Кон’югат рекомбінантних поліпептидів-аналогів поверхневих білків антигенів treponema pallidum, мічених ферментом пероксидазою

Кон'югат рекомбінантних поліпептидів - аналогів поверхневих білків антигенів Treponema palhdum, мічених ферментом пероксидазою, який відрізняється тим, що окислена перйодатом натрію пероксидаза з'єднується з рекомбінантними поліпептидами-аналогами поверхневих білків р47 та р17 Treponema pallidum, що забезпечує одночасне виявлення всіх класів імуноглобулінів в сироватці або плазми крові людини при проведенні імуноферментного аналізу Винахід належить до імунохімії, охорони здоров'я та може бути використаний при створенні діагностичних тест-систем для визначення наявності специфічних антитіл усіх класів імуноглобулінів до збудника сифілісу Treponema pallidum у зразках сироваток та плазми крові людини методом імуноферментного аналізу ВІДОМІ кон'югати специфічних або антивидових антитіл, а також білку A Staphylococcus aureus з ферментом окисленої перйодатом натрію пероксидазою [1] В основу винаходу поставлено завдання створити високоефективні кон'югати пероксидази з рекомбінантними поліпептидами - аналогами поверхневих білків антигенів Treponema pallidum, які можливо було б використати для створення діагностичних тест-систем з метою виявлення специфічних антитіл усіх класів імуноглобулінів до Treponema pallidum методом імуноферментного аналізу Поставлене завдання вирішують шляхом кон'югації рекомбінантних поліпептидів - аналогів поверхневих білків р47 та р17 Treponema pallidum з окисленою пероксидазою Приклад 1 Спосіб отримання кон'югату рекомбшантного поліпептиду р47, що є аналогом поверхневого білка антигена Treponema pallidum, з пероксидазою Синтез кон'югату проводять за відомою методикою [2] До розчину пероксидази в 0,1 М ІЧаНСОз, рН 8,1 з концентрацією 10 - 20мг/мл додають однаковий об'єм 8 - ЗОмМ розчину перйодату натрію, витримують у темряві при 20°С протягом 2 годин і потім змішують з розчином рекомбінантного поліпептиду р47 у 0,1 М карбонат-бікарбонатному буфері (рН 9,6) у співвідношенні 2М/1М, ВІДПОВІДНО Переносять суміш у хроматографічну колонку з закритим вихідним отвором, додають сухий сефадекс G-25 у КІЛЬКОСТІ 1/4 - 1/5 від загальної ваги суміші, закривають колонку і витримують у темряві при 19 - 22°С протягом 3 - 1 9 годин Потім проводять елюцію кон'югату згаданим буфером, блокують ВІЛЬНІ реакційні групи, додаючи розчин NaBH4 у 0,1 мМ NaOH з концентрацією 5мг/мл - спочатку 1/20 частину від об'єму кон'югату (ЗО хвилин при 0°С), а потім 3/20 від об'єму кон'югату (1 година при 0°С) Після ЧОГО діалізують кон'югат при 4°С проти 0,1 М фосфатного буферу (рН 7,2) 20 - 24 години Додають стабілізатори і зберігають кон'югат у рідкому стані при 0 - 10°С протягом 6 МІСЯЦІВ Приклад 2 Спосіб отримання кон'югату рекомбінантного поліпептиду р17, що є аналогом білка антигена Treponema pallidum, з пероксидазою Всі процедури виконують аналогічно прикладу 1 Пропоновані кон'югати порівнювали з кон'югатом білку А з пероксидазою Порівнювали чутливість та специфічність визначення антитіл проти антигенів Treponema pallidum в сироватках та плазми крові людини Дослі 1 CO (О 1^ Ю джено вибірку з 1200 реактивних сироваток та вибірку з 2020 сироваток, що включають набір негативних та потенційно хибнореактивних сироваток, які не містять антитіл до Treponema palhdum сироватки отримано від різних контингентів осіб донорів, вагітних жінок, від хворих на туберкульоз, ревматоїдний артрит, гепатити С і В, СНІД, а також від онкологічних хворих Визначення проводили за відомою методикою [3] твердофазного імуноферментного аналізу Показано, що пропоновані кон'югати підвищують чутливість тест-системи до 99,8%, а специфічність - до 99,6% в порівнянні з 99,0% і 98,0%, коли застосовано кон'югату білку А з пероксидазою Таким чином, пропоновані кон'югати забезпечують більш надійне виявлення антитіл (незалеж Комп'ютерна верстка М Клюкш 57637 но від класу імуноглобулінів - Ig G, Ід А або Ід М) в сироватці та плазми крові людини Використана література 1 Wilson MB and Nakane P К In the "Immunofluorescence and Related Techniques" (Knapp W, Holubar К and Wick G , eds), Elsevier, Amsterdam/New-York, p 215-221 2 Tijssen P and Kurstak E Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidase and active peroxidase-antibody conjugates for enzyme immunoassays Analyt Biochem 1984, vol 136, pp 451 - 457 3 AT Михайлов, В Н Симирский "Методы иммунохимического анализа в биологии развития" - М "Наука", 1981 Підписано до друку 05 07 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна