Штам бактерій рsеudомоnаsfluоrеsсіns, що використовується для очистки стічних вод від нітратів та капролактаму

Изобретение относится к б и о т е х н о л о г и и , в частности к б и о л о г и ч е с кой о ч и с т к е сточных в о д , и может быть Изобретение относится к биотехнологии , в ч а с т н о с т и к биологической очистке сточных в о д , и может быть исп о л ь з о в а н о для очистки от нитратов сточных вод производства к а п р о л а к тама. Целью и з о б р е т е н и я я в л я е т с я получение нового штамма бактерий P s e u d o monas f l u u r e s c e n s , обладающего п о вышенной способностью утилизировать капролактам и нитраты, который можно и с п о л ь з о в а т ь для очистки сточных вод от нитратов и капролактама. Штамм выделен из активного ила и хранится в Ц П под коллекционММ ным номером В П В-4212. К М использовано для очистки от нитратов сточных вод производства к а п р а л а к - і т а м а . Целью и з о б р е т е н и я я в л я е т с я штамм б а к т е р и й , разлагающий нитраты и к а п р о л а к т а м . Очистку воды от нитр а т о в осуществляют с помощью к у л ь туры Pseudomonas f l u o r e s c e n s ВКПМ В-4212, иммобилизованной на в о л о к нис гой з а г р у з к е , что п о з в о л я е т в о с с т а н а в л и в а т ь 100 мг/л нитрата в час и повысить производительность с о о р у жения до 1,33 м 3 / м 3 с у т к и . Процесс осуществляется в сточных водах при концентрации нитратов 500-2000 м г / л , 500-1000 мг/л к а п р о л а к і а м а и 40 мг/л ^ ^ в условиях протока со с к о р о стью р а з б а в л е н и я 0 , 0 4 - 0 , 0 6 ч без принудительной а э р а ц и и . 2 т а б л . Культуру денитрификаторов получают иэ а к т и в н о г о ила путем д в о й ной с е л е к ц и и : по способности в о с с т а навливать нитраты при р о с т е на капролактаме и по способности а д г е з и р о в а т ь с я на волокнистой н а с а д к е . Для э т о г о 50 мл а к т и в н о г о и л а , имевшего ранее контакт с к а п р о л а к т а мом, вносят в колбу Эрленмейера- объемом 500 мл. Туда же помещают 5 г б а з а л ь т о в о г о или 2 г капронового в о локна для е с т е с т в е н н о й а д г е з и и микроорганизмов на е г о п о в е р х н о с т и , В колбу наливают с р е д у , содержащую 2000 мг/л н и т р а т о в , 1000 мг/л к а п ролактама и 40 мг/л фосфата к а л и я л СЛ СЛ' 1615175 до общего объема 500 мл (под пробку). Периодически (раз в 6 ч) отбирают пробу на анализ на содержание нитратов и капролактама. После полной редукции нитратов жидкость из колбы выливают, и в к о л бу с волокном вносят 500 мл (под пробку) свежей среды аналогичного с о с т а в а . Восстановление нитратов капролактамом осуществляют закрепившиеся на насадке микроорганизмы, содержащие нитратредуктазу. По мере снижения концентрации нитрата и капролактама в среде жидкость снова заменяют свежей. После установления постоянной скорости восстановления нитратов иммобилизованными на волокне микроорганизмами в течение трех пассажей селекцию прекращают. Жидкость .выливают , и в колбу вносят стерильный физиологический раствор (100 мл). Колбу интенсивно встряхивают в т е чение 2 мин, отбирают 1 мл образовавшейся бактериальной суспензии, разбавляют в 10, 100, 1000, 10000 раз и засевают в трех повторноетях на агаризованной (2%) среде описанного с о с т а в а . Чашки с засеянными микроорганизмами культивируют при 25°С. мент образуется и на плотной среде с капролактамом и нитратами. В 3-4суточной культуре колонии на минеральной среде с капролактамом крупные, достигают 7-8 мм в диаметре. Клетки мелкие, палочковидные с з а кругленными концами, одиночные, цепочек не образуют., размером 0,5 0,7 х 2 , 2 - 3 , 5 мкм, содержат поляр10 ный жгутик, размножение путем бинарного деления, спор не образуют. На МПБ культура вызывает равномерное помутнение среды, не кислотоустойчива. Не накапливает поли-^-окси15 бутират внутри клеток. В клеточной стенке отсутствуют тейхоевые кислоты, содержание муреина низкое. 