Спосіб діагностики стану системи фібринолізу

1 Спосіб діагностики стану системи фібринолізу, що включає проведення лабораторних тестів та аналіз їх результатів, який відрізняється тим, що як лабораторні тести використовують наступний комплекс тестів визначен ня часу загального лізису еуглобулінів та тести визначення активності основних компонентів системи фібринолізу 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що попередньо стан системи фібринолізу визначають за скринінг-тестом визначення часу загального лізису еуглобулінів 3 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що виявлення причин патології визначають за тестами визначення активності тканинного активатора плазміногену і його шпбітора першого типу та їх співвідношення Спосіб діагностики стану системи фібринолізу за допомогою комплексу лабораторних тестів може бути використаний в медицині, а саме при порушенні рівноваги між потенціалом систем фібринолізу та зсідання крові і необхідний для прогнозування розвитку дисемшованого мікрозсідання крові (ДВС-синдрому) Виникнення порушень системи гемостазу в організмі характерно для багатьох захворювань, що викликають зміни параметрів системи гемостазу, і може визначатися порушенням балансу між активаторами й інгібіторами системи фібринолізу Головний активаторний вклад належить тканинному активатору плазміногена (t-PA), а основним інгібітором є інгібітор тканинного активатора плазміногену першого типу (РАІ-1) Іноді причиною виникнення тромботичної загрози є недостатня секреція в кровоток плазміногену чи надлишок основного інгібітору плазміну - аг-антиплазміну чний аналіз, час загального лізису еуглобулінів плазми крові), проте дані, що отримані скринінговими методами, не можуть ВІДПОВІСТИ на питання про характер патології і про причину порушень балансу в системі фібринолізу Для характеристики стану системи фібринолізу в КЛІНІЧНІЙ практиці проводиться визначення загального часу лізису еуглобулінів, але цей скринінг-тест дозволяє тільки виявити можливі загальні порушення в системі фібринолізу, а не конкретизувати причини їх виникнення Завдання винаходу - удосконалення способу діагностики стану системи фібринолізу при розвитку патології Завдання вирішується тим, що виконується комплекс лабораторних тестів для визначення параметрів системи фібринолізу, а саме визначення загального часу лізису еуглобулінів (скринінг-тест), активності тканинного активатора плазміногену, шпбітора тканинного активатора плазміногену першого типу, вмісту плазміногену, сі2-антиплазміну та проводиться аналіз їх результатів Основна роль приділяється трьом тестам 1) час загального лізису еуглобулінів, 2) визначення активності тканинного активатора плазміногену, 3) шпбітора тканинного активатора плазміногену першого типу Принцип методу полягає у визначенні співвідношення між активаторами й інгібіторами фібринолітичної системи В літературі описані методи визначення, як активності, так і вмісту компонентів системи фібринолізу в плазмі крові Це імуноферментні методи, в основу яких полягає специфічна взаємодія антиген-антитіло, функціональні методи з використанням специфічних хромогенних субстратів, що розщеплюються безпосередньо активованим досліджуваним білком, а не в сукупності з іншими білками, як це часто буває у функціональних тестах Крім цього в КЛІНІЧНІЙ практиці використовуються так звані скринінг-тести (АКТ, турбідиметри Визначення активності тканинного активатора 00 ю 51418 плазміногену, компонента, який вносить головний вклад у фібринолітичний потенціал плазми крові, дозволяє адекватно оцінити потенціал системи фібринолізу та забезпечити своєчасну ВІДПОВІДЬ на можливу загрозу тромбоутворення Інформація, що отримана за допомогою зазначених методів може ВІДПОВІСТИ на питання про причину виникнення в системі фібринолізу дисбалансу Запропоновані методи визначення активності тканинного активатора плазміногену і його інпбітора першого типу модифіковані й адаптовані для застосування в КЛІНІЧНІЙ практиці (Савчук О М , Гамісонія М Ш , КІЗІМ О І, Платонова Т М Значимість деяких показників фібринолітичної системи в ОЦІНЦІ стану гемостазу // ФІЗІОЛОГ журнал — 2001, т 47, № 3) Суть модифікації полягає 1 Потенціальна активність плазміногену виміряється в казешолітичних одиницях (казешолітичні одиниці характеризують потенційну плазмінову активність) Кількісне визначення вмісту плазміногену в мг/мол, як це практикується, не дає інформації про потенціал фібринолітичної системи Використання казешолітичних одиниць дозволяє уніфікувати різні препарати плазміногену по активності, що істотно збільшує відтворюваність і точність тестів (Robbms V , Summana L , Hsieh В , Shah R J The peptide chains of human plasmm Mechanism of activation of human plasmmogen to plasmm //J Biol Chem — 1967 — 242 — 2333 2342) 2 Застосування як кофактора t-PA бромціанового фрагменту фібриногену - FSB-2 (літературні дані свідчать про позитивний вплив фрагмента на активацію плазміногену t-PA у концентрації, достатньої для успішного виконання тестів) Використання мономірного фібрину чи суміші фрагментів фібрину, як це прийнято використовувати, не дає можливості стандартизувати умову виконання тестів (Bosma J , Rilken С , Nieuwenhuizen W , Binding of tissue-type plasmmogen activator to fibrmogen fragments // J Biochem — 1988 — 172 — 399 404) 3 Склад інкубаційної суміші для визначення активності t-PA плазміноген - 1,2ко/мл, еуглобулінова фракція досліджуваної плазми - 0,025мл, хромогенний плазміновий субстрат - 0,025мл, кофактор t-PA (фрагмент FSB-2) - 2мкМ, 0.05М фосфатний буфер, рН 7,4, що містить 0,15% твін 80 до 0,25мл Час інкубації 60 хвилин при 37°С Виміряється зміна оптичної ЩІЛЬНОСТІ при 405нм через визначені проміжки часу 4 Склад інкубаційної суміші для визначення активності РАІ-1 плазміноген - 1,2ко/мл, ацетатна плазма - 0,025мл, хромогенний плазміновий субстрат - 0,025мл, кофактор t-PA (фрагмент FSB2) - 2мкМ, 0.05М фосфатний буфер, рН 7,4, що містить 0,15% твін 80 - до 0,25мл Час інкубації 45 хвилин при 37°С Виміряється зміна оптичної ЩІЛЬНОСТІ при 405нм через 45 хвилин Задача винаходу вирішується виконанням комплексу тестів, визначення активності основних компонентів системи фібринолізу (плазміногену, сі2-антиплазміну, тканинного активатора плазміногену, шпбітора тканинного активатора плазміногену першого типу), часу загального лізису еуглобуЛІНІВ Особливістю способу є те, що тест визначення часу загального лізису еуглобулінів використовується не як основний тест, а як скринінг-тест, що дає попередню інформацію про стан системи фібринолізу Виконання тестів дає можливість визначення співвідношення активності тканинного активатора плазміногену і його інгібітору Це дозволяє характеризувати потенціал фібринолітичної системи і прогнозувати тромботичні ускладнення при розвитку патології Приклад № 1 Визначення загального часу лізису еуглобулінів, активності тканинного активатора плазміногену й активності шпбітора тканинного активатора плазміногену в плазмі крові групи пацієнтів, які перенесли гострий інфаркт міокарда та в плазмі крові групи пацієнтів, які страждають на діабет Таблиця 1 Норма 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Час загального лізису еуг- Активність тканинного активатора Активність шпбітора тканинного лобулінів, год плазміногену, і о/мл активатора плазміногену, і о /мл 2,5-3 2,05 ± 0,06 0,6-1,5 Гострий інфаркт міокарда 4,4 ±0,13 1,62 ±0,03 50 ±1,5 12 ±0,36 1,7 ±0,05 45,7 ±1,37 9,3 ±0,28 0,487 ±0,01 4 55 ±1,65 5,3 ±0,16 0,56 ± 0,02 34,3 ±1,03 6±0,18 0,98 ± 0,03 31, 4 ±0,94 Діабет 8 ± 0,24 0,243 ± 0,007 5,7 ±0,17 9 ± 0,27 0,146 ±0,004 11,4 ±0,34 6±0,18 0,1 ±0,003 1,4 ±0,04 4,3 ±0,13 0,689 ± 0,02 10,6 ±0,32 5,7 ±0,17 1,23 ±0,04 7,9 ±0,24 Висновок Як видно з таблиці, причиною дисбалансу в системі фібринолізу може бути як зниження активності тканинного активатора плазміногену і підвищення активності його шпбітора (тобто порушення балансу між активатором та інгібітором), так і зниження тільки активності активатора плазміногену, у той час як активність шпбітора в нормі Тест "час загального лізису еуглобулінів" 51418 виявляє порушення, але не зясовує причин патологи Це підтверджує те, що тест "час загального лізису еуглобулінів" може використовуватися тільки як скринінг-тест на початкових етапах діагностики, а тести визначення активності тканинного активатора плазміногену і його шпбітора повинні виконуватися обов'язково в комплексі для вияв лення можливих причин патології Приклад № 2 Визначення окремих параметрів системи фібринолізу в плазмі крові пацієнтів, що перенесли гострий інфаркт міокарда, після проведення тромболітичної терапії стрептокіназою Таблиця 2 Активність тканинного активатора плазміногену, і о /мл Активність плазАктивність a-zміногену, % антиплазміну, % норма 100 ± 3 38 ±1,1 18 ±0,54 8 ± 0,24 12 ±0,36 40 ±1,2 1 2 3 4 5 100 ± 3 50 ±1,5 35 ±1,1 63 ±1,9 56 ±1,7 60 ±1,8 2,05 ± 0,06 4,48 ±0,13 6,37 ±0,19 5,84 ±0,17 3,14 ±0,09 8,8 ±0,26 Висновок Аналіз параметрів системи фібринолізу після проведення тромболітичної терапії стрептокіназою виявив значне зниження рівня наТИВНОГО ПЛаЗМІНОГену І, ВІДПОВІДНО, (Х2 антиплазміну Активність тканинного активатора зростає, як і активність шпбітора, що також є ВІДПОВІДДЮ на введення стрептокінази Виконання тесту "загальний час лізису еуглобулінів" немож Активність шпбітора тканинного активатора плазміногену, і о /мл 0,6-15 50 ±1,5 45,7 ±1,37 55 ±65 71 ±2,13 31,4 ±0,94 Час загального лізису еуглобулінів, год 2,5-3 0 0,4 ±0,01 0 0 0,5 ±0,01 ливо у зв'язку з майже повним розщепленням фібриногену ( « 1г) в плазмі крові на даному етапі проведення тромболітичної терапії Приклад № З Визначення активності тканинного активатора плазміногену в плазмі крові в присутності розчинного фібрину і стрептокінази Таблиця З Зміст розчинного фібрину, г/л 0 0,03 0,06 0,12 Активність тканинного активатора плазміногену, і о /мл 1,21 ±0,03 1,21 ±0,03 1,23 ±0,03 1,19 ±0,02 Активність стрептокінази в плазмі, і о /мл Висновок 3 таблиці видно, що ні розчинний фібрин, ні стрептокіназа не впливають на визначення активності тканинного активатора плазміногену Представлені дані свідчать, що тест "визначення активності тканинного активатора плазміногену" є інформативним і достовірним показником стану потенціалу системи фібринолізу, 0 10 25 40 Активність тканинного активатора плазміногену, і о /мл 1,45 ±0,04 1,45 ±0,04 1,5 ±0,045 1,39 ±0,04 що дуже важливо як при постановці діагнозу, так і при проведенні контролю ефективності ВІДПОВІДНОГО лікування Приклад № 4 Визначення параметрів системи фібринолізу у жінок до та після операції кесарева розтину Таблиця 4 Показник Норма Плазміноген, % сі2-антиплазмін, % Тканинний активатор плазміногену, і о /мл Інгібітор активатора плазміногену І типу, і о /мл 100 ±1,38 100 ± 1,2 До кесаревого розтину 89,36 ± 4,35 78,64 ± 6,84 2,07 ± 0,04 3,44 ± 0,59 9,26 ±1,67 До 15 58,6 ±14 25 ± 6,7 Висновок Дані про активність плазміногену та сі2-антиплазміну свідчать про невеликі коливання цих параметрів, що є типовим при багатьох патолопях, в той час як інформація про активність тка Після кесарева розтину 105,5 ±4,89 71,17 ±3,66 нинного активатора плазміногену і його шпбітора вказує на причину порушення системи фібринолізу і може служити основою при контролі за станом пацієнта після операції 51418 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71