Спосіб оцінки системи згортання у новонароджених

ШВІО/ОО СПОСІБ ОЦІНКИ СИСТЕМИ ЗГОРТАННЯ У НОВОНАРОДЖЕНИХ Винахід належить до медицини, а саме педіатрії. Відомий спосіб оцінки згортуючої активності крові (Лабораторные методы исследования системы гемостаза // Под ред. Гольдберга Е.Д. - Томск, 1980. -192 с). Однак використання даного способу у новонароджених має свої обмеження в зв"язку з необхідністю забору великої кількості крові (5 -10 мл). Найбільш близьким за технічною сутністю є мікрометод оцінки системи згортання у дітей (Баркаган Л.З., Чупрова А.В., Дорошенко Л.А. Микротесты оценки гемостаза и их клиническое значение // Гематология и транс фузиология. - 1990. - № 1. - С.21-22). Використання даного методу обмежене в зв"язку з використанням нестандартних методів оцінки гемостазу, необхідністю багаторазового забора у новонародженого крові (біля 10 разів) у кількості 0,1 0,2 мл (загальна кількість 1-1,5 мл), що викликає травматизацію організма новонародженого. В основу винаходу поставлена задача створення способу оцінки системи згортання у новонародженого, в якому визначаються мікротести, що дозволяють оцінити стан згортуючої, антизгортуючої та фібринолітичних ланок гемостаза, який технічно мало трудомісткий, достатньо доступний і може використовуватись експрес-методом. Поставлена задача вирішується тим, що в способі оцінки системи згортання визначаються мікротести оцінки системи згортання крові -протромбіновий і тромбіновий час, згідно винаходу додатково визначається активність фїбріногену, антитромбіну Ш, Хагеман-залежного фібрінолізу, потенціальна активність плазміногену, які мають наступні значення: протромбіновий час, с - 23,0+0,75; тромбіновий час, с - 18,0+0,96; фібріноген, г/л - 1,8+0,12; антитромбін-Ш, % 78,7+3,25; Хагеман-залежний фібріноліз, хв. - 36,0+3,20; потенціальна активність плазміногену, хв. 28,0+2,93, що відображають стан згортуючої, антизгортуючої та фібринолітичних ланок системи згортання. Фібриноген є цінним тестом згортуючої системи крові. Він є першим плазменним фактором згортання крові. Фібриноген приймає участь у третій фазі згортання згортуючої ланки - у фібриноутворенні, де він за участю ферменту тромбіну перетворюється у фібрин. Визначення концентрації фібриногену має важливе діагностичне значення. Зниження концентрації фібриногену спостерігається при вроджених а- (гіпо) фібриногенеміях, при вторинних порушеннях синтезу фібриногену (хворобах печінки, пернаціозній анемії, цинзі, хронічному мієлолейкозі, тяжкому токсикозі вагітних, шоковому стані), при синдромі дисемінованого внутрішньосудиного згортання. Підвищення концентації фібриногену спостерігається при гострих інфекціях, інфаркті міокарда, дифузних захворюваннях сполучної тканини, опіках). Антитромбін-Ш є головним компонентом антизгортуючої системи крові, фізіологічним антикоагулянтом плазми, основним плазменним фактором гепарину: без якого останній не справляє антикоагулянтного ефекту. Концентрація антитромбіна-Ш знижена при дисемінованому внутрішньосудинному згортанні, у хворих з захворюваннями печінки (головним чином при цирозі) і нефропатичним синдромом, при оперативних втручаннях з обширними крововтратами, атеросклерозі, ішемічній хворобі серця, спадковій тромбофілії, гомоцистинурії, деяких видах гіпермепідемії. Дефіцит антитромбіну -Ш у хворих при деяких протеінуріях може бути важливим