Спосіб визначення активованих т-хелперів в організмі людини

Спосіб визначення активованих Т-хелперів в організмі людини, який включає забір крові з вени з антикоагулянтом; виділення з неї лімфоцитів; постановку реакції розеткоутворення шляхом додавання до лімфоцитів еритроцитів барана, які кон'юговані з моноклональними антитілами проти CD4 структури Т-хелперів, з центрифугуванням суміші клітин та тепловою і холодовою інкубаціями; приготування препаратів шляхом видалення надосаду, фіксації клітин глютаровим альдегідом, U 1 3 на систему зору (потрібно розрізняти клітини, які люмінесціюють, на темному фоні); - багатоетапність методу: інкубація з моноклональними антитілами, інкубація з антисироваткою кози, міченою флуорохромом ФІТЦ, відмивка від реагентів; - отримання тимчасових препаратів, що не дозволяє відкласти їх аналіз; - необхідність використання люмінесцентного мікроскопа. + Відомий спосіб визначення CD4 субпопуляції Т-лімфоцитів (Т-хелперів) в організмі людини (П.Р. Новиков, О. К. Новиков. Сравнительная характеристика современных методов иммунофенотипирования // Иммунопатология. - 2000. - № 1. - С. 49.), який включає: забір крові з вени з антикоагулянтом; виділення з неї лімфоцитів; постановку реакції розеткоутворення з еритроцитами барана, які кон'юговані з моноклональними антитілами проти CD4 структури Т-хелперів (еритроцитарний діагностикум "Ahth-CD4") з тепловою інкубацією, центрифугуванням суміші клітин та з наступною холодовою інкубацією; приготування препаратів шляхом видалення надосадової рідини, фіксації осаду 0,12 % розчином глютарового альдегіду в кількості 0,025 мл та його перемішування, експозиції протягом 5 хв. при кімнатній температурі, повторного перемішування суспензії клітин, нанесення її на предметне скло, висушування та фіксації етанолом протягом 10 хв., фарбування за Романовським-Гімза; мікроскопування під світловим мікроскопом 200 лімфоцитів, визначення Тхелперів, якими є лімфоцити, що приєднали 3 і більше еритроцитів барана. Спільними із запропонованим рішенням ознаками є: - забір крові з вени з антикоагулянтом; - виділення з неї лімфоцитів; - постановка реакції розеткоутворення шляхом додавання до лімфоцитів еритроцитів барана, які кон'юговані з моноклональними антитілами проти CD4 структури Т-хелперів (еритроцитарний діагностикум "Ahth-CD4") з наступним центрифугуванням суміші клітин та тепловою і холодовою інкубаціями; - приготування препаратів шляхом видалення надосаду, фіксації клітин глютаровим альдегідом, нанесення суспензії клітин на предметне скло; фарбування за Романовським-Гімза; - мікроскопування під світловим мікроскопом; - визначення кількості Т-хелперів. Недоліками способу є: недостатня точність + виявлення загальної кількості CD4 клітин (Тхелперів), спосіб не дозволяє виявляти активовані Т-хелпери. Причинами, що перешкоджають досягненню результатів, є: - фіксація осаду клітин 0,025мл 0,12 % розчином глютарового альдегіду з перемішуванням клітин призводить до руйнування частини "розеток", а взаємодія ліганду CD4 на Т-хелперах і моноклонального антитіла до CD4 на еритроцитах барана є не ковалентною, а електростатичною, тому це не + дозволяє реєструвати всі потенційні CD4 клітини; 62663 4 - врахування всіх лімфоцитів, які приєднали 3 і більше еритроцитів барана з еритроцитарного діагностикуму "Ahth-CD4", до яких входять як неактивовані тривалоциркулюючі клітини пам'яті, так і активовані Т-хелпери, які утворені в імуногенезних реакціях лімфоцитів на час обстеження. