Спосіб мікробіологічної індикації забруднення грунтів важкими металами

Спосіб мікробіологічної індикації забруднення грунтів важкими металами шляхом визначення швидкості ферментативної реакції окислення грунтом аскорбінової кислоти в дегідроаскорбінову, який відрізняється тим, що як стабілізатор цієї реакції застосовують етилендіамінтетраацетат в кількості 3 мл 0,1 Н розчину трилону Б на реакційну суміш (1 г гр унту, 2 мл 0,2% розчину аскорбінової кислоти, 10 мл 2% розчину сірчаної кислоти). (19) (21) 96124895 (22) 26.12.1996 (24) 15.11.2000 (33) UA (46) 15.11.2000, Бюл. № 6, 2000 р. (72) Андріюк Катерина Іванівна, Іутинська Галина Олександрівна, Валагурова Олена Володимирівна, Козирицька Валентина Євгенівна (73) ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО 29703 1 г гр унту, який був просіяний через сито з дірочками 0,25 мм, інкубують з 2 мл 0,2% розчину аскорбінової кислоти. Одночасно інкубують контролі: стерильний грунт з субстратом і субстрат без грунту. Грунт контролю стерилізують в автоклаві при 0,5 атм. протягом 1 години. Інкубацію суміші реагентів проводять при температурі +30°С протягом 1 години. В кінці інкубації ферментативну реакцію зупиняють додаванням 10 мл 2% розчину сірчаної кислоти (H2SO4). Для стабілізації системи "аскорбінова кислота-дегідроаскорбінова кислота" в суміш реагентів додають етилен-діамінтетраацетат (3 мл 0,1 Н розчину трилону Б). С уміш струшують і фільтрують. У фільтраті визначають залишок аскорбінової кислоти йодатометричним методом. Титрування аскорбінової кислоти проводять йодид-йодатною сумішшю в присутності крохмалю. В розрахунках виходять з того, що 1 мл 0,001Н йоду, а також йодату еквівалентний 1 мл 0,001Н розчину аскорбінової кислоти. Аскорбатоксидазну активність грунту розраховують за різницею між кількістю аскорбінової кислоти, яка розклалась в стерильному і нестерильному грунті. Аскорбатоксидазну активність грунту вимірюють в мг дегідроаскорбінової кислоти, яка утворилась за 1 годину в 100 г грунту. Визначення активності окислення аскорбінової кислоти в стерильному і нестерильному грун ті дозволяє вивчити дію мінеральної і органічної компоненти на цей процес. Наведені в табл. 2 дані свідчать про те, що присутність в грунті високих доз міді і кадмію призводить до збільшення кількості утвореної дегідроаскорбінової кислоти (ДГАК). Так, в стерильному грунті, де виключається дія ферментів, при забрудненні міддю кількість розкладеної аскорбінової кислоти була вище, ніж в незабрудненому в 1,6-2,6 рази. При внесенні в грунт іонів кадмію кількість утвореної ДГАК збільшувалась в 1,1-1,7 рази. Під кінець досліду вплив кадмію на окислювальну здатність грунту був незначний. Дослідження показали, що забруднення грунту важкими металами приводило до пригнічення активності аскорбатоксидази. При внесенні в грунт міді активність ферменту була на 10-34% нижчою порівняно з незабрудненим грунтом. При забрудненні кадмієм також відмічено зменшення аскорбатоксидазної активності в грунті по відношенню до контролю на 12-214%. Таким чином наведені приклади свідчать про те, що запропонований метод дає можливість визначити специфічну реакцію субстрату (аскорбінової кислоти) на присутність важких металів в грунті. Крім того, використання цього методу дає можливість визначити ступінь токсичного впливу важ ких металів на біологічну систему на рівні її ферментативної активності. Приклади використання: Запропонований метод використовувався для біоіндикації забруднення грунту в польовому досліді на темно-сірому опідзоленому грунті. Модельне забруднення грунту проводили внесенням розчинів солей важких металів за схемою, наведеною в табл. 1. Зразки грунту для аналізів відбирали на 2, 15 і 30 добу після модельного забруднення. Результати визначення аскорбатоксидазної активності грунту наведені в табл. 2. Таблиця 1 Схема польового досліду по вивченню впливу важких металів на мікрофлору грун ту Варіант досліду Контроль Cu2+ Cd2+ Hg2+ Кількість внесених в гр унт іонів важких металів, мг в 1 кг гр унту 1992 1993 Не вносили Не вносили 6 і 12 15 і 30 6 і 12 15 і 30 2,2 і 4,4 5,5 і 10,1 Гранично припустимий вміст металів, мг в 1кг грун ту 3,0 Від 3,0 до 5,0 Від 1,1 до 2,2 Таблиця 2 Вплив важких металів на аскорбатоксидазну активність грунту Варіант досліду Кількість розкладеної аскорбінової кислоти, мг ДГАК за 1 год. в 100 г гр унту в стерильному грун ті Контроль Забруднення Cu Коефіцієнт варіації Контроль Забруднення Cd Коефіцієнт варіації 2 92,4 138,6 2,2 203,9 232,6 2,5 15 91,5 223,1 1,9 61,8 105,0 1,4 в нестерильному гр унті 30 114,3 292,0 3,0 118,1 118,0 2,1 2 132,0 174,6 1,2 243,3 250,9 1,2 2 15 114,4 240,2 2,4 80,3 142,1 2,5 30 139,7 311,1 2,8 171,7 138,1 1,3 Аскорбатоксидазна активність грунту, мг ДГАК за 1 год. в 100 г гр унту 2 15 30 39,6 22,8 25,4 36,0 17,16 19,0 1,2 1,3 1,9 39,5 18,5 23,6 18,4 37,0 20,2 1,1 1,3 1,2 29703 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ __________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 __________________________________________________________ 3