патологічним фактором, що сприяє розвитку тромбічних діатезів. Хагеман-залежний фібриноліз є тестом, що відображає стан фібринолізу - ферментної реакції, що направлена на лізис (деградацію) фібрина і відтворення кровоплину. В основу метода покладена здатність активованого каоліном фактору XII перетворювати плазміноген у плазмін - фермент, що розщеплює на фрагменти фібрин, фібриноген і інші компоненти системи згортання крові. Зниження фібринолітичної активності в порівнянні з нормою свідчить про порушення внутрішнього механізму активності гшазміногену. Зниження фібринолітичної активності Хагеман-залежного фібринолізу спостерігається при вірусному гепатиті, цирозі печінки та інших захворюваннях, при масивних тромбозах, ДВЗ-синдромах. Потенціальна активність плазміногена - тест фібринолітичної системи, що відображає рівень плазміногену в плазмі і може використовуватись з метою діагностики і контролюємого лікування ДВЗ-синдрому, масивних тромбозів, вибору методів терапії хворих і контролю за лікуванням. Спосіб використовується наступним чином. Тести визначали в термостуємій бані (37 ° С) на поліетиленовій кришці, яка плаває в термобані. Використовували автоматичні мікропіпетки. Облік згустку, що утворюється, контролювався за допомогою довгої голки і фіксувася секундоміром. Кожний тест контролювали по донору. Протромбіновий час. На поліетиленову кришку автоматичною піпеткою вносили 0,02 мл тромбопластина ( 10 мл/мл розтертого в ступці і розведеного фізіологічним розчином) і хлористого кальція (0,025 мл). Прогріваємо при 37 °С 1 хв., потім вносимо 0,02 мл плазми. Включаємо секундомір і помічаємо час утворення згустку за секундоміром. Тромбіновий час. Вносимо 0,02 мл тромбіну (2 мл в 1 мл фізіологічного розчину) і 0,02 плазми. Реєструємо час утворення згустка. Для визначення концентрації фібриногена, антитромбіна-Ш, Хагеманзалежного фібринолізу, потенціальної активності фібриногену використовували набори реактивів науково-виробничої фірми "Simko Ltd" (м.Львів). Фібриноген. До 0,02 мл плазми (розведеної 1:9 буфером Міхаеліса) додають 0,02 мл тромбіну. Визначають час утворення ниток фібрину при періодичному струшуванні кришки. Концентрацію фібриногену визначають по калібровочній кривій, що додається, і виражають в г/л. Антитромбін-Ш. Попередньо проводять тестування робочого розчину тромбіну, отриманого з маткового розчину розведенням 0,15 М розчином КСЕ у співвідношенні 1:4. Для цього до 0,05 мл розчину тромбіну додають 0,075 мл розчину фібриногену (попередньо прогрітого 1 хв. при 37 °С ). Реєструють час утворення згустка. Час утворення згустка повинен скласти 10,5+0,5 с. Визначення активності антитромбіну-Щ. До 0,1 мл робочого розчину тромбіну додають 0,05 мл плазми (розведеної в 20 разів). Суміш інкубують 2 хв. (точно!) при 37 °С, а потім видаляють згусток, що утворився, голкою. Швидко відбирають 0,05 мл суміші, додають 0,075 мл розчину фібриногену (попередньо прогрітого 1 хв. при 37 ° С ) і помічають за секундоміром час утворення згустка. За калібровочною кривою знаходять процентний вміст антитромбіна-Ш. Хагеман-залежний фібриноліз. В поліетиленову пробірку, яка містить 0,12 мл плазми додають 2 мл робочого ацетатного буфера, рН 5,2 і одразу ж вносять 0,12 мл суспензії коаліну, перемішують і розташовувують у водяну баню (37 °С ) на 45 хв., періодично перемішуючи суміш дерев"яною паличкою. Потім проби центрифугують протягом 10 хв. при 2000 об./хв. Надосадову рідину зливають, пробірки перевертають на фільтрувальний папір. Еуглобуліновий згусток суспензують в 0,12 мл боратного буфера, рН 7,6, додають 0,12 мл хлориду кальція і негайно ставлять у водяну баню при 3 7 ° С. Реєструють секундоміром час лізису згустка (від часу його утворення до повного розчинення (утворення піску). Потенціальна активність плазміногену. В поліетиленовій пробірці до 2 мл ацетатного буферного розчину додають 0,12 мл плазми. Суміш обережно перемішують, інкубують 10 хв. при температурі 4 ° С та центрифугують 10 хв при 2000 об.хв. Надосадову рідину зливають, пробірки перевертають на фільтрувальний папір. Осад розчиняють у 0,12 мл робочого боратного буферного розчину стрептокінази, 0,12 мл робочого розчину тромбіну і пробірку з сумішшю ставлять у водяну баню при 37 ° С інтервал від часу утворення згустку до його повного розчинення вважають часом лізису згустка. В аналогічних умовах досліджують лізис еуглобулінів із змішаних зразків нормальної (контрольної) плазми донорів. Розрахунок: U 100 — %, н де U - час лізису еуглобулінового згустка плазми, що досліджується; Н - час лізису еуглобулінового згустка нормальної плазми. Розроблені і практично використані мікротести для новонароджених, що народилися від матерів з екстрагенітальною патологією (цукровий діабет, вади серця, вегето-судинна астенія), які представлено в таблиці і є прикладом. Як видно з таблиці у новонароджених, що народились від матерів з цукровим діабетом, на 6-10 добу виявлено підвищення концентрації фібриногену до 142 % (відносно новонароджених, що народились у здорових матерів). Визначення антизгортуючої ланки - антитромбіну-Ш - виявило Таблиця - стан згортуючої І антизгортуючоі системи у новонароджених, що народилися від матерів з екстрагенітальною патологією Показник Від здорових матерів Цукровий діабет 1-3 доба 6 - 10 доба 73,3±4,98 (113,8±2,75)* 1,4+0,21 (2,7+0,31)* 47,0±4,82 38,0+3,05 Від хворих матерів Вади серця 1-3 доба 6-10 доба 81 „1+4,03 85,3±5Д1 1,8+0,22 1,8+0,26 36,0±3,54 38,0+4,96 1 - 3 доба 6-10 доба Антитромбін Ш 78,7±3,25 73,2±5,5 Фібриноген, г/л 1,8+0,12 1,9+0,15 36,0+3,20 40,0+3,31 Хагеманз ал ежний фібриноліз, хв. ПАГТ,хв. 28,0±2,93 38,0±2,34 30,0+3,21 34,0±2,1 29,0±3,59 * - різниця відносно показників новонароджених від здорових матерів достовірна (р < 0,05) 33,0±2,85 Вегето-судинна дистонія 1 - 3 доба 6-10 доба 72,7±4,70 (55,6+1,93)* 1,8±0Д6 1,9+0,30 37,0+4,21 32,0+3,91 22,0+2,73 26,0_+2,78 виражене підвищення цього показника до 155,5 % у новонароджених від матерів з цукровим діабетом на 6-10 добу. Виявлено збільшення на 6-10 добу вмісту антитромб іну-Ш у новонароджених, що народились у матерів з вегето-судинною астенією, що відображає стан гіпокоагуляції і клінічно підтверджується наявністю петехіального висипу у дітей. Новонароджені із змінами балансу згортуючої і антизгортуючої систем (від матерів з цукровим діабетом і вегето-судинною дистонією) складають групу ризику по геморагічним ускладненням. Даний спосіб оцінки згортуючої системи у новонароджених є високочутливим, доступним, мало трудомістким і може використовуватись як експрес-метод для дослідження системи згортання крові у новонароджених у поліклінічних відділеннях, лікарнях і клініках України. Заступник директора по науковій робі д.м.н. [Is f ^^^ШЖ**™"^!