Спосіб визначення забруднення грунтів важкими металами

Винахід відноситься до фітоіндикації, фітотоксикології, охорони генофонду рослин природної флори та може бути використаний для тестування токсичних ефектів важких металів на основі ідентифікування індукованого ними атипового поліморфізму структурних елементів провідної системи листкової пластинки рослин, а також для визначення оптимальних концентрацій важких металів, прогнозування наслідків токсикогенних трансформацій будови рослин природної флори. Відомі способи біоіндикації важких металів, наприклад нікелю, за допомогою визначення особливостей епікутикулярного воску листкових пластинок рослин, що зростають у контрастних геохімічних умовах [1], детально досліджено структур у асиміляційного апарату рослин в умовах техногенного навантаження [2], зроблені спроби з'ясування механізмів продихових р ухів рослин, що пов'язується з особливостями виду та специфікою впливів екологічних факторів [3]. Також визначено, що структура і функції епідермісу листка залежать від умов зростання рослини [4]. Морфо-анатомічні особливості рослин, що зростають на збагачених важкими металами ґрунтах, було досліджено Н.С. Петруніною [5]. До того ж, фітоіндикаційне визначення з метою тестування екологічних факторів рекомендовано проводити за умов побудови індикаційних шкал, що продемонстровано у симфітоіндикаційному аспекті [6, 7]. Розроблені чисельні вимоги добору рослин в якості індикаторів [8]. Фундаментально досліджено структур у ксилемних та флоемних елементів листкових пластинок багатьох рослин [9-12], де зазначається слабка вивченість будови внутрішніх тканин листка за умов дії різноманітних чинників, у тому числі факторів стресу. Для аналізу забруднення ґрунтів важкими металами найбільш вдалими тест-об'єктами є рослини [8]. Найбільш близьким за технічною сутністю і досягненням результату є спосіб біоіндикації важких металів за реакцією продихового апарату рослин-індикаторів, що зростають у розчинах з різними концентраціями металівтоксикантів. За цим способом використовують відірвані листки гороху та хрінниці у фазі плодоношення, які зростають в умовах штучного клімату на ґрунтови х розчинах з різними концентраціями важких металів, причому матеріалом для цитологічних досліджень було обрано епідерміс нижньої сторони листкової пластинки рослин [13]. Недоліками цього способу є мала достовірність при аналізі проб саме продихового апарату, будова якого може залежати від багатьох екологічних факторів, наприклад, освітлення, вологості, які складно зберігати однорідними в умовах природного зростання рослини [3, 4]; а також малий асортимент важких металів (тільки Cd, Hg, Ni та Pb), на розчинах яких проводився дослід [13]. В основу винаходу поставлена задача визначення забруднення ґрунтів важкими металами та поліпшення методів оцінки факторів стресу навколишнього середовища за допомогою рослин природної флори на прикладі Cichorium intybus L., де обліку підлягають не впроваджені раніше показники змін будови листкової пластинки, а рослинні збори проводять як з об'єктів, які сформовані у штучних умовах, так і з рослин природних місцезростань з посиленим металопресингом на ґрунти; та за рахунок цього використання способу дозволить більш точно встановлювати ступінь забруднення важкими металами в природних умовах, прогнозувати стр уктурні трансформації рослин техногенних екотопів, оцінити специфіку металевого забруднення на антропогенне змінених територіях. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення забруднення ґрунтів важкими металами, який містить аналіз атипового поліморфізму листкових пластинок рослини-індикатора та свідчення за даними обліку й статистичної обробки про наявність структурно трансформуючого ефекту, відповідно винаходу для визначення віддалених та безпосередніх наслідків впливу факторів середовища, зокрема важких металів, використовують в якості тест-системи індекс атиповості за розробленою 10-бальною індикаційною шкалою для структурних елементів дрібних жилок листкових пластинок, а саме показник! гетерогенності трахеальних елементів (ГТЕ) та деформованості термінальної флоеми (ДТФ), та за цими індексами визначають ступінь та специфіку забруднення ґрунтів важкими металами. Спосіб оснований на тому, що для визначення віддалених та безпосередніх наслідків впливу факторів середовища, зокрема важких металів, використовують в якості тест-системи індекс атиповості за розробленою 10-бальною індикаційною шкалою для структурних елементів дрібних жилок листкових пластинок, а саме показники гетерогенності трахеальних елементів (ГТЕ) та деформованості термінальної флоеми (ДТФ), та за цим індексом визначають ступінь та специфіку забруднення ґрунтів важкими металами. Особливості визначення, знаходження та диференціювання дрібних жилок листкової пластинки з'ясовано за літературними джерелами [9-12]. Приклад. Вказаний спосіб визначення забруднення ґрунтів важкими металами було проведено на рослині Cichorium intybus L., що вирощували на території промислових майданчиків Артемівського та Костянтинівського районів у наступних пробних площах: СЕРЕБ - сільський населений пункт Серебрянка, долина р. Сіверський Донець (контроль); ЛУГ - населений пункт міського типу Луганське, ділянка степового типу рослинності (контроль); НОВ - сільський населений пункт Новогригорівка, ділянка степового типу рослинності (контроль); ЧАС - Часовярський вогнетривкий комбінат; ПТ -Артемівський машинобудівний завод "Победа труда"; РК рудеральний комплекс Артемівського центрального звалища сміття; ОКМ - Ар темівський завод з обробки кольорових металів; АВТ - автовокзал м. Артемівськ; АСЗ -Артемівський скляний завод; ГПВД - рудник виробничого об'єднання "Південний"; КСЗ - Костянтинівський механізований скляний завод; УКЦ Костянтинівський завод "Укрцинк"; КАВТ - авто вокзал м. Костянтинівка. Обрані рослини з контрольних місць зростання додатково вирощували в лабораторних умовах на нітратних металоносних субстрата х з концентраціями Рb-500, Zn-500, Cd-10, Ni-300, Cr-300, Mo-10, Fe-200, Mn-4000, Сu-300, Hg-5мг/кг. Вміст металів у субстраті обумовлений гранично допустимими концентраціями [14-16] з поправкою на місцеві стандарти та фонові рівні [17]. Повторність лабораторного експерименту дорівнювала 5. Для встановлення індикаторних індексів обиралися листкові пластинки серединної формації в період квіткування особин (червень-липень). Для аналізу використовували 30 листкових пластинок. Препарати готували за загальноприйнятими цитологічними методиками [18, 19]. Увесь спектр атипового поліморфізму обраних ознак поділяли на 10 типових перехідних станів, що зазначено на фіг.1 для ГТЕ, де MX - елементи метаксилеми, РХ - елементи протоксилеми, КП - кільце потовщення, П специфічне потовщення ксилемних елементів внаслідок "розриву" кільця потовщення, та фіг.2 для ДТФ, де Ф клітини флоемної паренхіми, СЕ - ситоподібні елементи, А - апопластний лабіринт з специфічних вип'ячувань ("протуберанців") клітинної стінки, і - клітини-супутниці типу intermediary, t - клітини-супутниці типу transfer. У нормі трахеїда або група з декількох трахеїд розташовані на рівні клітин внутрішнього ряду губчастої паренхіми. Шар губчастої паренхіми, що знаходиться у контакті з ксилемою, набуває структури, яка специфічна відносно інших її шарів. В середині пучків ксилемні елементи безпосередньо контактують з флоемними. Камбію на той час вже не залишається, як у великих жилках, так і стеблових