Спосіб класифікації генетичної чистоти сільськогосподарських культур

Спосіб класифікації генетичної чистоти сільськогосподарських культур, при якому виділяють білкові фракції, підготовляють їх до електрофорезу, проводять електрофорез, проявляють компоненти білка в спектрі, визначають частоти наявності білкових компонентів за відносними Винахід відноситься до сільського господарства, зокрема до селекції і насінництва сільськогосподарських культур Відомо спосіб класифікації генетичної чистоти сортів культур за спектором білку, який складається із виділення білку і підготування його до електрофорезу, електрофорез, проявлення компонентів білку в гелях, ідентифікація компонентів білку в спектрі, складання білкових формул та ідентифікація сортів за формулами білків (1) Недоліком цього способу є необхідність великої КІЛЬКОСТІ параметрів для характеристики окремих сортів Найбільш близьким за технічним рішенням до запропонованого є спосіб ідентифікації самозапилених ЛІНІЙ, який ґрунтується на електрофорезі білку, одержанні електрофоретичного спектру, розрахунку відносних електрофоретичних рухомостей, складанні білкових Формул (2) Недоліком цього способу є наявність великої КІЛЬКОСТІ розрізнених показників генетичної чистоти ЛІНІЙ, ЩО робить його малоефективним В основу винаходу поставлено задачу одержання узагальненого показника розпізнавання генетичної чистоти самозапилених сільськогосподарських культур, шляхом математичного обчислення, що забезпечить підвищення достовірності та ефективності класифікації сільськогосподарських культур Рішення задачі досягається визначенням коефіцієнту ідентифікації за формулою електрофоретичними рухомостями, складають білкові формули, який відрізняється тим, що класифікацію генетичної чистоти сільськогосподарських культур проводять за коефіцієнтом ідентифікації, який визначається за формулою де І - коефіцієнт ідентифікації, P. - відносна частота наявності білкових компонентів, і - КІЛЬКІСТЬ білкових компонентів де І - коефіцієнт ідентифікації, P. - відносна частота наявності білкових компонентів, і - КІЛЬКІСТЬ білкових компонентів Для білкового компонента, що постійно присутній в електрофоретичному спектрі Р|=1 і коефіцієнт ідентифікації буде дорівнювати нулю Іод2Р„ R.=Порівняльний аналіз винаходу з прототипом показує, що новий спосіб відрізняється від відомого тим, що класифікація генетичної чистоти сільськогосподарських культур здійснюється за коефіцієнтом ідентифікації, який обчислюється за математичною формулою Таким чином спосіб, що заявляється, має новизну і суттєву ознаку, достатню у всіх випадках, на яку поширюється обсяг правової охорони Це дозволяє робити висновок, що новий спосіб має новизну і суттєві ознаки ВІДМІННІ ВІД прототипу Винахід пояснюється копіями електрофоретичного спектру зеїну, які представлено на фіг Електрофореграми зеїну самозапилених ЛІНІЙ кукурудзи, де І-П502, 2-ДК169, 3-ДК66, 4-ДК165, 5-ДК316, 6-ДК2/17, 7-ИК235, 8-ДК322, 9-ДК437, 10-ДК507, (О со (О Ю 57636 11-ГК26, 12-MV4 Розчин проводять при прогріванні на водяній бані Компоненти добавляють в зазначеній ПОВІДОМОСТІ ЯКІ підтверджують можливість здійсСЛІДОВНОСТІ нення винаходу Для проведення класифікації генетичної чисПІСЛЯ добавлення останнього компоненту тоти сільськогосподарських культур зерно надріб/персульфату калію/ розчин перемішують і нюють, виділяють білок, підготовляють його до рівномірно /по СТІНЦІ пластини/заливають в проелектрофорезу, проводять електрофорез, проявміжок між скляними пластинами приладу для ляють компоненти білку в спектрі, складають білелектрофорезу кові формули, визначають частоту наявності білПісля ЦЬОГО вставляють гребінці для формукових компонентів за відносними вання комірок Через 2-3 хвилини, впевнившись електрофоретичними рухомостями, визначають що гель заполімеризовано гребінці виймають коефіцієнт ідентифікації за формулою і за значенПісля заливання і полімеризації гелю знімають ням коефіцієнту ідентифікації проводять класифігерметизуючу пластину і прилад із скляними плакацію сільськогосподарських культур стинами розміщають в зовнішню електродну камеру Наприклад Для проведення класифікації генетичної чистоти ЛІНІЙ кукурудзи беремо 12 самоЕлектродний буфер заливають до рівня, позапилених ЛІНІЙ кукурудзи селекції Інституту зеркриваючого на 3-4мм скло з вирізом і не доходячонового господарства УААН П502, ДК169, ДК66, го на 3-4мм до верхнього краю скла ДК165, ДК316, ДК2/І7, ИК235, ДК322, ДК437, Прогріті білки з допомогою шприца наносять в ДК507, ГК26, MV4 стартові комірки гелю Після нанесення білку /кожна окрема пробірка в окрему пробірку і витПодрібнюють зернівку за допомогою спеціальримки з занесеними білками на протязі 15-20 хвиного пристрою, до складу якого входять підставка лин апарат підключають до джерела постійного для 6-10 зерен, металевої трубки діаметром 15струму таким чином щоб електрод, що знаходить20мм, стального стержня, що вільно входить в ся у внутрішній камері, був підключений до заряду трубку, але довший за трубку "плюс" Включають джерело струму Кожну зернівку з зародком покривають трубкою і подрібнюють ударами стержня Після видаПри напрузі 500В термін електрофорезу 5 голення зародку, який відрізняється більш м'якою дин консистенцією, шрот переносять в центрифужну Після звершення електрофорезу відключають пробірку МІСТКІСТЮ 1,5-3,0мл і заливають 70% етаджерело струму, зливають електродний буфер, нолом, притримуючись співвідношення шрот-спирт витягують гелеві пластини, які поміщають в кюве1 3 Після ретельного перемішування скляною ти, попередньо заповнені краскою для фіксації і паличкою пробірки залишаємо при кімнатній темскрашування гелю пературі на 30-40 хвилин Після цього суміш в Виявлення компонентів зеїну проводимо пробірці ретельно перемішують і центрифугують зі фіксацією гелей в 7% розчині ТХУ Далі гелеві швидкістю 2,5тис обертів за хвилину на протязі 5 пластини відливають хвилин Після центрифугування 0,1 мл спиртового Електрофореграми зеїну самозапилених ЛІНІЙ екстракту відбирають в чисті пробірки і висушують наведено на фіг в сушильному шкафу при температурі 40°С За електрофореграмами проводимо клаПеред нанесенням, але не раніше, ніж за 30сифікацію генетичної чистоти зазначених ЛІНІЙ 40 хвилин розчин білків на протязі 5 хвилин прокукурудзи грівають в витяжній шафі в воді, доведеній до В спектрі виділились зернові компоненти, які кипіння розділили на чотири групи компонентів А-24-32, В34-42, С-41-54, Д-55-75 Готують прилад для електрофорезу прокладки або краї скла з внутрішньої сторони змазують За електрофоретичними спектрами зеїну