Штам рsеudомоnаs меndосіnа, що використовується для очистки стічних вод від тетрагідрофурана

Изобретение относится к о б л а с ти биотехнологии, в ч а с т н о с т и , к б и о химической о ч и с т к е сточных вод о т тетрагидрофурана и нитратов„ Цель изобретения - получение штамма,обладающего более высокой д е с т р у к т и в ной активностью по отношению к т е т ,рагидрофурану в условиях денитрификации. Штамм Pseudomonas mendocina п о лучен селекцией из почвы и а к т и в н о - , го ила и депонирован под номером ВКПМ В-421К За 25 ч культивирования штамм полностью разрушает 100 м г / л тетрагидрофурана в условиях д е н и т р и фикации. 1 р и с . , I табл„ S (Л Изобретение относится к о б л а с т и биотехнологии, в частности к б и о химической о ч и с т к е сточных вод о т тетрагидрофурана и нитратов на п р е д приятиях, производящих или применяющих тетрагндрофуран, - Целью изобретения я в л я е т с я п о л у ч е ние штамма, обладающего более высокой деструктивной активностью по отношению к тетрагидрофурана в условиях денитрификации. Итамм Pseudomonas ciendocina ВКПМ В-42И получен в р е з у л ь т а т е селекции по способности использовать т е т р а гидрофуран в качестве единственного источника углерода в условиях д е н и т рификации и по способности а д г е э и р о ваться на волокнистой н а с а д к е . Селекцию осуществляли из почвы и а к т и в н о го и л а . Для э т о г о 30 г почвы и 30 мл а к тивного ила помещают в колбу ЭрленмеЙ4-90 1 ера объемом* 500 мл„ Туда же в н о с я т 5 г б а з а л ь т о в о г о или стеклянного в о локна для естественной иммобилизации микроорганизмов на его поверхности,. В колбу наливают с р е д у , содержащую, г / л : тетрагидрофурлн - 0 , 1 ; KNOj - 2 , НРО+ - 0 , 1 , MgS04 - 0 , 0 2 , FeSO* ~ 0 , 0 1 , СаС1 г - 0,01 до общего объема •500 мл (под п р о б к у ) . Культивируют в стационарных условиях при температуре 2 5 ° С После разрушения т е т р а г и д р о фурана жидкость выпивают и в колбу с носителем вносят свежую среду а н а логичного с о с т а в а (под пробку),' в к о торой концентрацию тетрагидрофурана увеличивают*вдвое» Деструкцию т е т р а гидрофурана осуществляют закрепившиеся на насадке микроорганизмы, содержащие н и т р а т р е д у к т а з у . По мере д е с т р у к ции тетрагидрофурана концентрацию е г о увеличивают в каждом последующем п а с саже до 4 0 0 , 6Q0, 8 0 0 , 1000 мгУл.Тет С О О 00 1540208 рагидрофуран в культуральной среде определяют колориметрически по реакции с парадиметилбензальдегидом. После установления постоянной скорости окисления тетрагндрофурана нитратами при его исходной концентрации в среде Ї000 мг/л в течение трех п а с сажей селекцию микроорганизмов прекращают. Жидкость из колбы полностью Ю удаляют и вносят 100 мл стерильного физиологического раствора. Колбу интенсивно встряхивают в течение 2 мин, отбирают 1 мл образовавшейся бактериальной суспензии, разбавляют в 10, 15 100, 1000, 10000 раз и засевают в 'трех повторностях на агаризованной среде следующего состава, г / л : (NH 4 )«HP0 4 - 0 , 1 ; MgSO* - 0 , 0 2 ; FeSO* - 0 , 0 1 ; CaCl 2 - 0,01*, KNO, - 2; 7.0 тетрагндрофуран - 1J агар-агар - 20; дистиллированная вода до 1 л ; рН 6*9-7,2. Чашки с засеянными микроорганизмами культивируют при 25°С. Выросшие в отдельные колонии мик• роорганнэмы шестикратно пересекают на плотной-,среде„ Получают биомассу чистых культур и изучают способность изолированных бактерий окислять т е т рагидрофуран нитратами пр.