пучках. Склеренхімні елементи теж не зустрічаються в пучках даного типу. У контакті з трахеїдами знаходяться тільки клітини спеціалізованої (міжпучкової) паренхіми. В умовах те хногенне трансформованих екотопів Донбасу для Cichorium intybus нами було визначено значні зміни будови ксилемної частини дрібних жилок, перехідні форми з усього діапазону варіації ознаки адаптовано для десятьох типів, що відповідають індексам гетерогенності трахеальних елементів. Так, тип 1 - нормальна будова ознаки, 2 та 3 - перехідні зміни кільця протоксилеми, 4 - поява двох метаксилемних утворень, 5 перехідна форма, 6 - часткові розриви протоксилемного кільця. Подальша ускладненість або ступінь гетерогенності відбуваються у збільшенні кількості метаксилемних утворювань, розривах кільця протоксилеми, морфологічної гетерогенності ксилемних елементів, що зображено на фіг.1. У флоемних елементах в нормі клітини-супутниці, які діаметрально протистоять одна одній, в літературі описані як transfer cells для термінальної флоеми [10-12]. Їх основна ознака - наявність апопластного лабіринту з виростів ("протуберанців") клітинної стінки. Після визначення та аналізу суттєви х відмінностей transfer cells та intermediary cells (супутників закритого та відкритого типів) Ю.В. Гамалеєм [10] було описано особливості завантаження флоеми у симпластних та апопластних рослин. Супутники типу transfer cells використовуються як головна діагностична ознака при відношенні рослини до посуненої апопластної групи. На відміну від терміналей intermediary cells типу, де кожна ситоподібна трубка має один супутник, а у пучках transfer cells кожна ситоподібна трубка має два симетричних супутника, які розташовані по обидва боки від неї, тобто співвідношення кількості ситоподібних трубок до кількості клітин-супутниць є 1:2. Блоки із ситоподібної трубки та двох супутників розташовані декількома рядами, поділеними між собою клітинами флоемної паренхіми. Нами було визначено зміну будови термінальної флоеми, але не зміну її типу. Так, згідно рисунка 2, основними ознаками, за якими визначається перехід та розподіл на 10 форм, були наступні: 1) початкове зменшення розміру блоку термінальної флоеми, 2) потоншення та видовження клітин флоемної паренхіми, 3) збільшення кількості останніх, 4) зменшення розміру ситоподібних елементів, 5) гетерогенність морфології усіх складових компонентів, 6) зсунення вісі флоемного утворення та наприкінці - поява клітин-супутниць типу intermediary, що можливо відбувається лише морфологічно внаслідок складної атипової будови, трансформація якої, на нашу думку, відбувається під впливом факторів стресу, не виключаючи основний фактор - забруднення ґрунтів важкими металами. На думку Ю.В. Гамалея [11], ознаки будови дрібних жилок листка дуже консервативні та таксоноспецифічні, але ж у нашому дослідженні суттєво типи будови не змінюються, однак відбувається диференціація самого типу. Дослідження 1998-2002pp. довели, що ці ознаки мають суто фенотипічний характер прояву та не спадкуються. В таблиці 1 представлені індекси атипового структурного поліморфізму Cichorium intybus для показників ГТЕ та ДТФ за результатами натурного експерименту. Таблиця 1 Ознаки ГТЕ ДТФ СЕРЕБ ЛУГ НОВ ЧАС ПТ 1 1 1 1 1 1 1 7 10 10 Пробні площі РК ОКМ АВТ Індекси 9 7 1 10 10 1 АСЗ ПІВД КСЗ УКЦ КАВТ 8 2 1 2 1 7 4 10 1 1 З таблиці 1 видно, що мінімальні індекси атипової будови відповідають контрольним зонам дослідження. Ступінь трансформованості структурних елементів провідної системи листкової пластинки залежить від територіального розташування особин та місця збору рослинного матеріалу. В таблиці 2 представлені дані лабораторного експерименту - безпосереднього впливу важких металів на будову дрібних жилок тест-рослини. Таблиця 2 Ознаки ГТЕ ДТФ Рb 1 1 Zn 1 6 Cd 2 1 Ni 2 8 Cr 10 1 Метали Mo 1 1 Fe 1 1 Mn 1 1 Сu 1 10 Hg 1 1 З таблиці 2 видно, що поява деформованості специфічна в залежності від чинника - важкого металу. Здебільшого ГТЕ залежить від концентрації Cr, а ДТФ-Сu та дещо Ni та Zn. Позитивний ефект проявляється в тому, що на відміну від відомого запропонований спосіб дозволяє диференційовано тестувати забруднення ґрунтів хромом, міддю та визначати віддалені ефекти нікелю та цинку. Він може використовуватися у натурному (природному) біомоніторингу для експрес-діагностики металопресингу, що дуже актуально для територій з посиленим антропогенним впливом техногенне трансформованих екотопів. Використання способу дозволить більш точно виділяти зони хромового, мідного, нікелевого та цинкового забруднення, проводити оцінку та постійний моніторинг стану довкілля природних та техногенне змінених територій. Джерела інформації 1. Кравкина И.М. Эпикутикулярный воск и кутикула листа растений Полярного Урала, произрастающий в контрастных геохимических условиях // Бот. ж урн. - 2000. - 85, №7. - С.118-124. 2. Гетко Н.В. Растения в техногенной среде. Структура и функции ассимиляционного аппарата. - Минск: Наука и техника, 1989. - 205с. 3. Журавлева Н.А. Ме ханизм устьичных движений, продуктивный процесс и эволюция. - Новосибирск: Наука, 1992. - 141с. 4. Мирославов Е.А. Стр уктура и функция эпидермиса листа покрытосеменных растений. - Л.: На ука, 1974. 184с. 5. Петрунина Н.С. Морфолого-анатомические особенности растений, произрастающих на почвах, обогащенных тяжелыми металлами // Теоретические вопросы фитоиндикации. - Л.: Наука, 1971. - С.142-148. 6. Дідух Я.П. Методологічні підходи до проблеми фітоіндикації екологічних факторів // Укр. бот. журн. - 1990. 47, №6. - С.5-12. 7. Дідух Я.П., Плюта П.Г. Фітоіндикація екологічних факторів. К.: На ук. думка, 1994.-280с. 8. Цаценко Л.В., Филипчук О.Д. Биоиндикация и "генетический скрининг" загрязнения компонентов агроценоза // Сельскохозяйственная биология. - 1997. -№5. - С.33-47. 9. Гамалей Ю.В. Цитологические основы дифференциации ксилемы. - Л.: Наука, 1972. - 144с. 10. Гамалей Ю.В. Флоэма листа: развитие структуры и функций в связи с эволюцией цветковых растений. Л.: Наука, 1990. - 144с. 11. Гамалей Ю.В. Таксономическая и экологическая специфичность структур и функций растений // Бот. журн. - 1999. - 84, №6. - С.1-7. 12. Гамалей Ю.В. Сравнительная анатомия и физиология терминальных пучков и околопучковой паренхимы в листьях двудольных растений // Бот. журн. - 2000. - 85, №7. - С.34-49. 13. Павловская Н.Е., Голышкин Л.В., Дегтярева С.И. Реакция устьичного аппарата листьев гречихи и гороха на загрязнение тяжелыми металлами // Сельскохозяйственная биология. - 1997. - №5. - С.48-52 (прототип). 14. Дудик A.M. Временные методические рекомендации по геолого-экологическим работам в пределах горнопромышленных районов Украины. - Донецк: Б. и., 1992. - 105с. 15. Дорошко Т.Ю. Предельно допустимые концентрации тяжелых металлов в почве и её защита от загрязнения // Медицинский журнал Узбекистана. - 1991. - №7. - С.40-42. 16. Кабата-Пендиас А., Пендиас X. Микроэлементы в почвах и растениях. - М.: Мир, 1989. - 439с. 17. Сафонов А.И. Особенности локализации некоторых металлов-токсикантов в почвах северных промышленных узлов Донбасса // Экологическая и техногенная безопасность. Сб. научн. тр. Международн. научно-практ. конференции. - Харьков: Изд-во Харьк. ин-та социального прогресса, 2000. - С.131-135. 18. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. - М.: Агропромиздат, 1988. - 271с. 19. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г. Основы микроскопических исследований в ботанике. - М.: Наука, 2000. - 128с.