гліцерином або літолом, скляні пластини закріпскладаємо зетові формули самозапилених ЛІНІЙ ляють в приладі, краї скла і розміщені між ними для їх кодування, що наведені втабл І прокладки змазують літолом і закривають поліетиленовою прокладкою, прижимають герметизуючу Таблиця 1 пластину Співвідношення компонентів для приготування Зетові формули самозапилених ЛІНІЙ розчину А-2,6 3,2г метиленбісакриламіду і 120г акриламіду в 250-280мл дистильованої води Назва Білкова формула Співвідношення компонентів для приготування ЛІНІЙ А В С Д полікриламідного гелю 25, 28, 35, 42 45, 50 П502 Дистильована вода Юмл 32 55, 60, 64 Розчин А-2,6 15мл ДК169 25 35, 42 45, 50, 54 55, 64 Уксусна кислота 1,2мл 25, 28 34, 36 43,47,50,53 55,58,60,62, ДК66 Сечовина 28,8г 66,70 Глицин 60мл ДК165 25,28 35,40 43,45,50,53 55,63,66,75 Аскорбінова кислота ЗОмг 25 34, 36 43,46,47,50 ДК316 В профільтрований через ватний фільтр і до53 58,64,70 ведений дистильованою водою розчин до об'єму 24, 26, 34, 35 42,45,50,53 ДК 58,9мл добавляють темед 0,18мл, розчин прчан2/17 28 58, 64 окислого заліза - 0,6мл, розчин персульфату калію ИК235 25 35 43,45,50,53 55, 60 - 0,Змл 57636 Продовження таблиці 1 Назва Білкова формула ЛІНІЙ А В С ДК322 25, 28 35, 40 43,45,50,53 25, 28, 35, 40 43, 50 ДК437 32 Д 55 62 64 25, 26, 32 ГК26 25, 28 MV4 25 ДК507 35, 40 35, 40 35 41,44,47,50 53 43,50,53 43,45,50,53 55, 58 55,62,64 55 55, 60 62 Таблиця 2 Частота наявності компонентів зеїну Група Білковий компонент, № Частота наявності компонентів, раз 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 7 3 1 1 10 2 3 2 5 9 12 1 9 6 3 3 1 1 1 10 4 6 4 4 2 2 1 1 А В С Д Відносна частота наявності білкових компонентів за електрофоретичними рухомостями 0,917 0,583 0,25 0,083 0,083 0,833 0,167 0,25 0,167 0,417 0,75 1,0 0,083 0,75 0,50 0,25 0,25 0,083 0,083 0,083 0,833 0,333 0,50 0,333 0,333 0,167 0,167 0,083 0,083 Таблиця З Значення коефіцієнтів ідентифікації самозапилених ЛІНІЙ Назва лінії П505 ДК169 ДК66 ДК165 ДК316 ДК2/17 ИК235 ДК322 ДК437 ДК507 ГК26 MV4 Визначаємо частоту наявності білкових компонентів за відносними електрофоретичними ру Коефіцієнт ідентифікації 3,29 2,10 5,92 3,69 4,12 3,93 2,21 3,88 3,39 3,52 3,38 1,68 хомостями, які наведено втабл 2 Визначаємо для кожної лінії коефіцієнт іден 57636 тифікацм за формулою І=П 11 = де І - коефіцієнт ідентифікації, P. - відносна частота наявності білкових компонентів за електрофоретичними рухомостями, і - КІЛЬКІСТЬ білкових компонентів Визначаємо коефіцієнт ідентифікації для лінії П502 1=0,917 log2 0,917+0,583 Іод2 0,583+0,25 Іод2 0,25+0,833 Іод2 0 833+0,833 Іод2 0,833+0,167 Іод20,167+0,75 Іод20,75+1 Іод21 +0,833 Іод20,833+0,333 Іод2 0,333+0,5 Іод20,5=3,29 8 В таблиці 3 наведено результати підрахунків коефіцієнтів ідентифікації 12 самозапилених ЛІНІЙ За значенням коефіцієнту ідентифікації проводимо класифікацію самозапилених ЛІНІЙ Джерела інформації 1 Конарев В Г Белки растений как генетические маркеры//Белковые маркеры в сортовой идентификации, семеноводстве и семенном контроле -М Колос, 1983 -С 269-290 2 Перуанский Ю В, Савин Н В Зеиновые формулы самоопыленных линий кукурузы //Докл ВАСХНИП -1984 -№12 -с 10-11 D ФІГ. Комп'ютерна верстка М Мацело Підписано до друку 05 07 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна