана теплова денатурація, при якій наступає розрив всіх водневих зв'язків. При аналізі полярограми денатурованих препаратів ДНК із тканин здорових і поражених лейкозом щурів встановлена висока електрохімічна активність, що проявляється чіткими двома піками, характер і локалізація яких нагадує піки для препаратів ДНК із печінки і пухлини лейкозних тварин. Неорганічний та органічний канцерогени на електрохімічну активність препаратів ДНК печінки здорових щурів викликають зміни аналогічні тим, які спостерігаються на препаратах ДНК печінки і пухлини лейкозних тварин. Радикали, що утворюються, з пероксиду водню можуть підсилювати хемілюмінісцентні властивості речовин з низькою вільнорадикальною активністю, включаючи нуклеїнові кислоти. Аналіз ініційованим пероксидом водню хемілюмінісценції ДНК з тканин здорових і уражених лейкозом тварин проведений за наступними показниками - амплітуда спонтанного світіння, амплітуда швидкого спалаху, амплітуда повільного спалаху, світлосума ініційованого пероксидом водню світіння. При дослідженні препаратів нуклеїнових кислот з тканин щурів показано, що препарати ДНК тканин здорових і уражених лейкозом особин не здатні спонтанно випромінювати світло у вигляді хемілюмінісценції, оскільки рівень світіння їх практично не перевищує фонові показники (табл. 2). При введенні в систему ДНК - розчинник пероксиду водню, що є активним стимулятором вільнорадикальних реакцій, індукує випромінювання світла у вигляді хемілюмінісценції, в структурі якої чітко виділяється швидкий і повільний спалах. Амплітуда швидкого спалаху, що з'являється після введення пероксиду водню, неоднакова для різних препаратів. Проте, загальною тенденцією в змінах швидкого спалаху є збільшення середніх показників для препаратів ДНК, отриманої з органів щурів, уражених лейкозом. Після швидкого спалаху наступає деякий спад світіння ДНК, який переходить в поступовий розвиток повільного спалаху, параметри якого (амплітуда і світлосума свічення) змінюються з вже відміченою тенденцією для швидкого спалаху. Оскільки ДНК нездатна до спонтанного випромінювання світла, можна вважати, що відмічене явище хемілюмінісценції ДНК при введенні пероксиду водню обумовлене властивостями останнього. У спеціально проведеному досліді з'ясувалося, що при введенні в систему фосфатний буфер стандартний сольовий розчин чистого пероксиду водню реєструється тільки швидкий спалах, за яким слідує різкий спад свічення, інтенсивність 44433 6 якого при досягненні стаціонарного рівня не відрізняється від спонтанної хемілюмінесценції. При порівнянні показників ОВП тканин здорових і уражених лейкозом особин (табл. 1) видно, що абсолютні величини ОВП ДНК печінкилейкозних щурів достовірно збільшені в порівнянні з контролем, причому величина ОВП зразків ДНК пухлини кількісно перевищує такі показники ДНК печінки контрольних і уражених лейкозом щурів. В умовах формування лейкозного процесу ОВП ДНК досліджених тканин, маючи позитивний заряд, представляє зразки нуклеїнових кислот системою, в якій переважає окислена форма. Неорганічний та органічний канцерогени в системі ДНК - розчинник збільшує величину окисленої форми як здорових так і лейкозних тварин. Використання даного способу для встановлення канцерогенності конкретної хімічної речовини базується на порівнянні результатів впливу цієї речовини на фізико-хімічні (гіперхромний ефект, температуру плавлення, ширину температурного інтервалу, характеристичну в'язкість, оптичні, хемілюмінесцентні, полярографічні, окисно-відновні) властивості ДНК з тканин здорових тварин з результатами змін цих параметрів при формуванні злоякісного процесу. Канцерогенною речовина вважається у тому випадку коли дія її на фізико-хімічні властивості ДНК здорових тварин аналогічна змінам, що формуються в процесі злоякісного росту. Література: 1. Методические рекомендации по исследованию канцерогенных свойств химических веществ и биологических продуктов в хронических опытах на животных. - Москва - Ленинград, 1980. - 42с. 2. Международная программа по химической безопасности. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 51. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. - ВОЗ. - Женева, 1989. - 211с. 3. Ames B.N., McCann J., Yamasaki E. Methods for detecting carcinogensand mutagens with the Salmonella/mammalian microsome mutagenicity test//Mutat. Res. - 1975. - 31. - 347 - 364. 4. Ashby J., De Serres F.J., Draper M., Ishidate M.Jr., Margolin B.N., Matter B.E., Shelby M.D. Evalution of shortterm tests for carcinogens, Report of the International Programme on Chemical Satelys Collaborative Study on in vitro Assays. - Amsterdam? Oxford? New York, Tlsevier Science Publishers/ 1985. - (Progress in Mutation Research, Vol.5). 5. JARC. Mutagenesis assays with bacteria. In: Long-term and short-termscreeningassays for carcinogens: a critical appraisal. - Lyons. InternationalAgency for Research on Cancer. - IARC Vonographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans, Supplement 2. 1980a.-P. 85-106. 7 44433 8 Таблиця 1 Порівняльна характеристика фізико-хімічних властивостей ДНК з тканин здорових експериментальних тварин та при дії канцерогенів Досліджуваний показник Вміст білка, % Вміст ДНК, % Гіперхромний ефект, % Температура плавлення, °С Ширина температурного інтервалу, °С Характеристична, в'язкість, дл/г ОВП, мВ Контроль (пеЛейкоз (печінка) чінка) 0,49±0,02 0,84±0,03* 1,04±0,09 1,74±0,14* 37,1±0,3 33,5±0,3* 1,09±0,07* 2,14±0,12* 33,4±0,4* Неорганічний канцероген 0,93±0,04* 1,88±0,05* 33,9±0,4* Органічний канцероген 0,87±0,04* 0,84±0,05* 33,8±0,5* Пухлина 86,2±0,1 85,1±0,1* 84,9±0,1* 84,2±0,2* 84,6±0,3* 8,50±0,09 8,66±0,05 9,66±0,14* 9,03±0,15* 9,01±0,13* 68,26±1,64 53,60±1,29* 48,90±1,65* 51,3±1,49* 52,3±1,53* 229,0±1,2 264,4±3,2* 286,2±3,1* 283,1±2,9* 281,6±3,0* Таблиця 2 Показники ініційованої Н2О2 хемілюмінесценції (ХЛ) препаратів ДНК тканин здорових та вражених лейкозом щурів (М±m, n-8) Дослідна тканина контроль лейкоз Пухлина Спонтанна ХЛ Ас, відн. од. 1,36±0,08 1,26±0,13 Р>0,5 1,14±0,14 *р>0,2 h, відн. од. Печінка 7,41±0,39 11,48±0,90 р0,1 Ініційовані ХЛ Н, відн. од. S Н2О2, імп//103/103 С 9,22±1,22 17,46±2,34 р