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення активованих Тхелперів в організмі людини, який шляхом постановки реакції розеткоутворення з еритроцитарним діагностикумом "Ahth-CD4", фіксації глютаровим альдегідом у концентрації, що дозволяє зберігати утворені розетки та відмивки клітин білковим розчином; приготування препаратів клітин крові, визначення серед розеткоутворюючих клітин тих, що приєднали 8 та більше еритроцитів барана, дозволяє точніше визначати стан імунітету та проводити експрес-діагностику його функціонального рівня. Суттєвими ознаками способу є: - забір крові з вени з антикоагулянтом; - виділення з неї лімфоцитів; - постановка реакції розеткоутворення шляхом додавання до суспензії лімфоцитів еритроцитарного діагностикуму "Анти-CD4" на розчині сироваткового білка в середовищі 199, центрифугування отриманої суміші клітин та інкубації осаду в термостаті та в холодильнику; - приготування препаратів шляхом фіксації осаду клітин 0,6 % розчином глютарового альдегіду на середовищі 199 при рН 7.2, видалення надосаду, його відмивання розчином сироваткового білка на дистильованій воді, нанесення суспензії клітин на предметне скло, їх фіксації метанолом, інкубації препарату у фосфатному буфері при рН 6,8, фарбування препарату розчином Романовського-Гімза, диференціювання препаратів; - мікроскопування препарату під світловим мікроскопом; - визначення розеткоутворюючих клітин Тхелперів, до яких відносять ті, що приєднали 3 і більше еритроцитів барана; - визначення серед них активованих Тхелперів за кількістю лімфоцитів, що приєднали 8 і більше еритроцитів барана. Відмінними від прототипу ознаками є: - постановка реакції розеткоутворення на розчині сироваткового білка в середовищі 199 з безпосереднім центрифугуванням отриманої суміші клітин після змішування лімфоцитів з еритроцитарним діагностикумом; - приготування препаратів шляхом фіксації осаду клітин 0,6 % розчином глютарового альдегіду на середовищі 199 при рН 7.2 з подальшим видаленням надосаду та його відмиванням розчином сироваткового білка на дистильованій воді, фіксації за допомогою метанолу, інкубації препарату у фосфатному буфері при рН 6,8, диференціювання зафарбованих препаратів; - визначення серед них активованих Тхелперів за кількістю лімфоцитів, що приєднали 8 і більше еритроцитів барана. Спосіб здійснюють таким чином: виконують забір не менше 2 мл крові з вени з антикоагулянтом, наприклад з гепарином у кількості 0,02 мг/мл, 5 виділяють з неї лімфоцити, здійснюють постановку реакції розеткоутворення, для чого готують суспензію лімфоцитів з концентрацією клітин 2 млн/мл в середовищі 199 з 15-20% розчином ембріональної телячої сироватки, до отриманої суспензії у кількості не менше 0,050 мл додають рівну кількість 0,5 % суспензіїї еритроцитарного діагностикуму «Ahth-CD4», отриману суспензію клітин центрифугують протягом 5-5,5 хв. при 1000 об/хв, інкубують осад 25-27 хв. у термостаті при Т+37-37,5 °С протягом 60-65 хв. та потім у холодильнику при Т+4°-6 °С; готують препарати шляхом фіксації осаду клітин 0,6 % розчином глютарового альдегіду у середовищі 199 при рН 7.2, яке забезпечують додаванням концентрованого розчину харчової соди, з витримуванням протягом 710 хв. при кімнатній температурі, видалення надосаду та відмивання його 15-20 % розчином сироваткового білка на дистильованій воді, перемішування осаду без утворення піни, нанесення суспензії клітин на предметне скло, прискореного висушування суспензії клітин, наприклад, тепловентилятором, фіксації клітин метанолом протягом 3-5 хв., інкубації у фосфатному буфері при рН 6,86,9 протягом 2-3 хв., фарбування 10 % розчином Романовського-Гімза на фосфатному буфері (рН 6,8) протягом 4-6 хв., диференціювання препаратів у підкисленій воді (1 крапля концентрованої соляної кислоти на 300 мл дистильованої води) протягом 1-2 с з наступним триразовим промиванням препарату в дистильованій воді; мікроскопують під світловим мікроскопом не менше 200 лімфоцитів; визначають розеткоутворюючі клітини, до яких відносять ті, що приєднали 3 і більше еритроцитів барана, з них визначають активовані, до яких відносять такі, що приєднали 8 і більше еритроцитів барана. Імунологічне обґрунтування способу. Згідно з стереотипною реакцією імуногенезу на антигенне або мітогенне подразнення лімфоцит проходить такі стадії: - розпізнавання подразника; - активація клітини; - баластна трансформація; - серія мітотичних поділів; - диференціювання; - міграція; - імунна відповідь. При активації лімфоциту стимулюється білоксинтетична система клітини, в результаті на її мембрані підвищується щільність рецепторів та інших структур, серед яких і CD4 структури, якщо лімфоцит належить до Т-хелперів. Внаслідок цього активований Т-хелпер має здатність всією поверхнею адсорбувати еритроцити барана, кон'юговані з моноклональними антитілами (МКАТ) до CD структур з утворенням фігур повних, часто багатошарових, розеток. На мембранах неактивова 62663 6 них Т-хелперів CD4 представлені в меншій щільності, тому вони здатні утворювати неповні розетки, які характеризуються приєднанням від 3 до 7 еритроцитів барана. Це підтверджує запропонова+ не положення, що CD4 лімфоцити, які приєднали 8 і більше еритроцитів барана, належать до активованих. Приклад виконання способу. Імунологічне обстеження проводили у 20 жінок, хворих на гіпертонічну хворобу II стадії, до та після курсу патогенетичної терапії. Для цього здійснювали забір 10 мл крові з вени з антикоагулянтом - гепарином у кількості 0,02 мг/мл, виділяли з неї лімфоцити, які використовували для проведення порівняльних досліджень за запропонованим способом і способами непрямої люмінесценції із застосуванням моноклональних антитіл проти + CD4 (аналог) та розеткового з еритроцитарним діагностикумом "Ahth-CD4" (прототип). Для виконання дослідження за запропонованим способом здійснювали постановку реакції розеткоутворення, для чого готували суспензію лімфоцитів з концентрацією клітин 2 млн/мл у середовищі 199 з 20 % розчином ембріональної телячої сироватки, до 0,050 мл отриманої суспензії додавали рівну кількість (0,050 мл) 0,5 % суспензії еритроцитарного діагностикуму "Ahth-CD4», здійснювали центрифугування отриманої суспензії клітин протягом 5 хв. при 1000 об/хв., інкубацію осаду протягом 25 хв. в термостаті при Т+37 °С та протягом 60 хв. у холодильнику при Т+6 °С; готували препарати шляхом фіксації осаду клітин 0,6 % розчином глютарового альдегіду на середовищі 199 при рН 7.2, яке забезпечували додаванням концентрованого розчину харчової соди, при кімнатній температурі з витримуванням протягом 10 хв., здійснювали видалення надосаду та відмивали осад 20 % розчином сироваткового білка на дистильованій воді, перемішували осад без утворення піни, наносили суспензію клітин на предметне скло, здійснювали прискорене висушування суспензії клітин тепловентилятором, фіксували клітини метанолом протягом 5 хв; інкубували у фосфатному буфері при рН 6,8 протягом 2 хв., фарбували препарати 10 % розчином Романовського-Гімза на фосфатному буфері (рН 6,8) протягом 6 хв., диференціювали препарати у підкисленій воді (1 крапля концентрованої соляної кислоти на 300 мл дистильованої води) протягом 2 с з наступним триразовим промиванням препарату в дистильованій воді; мікроскопували під світловим мікроскопом не менше 200 лімфоцитів, серед яких визначали розеткоутворюючі, до яких відносили ті, що приєднали 3 і більше еритроцитів барана, з них визначали активовані, до яких відносили такі, що приєднали 8 і більше еритроцитів барана. Дані наведені в таблиці. 7 62663 8 Таблиця Визначення субпопуляції Т-хелперів крові людини № з/п 1 2 3 Протестована субпо- Кількість визначених лімфоцитів, % пуляція До терапії Після терапії Непряма люмінесценція із застосуванням Т-хелпери, всі 31,6±2,2 33,4±2,4 + моноклональних проти CD4 - аналог в т. ч. активовані 6,5±1,0 7,0±1,1 Розетковий з еритроцитарним діагности- Т-хелпери, всі 29,5±3,1 27,5±2,6 кумом " Ahth-CD4" - прототип Запропонований спосіб Т-хелпери, всі 40,0±2,1 35,2±1,7* в т. ч. активовані 19,4±1,4 13,3±1,1* Спосіб визначення Т-хелперів Примітка: * - відмінності показників достовірні до і після терапії, р