н росте в жидкой среде приведенного выше с о с тава. Отбирают культуры, наиболее быстро окисляющие тетрагидрофуран нитратами. В результате такой селекции выделен Штамм Pseudomonas mendocina 153» использующий тетрагидрофуран в условиях денитрификации в качестве единственного источника углерода и энергии. 40 Деструктивную активность штамма P.mendocina 153 изучают на синтетической среде следующего состава, г / л : (ЙН 4 ) 2 РНО 4 - 0 , 1 , MgSO*- 0,02, FeSQ,0 , 0 1 , СаС1а - 0 , 0 1 , KNO, - 2, тетра- 45 гидрофуран - 0 , 2 5 - 1 , дистиллированная вода до і л , рН - 6,9-7,2» Периодическбе культивирование осуществляют в анаэробных условиях при температуре 25°С и исходной концентрации бак 50 термальных клеток в среде 10* в мл. рітамм P.mendocina 153 депонирован в центральном музее промышленных микроорганизмов под номером В~**211 .Штамм имеет характерные свойства. Морфологические свойства штамма. Клетки одиночные, палочковидные, прямые, цепочек никогда не образуют (в изучаемых условиях), грамотрица тельные. Длина клеток варьирует от 1^3 до 3,3 мкм„ Толщина относительно одинакова - около 1,0 мкн. На синтетической среде с тетрагидрофураном клетки незначительно уменьшаются в размерах и приобретают слегка изогнутую форму. Культура подвижна, сочержит несколько полярных жгутиков. Культуральные свойства. На М А колонии желто-оранжевого П цвета 4-5 мм в диаметре, пигмент в среду не диффундирует,. На синтетической среде г. тетрагидрофураном колонии слабо пигментированы. При росте на ШВ образует небольшую пленку. осадок и равномерное помутнение среды. Фиэнолого-биохимиче'ские признаки. ~ Культура аэробная, способна использовать нитрат в качестве конечного акцептора электронов, каталиэо- и оксидазоложительнаяв Не накапливает поли-^-оксибутирата внутри клеток. Не гидролнзует крахмал и желатину. Источником углерода могут служить глюкоза, галактоза, сахароза, аргинин, L-валин. Не использует лактозу, рамнозу, маннозу, раффинозу, мальтоз у , салицин, инозит, инулит, сорбит, дульцит. Оптимум роста культуры 30 - 32 е С, Штамм P.mendocina 153 з а 25 ч культивирования полностью разрушает 1000 мг/л тетрагидрофурана в условиях денитрификации, используя его в качестве единственного источника углерода и энергии. Культура не п а тогенна, не токсична. П р и м е р 1 о Периодическое культивирование Р„mendocina 153 осуществляют на модельном растворе следующего состава, г / л : ( N H ^ A H P O * ~ 0»!'» MgSO4 " 0,02, FeSO 4 - 0 , 0 1 , CaCl t 0 , 0 1 , KNOj - 2 , тетрагндрофуран 0,25 - 1, дистиллированная вода до 1 л , рН - 6 , 9 - 7 , 2 . 5 колбу Эрленмейера объемом 500 мл, вносят волокнистую загрузку (базальтовое или стеклянное волокно), модельный раствор с концентрацией т е т рагидрофурана 250 мг/л и биомассу культуры P.Mendocina 153. Биомассу вносят в концентрации 10 кл/мл один раз в первом пассаже при концентрации тетрагидрофурана 250 мг/л. В последующих пассажах после полного р а з * рутения тетрагидрофурана жидкость удаляют и в колбу с загрузкой и з а крепившимися на ней микроорганизма 540208 6 Очистку осуществляют в цклнндричес кой емкости объемом 10 и, высотой 0,5 м, в которую помещают переплетенное базальтовое волокно, В установку вносят биомассу культуры P.mendocina 153 в концентрации 10 кл/мл. Сточную аоду подают в установку со скоростью разбавления 0,0! ч~ 4 и коню"центрацией тетрагидрофурана 1000 мг/л. 'Постепенно скорость разбавления уве- • ' личивают до 0,04 ч* 1 . Параллельно повышают содержание тетрагидрофурана в ней до 5000 мг/л, В вытекающей жид15 кости определяют тетрагидрофуран, ХПК, нитраты, нитриты. Эффективность работы биореактора приведена в таблице, из которой видно, что полное разрушение тетрагид20 рофурана в сточной воде культурой P.mendocina 153 при непрерывном культивировании происходит при исходной концентрации 5000 мг/л и скорости разбавления 0,04 ч" 1 , Х К при этом П 25 снижается на 86,3%. В очищенной воде полностью отсутствуют нитраты н нитриты. Очищенная таким способом вода П р и м е р 2.' Непрерывное кульможет быть направлена на традиционтивирование pDraendocina 153 осущестные биологические очистные сооружевляют на реальной сточной воде Кирнш- 30 ния 0 Увеличение скорости разбавления ского биохимзавода', содержащей до до 0,06 ч~* приводит к увеличению 5000 мг/л тетрагидрофурана. В настоХ К очищенной воды и появлению в ней П ящее время эти сточные воды сжигаютнитритов» Тетрагидрофуран в воде отся, повторно загрязняя окружающую сутствует. среду продуктами сгорания,, Такой меТаким образом, выделенный нами 35 тод обезвреживания сточных вод экоштамм P.mendocina 153 разрушает на номически невыгоден и экологически протоке до 4000 мг/л тетрагидрофунебезопасен„ рана в условиях денитрнфикации, - • В сточной воде предприятия, кроме Основной статьей экономии при тетрагидрофурана, содержатся в зна40 очистке сточных вод от тетрагидрофучительных количествах другие органирана с помощью культуры Pemendocina j ческие примеси, обуславливающие общее 153 является замена термического ХПКвИ(р около 15000 мг 0/л„ Концентобезвреживания сточных вод на Каршисрация нитратов достигает 2000 мг/л. ком биохимзаводе микробиологической Для эффективного протекания про45 очисткой. цесса очистки с помощью культуры . P.mendocina 153 в воду вносят нитраФ о р м у л а и з о б р е т е н и я ты в виде калийной селитры в соотношении с Х К 1:3. Другие необходимые П Штамм Pseudomonas mendocina В П КМ для жизнедеятельности культуры макро- 50 В-4211, используемый для очистки и микроэлементы не добавляют, так как сточных вод от тетрагидрофурана в они присутствуют в воде. условиях денитрификации. ми вносят свежую среду с увеличенной концентрацией тетрагидрофурана (500, 750, 1000 мг/л). Контроль разрушения тетрагидрофурана культурой осуществляют колориметрически. Результаты опытов приведены на чертеже. Из чертежа видно, что выделен•ный штамм Pemendocina 153 способен в периодических условиях культивирования очищать воду, содержащую до 1 г/л тетрагидрофурана. Деструк.тивная активность культуры значительно выше активности известного штамма Xanthomonas sp o 130, который 200 мг/л тетрагидрофурана использует за 28 час, а повьяпение концентрации ксенобиотика до 250 мг/л и выше приводит к лизису культуры. При этом деструкции тетрагидрофурана не происходит. Повышенная активность предлагаемого штамма обусловлена способностью культуры использовать для бнодеструкции нитрат вместо кислорода в качестве конечного акцептора электронов, / 154O2OS Концентрация тетра- /. разругидрофурана, мг/л шения до очистки после очистки 10(10 2000 3000 4000 5000 0 0 0 0 0 5000 0 ХПК, мг 0/л до очистки 100 100 100 100 100 . !00 Скорость 2780 5600 8340 1 1280 14380 Скорость 14380 после очистки % очист- Концентрация нитки ратов, мг/л до очистки после Концентрация нитритов, мг/л ОЧИСТКИ разбавления 0,0