20 25 30 Выросшие в отдельные колонии микроорганизмы шестикратно пересевают на агаризованной с р е д е . Получают биомассу чистых "культур и изучают 35 способность изолированных бактерий восстанавливать нитрат при росте на жидкой среде с капролактамом. Отбирают культуры, наиболее быстро восстанавливающие нитрат с выде40 лением г а з а . В результате селекции выделен штамм P. f l u u r e s c e n s 154, восстанавливающий нитрат до молекулярного а з о т а , растущий на капрон лактаме, как единственном источнике 45 питания, и активно адгезирующийся на базальтовом и капроновом вопокнах. Морфолого-культуральные признаки культуры. Грамотрицательные, подвижные палочки. На М А образует небольП шие колонии 2-3 мм в диаметре с ха- , 50 рактерным зеленым флуоресцирующим пигментом, диффундирующим в среду. Колонии плоские, в проходящем свете полупрозрачные, край волнистый,по55 верхность гладкая, влажная, блестящая , консистенция вязкая , равномерно окрашены в зеленый цвет, в том числе и обратная сторона колонии, Пиг Физиолого-биохимические свойства. Культура аэробная, способна к денитрификации. Редукцию нитратов осуществляют до молекулярного а з о т а . Оксидазо- и каталазоположительная, разжижает желатин, не гидролизует крахмал, не содержит лецитиназы и левансахаразы, оптимум рЦ близок 7 , 0 , не галотолерантна - (не растет при 12% NaCl, медленный рост при 5% NaCl). На М Б выделяет сероводород П и не продуцирует индол, молоко не свертывает. Содержит аргининдегидрол а з у . Источником углерода для роста служат глюкоза, манноза, галактоза, раффиноза, рамноза, инозит, глицерин, макнит, L-валин, ацетат и цитрат, при этом происходит подкисление с р е ды (изменение рН с 7,1 до 6 , 3 ) . Не использует сахарозу, фруктозу, л а к тозу, мальтозу, сорбит, дульцит, салицин, адонит, та'ртрат. Оптимальная температура роста 27-30°С, слабый рост при 10 и 37°С, при 41 С роста нет. В периодических условиях культивирования P. f l u u r e s c e n s 154 за 16 ч полностью восстанавливает 2000 мг/л нитратов при росте на среде с капролактамом при 25°С и концентрации клеток 10 в 1 мл, с р е ду подщелачивает. Культура не патогенна, не токсична. П р и м е р 1 .• Очистка модельной сточной воды, содержащей нитраты, культурой P. f l u u r e s c e n s 154. В цилиндрическую установку высотой 1 м объемом 10 л подвешивают жгутами 50 г базальтового волокна и вносят приготовленную на воде, с о держащей 500 мг/л нитратов, 300 мг/л капролактама и 10 мг/л фосфата калия. 5 6 161 5)75 суспензию культуры P. fluurescens 154 установку помещают переплетенное капс концентрацией клеток tO"7 в 1 мл. роновое волокно и вносят суспензию Через 12 ч устанавливают проток со культуры P. fluurescens 154, скоростью разбавления 0,01 ч . По Эффективность работы биореактора мере восстановления нитратов СК07 приведена в табл.2. рость постепенно увеличивают до Из табл. 2 випно, что полная ре0,08 ч . Параллельно повышают содукция нитратов в сточной воде кульдержание N-N0^ до 2000 мг/л. Процесс турой P. fluorescens 154 происходит проводят при 25°С в анаэробных ус10 при исходной концентрации 1800 мг/л ловиях. и скорости разбавления 0,06 ч , УвеРезультаты опытов приведены в ' личение скорости разбавления до 1 табл. I. 0,08 ч" ухудшает очистку. 1800 мг/л нитратов восстанавливаются на 95%. Из табл.1 видно, что за 12 ч пребывания сточной воды в сооружении 2000 мг/л нитратов восстанавливаются на 96Z и за 18 ч на 100%. Т а блица Скорость разбав Концентрация N-NOj"» мг/л до 1 15 Т а б л и ц а Скорость раэбав20 ления, ,-t Степень очистки, после очистки 0,04 0,04 0,04 500 1000 2000 0 0 0 100 100 100 0,06 0,06 0,06 500 1000 2000 0 0 0 100 100 100 0,08 0,08 0,08 500 1000 2000 0 10 80 100 99,0 96,0 Пример 2. Очистка реальной сточной воды от нитратов. Непрерывное культивирование штамма P. fluorescens 154 осуществляют на реальной сточной воде производства капролактама, содержащей 1800 мг/л нитратов и 1000 мг/л капролактама. В воду добавляют фосфат калия концентрации 40 мг/л. Очистку осуществляют на локальной установке объемом 1 м3 при 22-25°С и скорости разбавления 0,04-0,08 ч*" . В ДО очистки 25 0,04 0,06 0,08 очистки Концентрация N-NO^ мг/л 1800 1800 1800 2 Степень ОЧИСТКИ, после очистки 0 0 90 100 100 95 Штамм P. fluorescens позволяет 30 полностью очистить сточную воду от нитратов при их исходной концентрации 1800 мг/л и времени пребывания 18 ч. При этом нагрузка на сооружение составляет 100 мг/л нитрата/ч. Производительность установки 35 1,33 м 3 /м 3 .сут. Максимальная концентрация нитратов, полностью вос~ станавливаемых культурой P. fluorescens до газообразного состояния 4Q при скорости разбавления 0,04 ч~, 5000 мг/л N-NOj. При очистке сточных вод от нитратов штаммом P. fluorescens снижаются эксплуатационные расходы благо45 даря увеличению нагрузки на сооружение. Формула 50 и з о б р е т е н и я Штамм бактерий Pseudomonas fluorescens В П В-42\2,используемый для КМ очистки сточных вод от капролактама и нитратов. 1615175 a Редактор Н.Гунько Составитель И.Болотина Техред Л.Сердюкова Корректор А.Обручар Заказ 3961 Тираж 496 Подписное В И П Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР НИИ 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д . 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101