Спосіб відновлення та активації ендогенних систем біосинтезу та функціонування убіхінону в організмі

Винахід відноситься до медицини, а саме до способів активації біосинтезу та функціонування убіхінону (кофермент Q, Q) в організмі шляхом введення пара-оксибензойної кислоти (ПОБК) як попередника в біосинтезі Q та ефективного регулятора багатостадійного процесу біосинтезу Q та його функціонування у складі Q-залежних оксидоредуктаз ланцюгу транспорту електронів (ЛТЕ) мітохондрій, і може використовува тись в експериментальній біології, медицині, ветеринарії та тваринництві. Встановлено значну нестачу Q при харчуванні, не збалансованому за амінокислотним складом, вітамінами і особливо жиророзчинним вітаміном Ε (a-токоферолацетатом). Продемонстровано, що білкова нестача уповільнює синтез Q в організмі і порушує його обмін [1]. У зв'язку з тим, що біосинтез Q в організмі людини та тварин часто порушується (стресові ситуації, по хилий вік, захворювання та ін.), [2, 3] існує потреба пошуку шля хів підвищення забезпеченості Q організму людини. Поповнення внутрішньоклітинного пулу Q відбувається частково за рахунок надходження його ззовні, але переважно за рахунок ендогенного синтезу, тому Q належить до вітаміноподібних сполук. Але порушення його біосинтезу в тканинах супроводжується широким спектром патологій. Проявами дефіциту в організмі є слабкість, втомлюваність, зниження працездатності та витривалості, серцева недостатність, зниження імунного захисту, ожиріння, ксеродермія та ін [2, 4, 5]. В основі розвитку цих патологій лежить саме порушення біоенергетичного обміну, який є одним з найважливіших компонентів внутрішньоклітинного обміну. Прототипом винаходу є використання препаратів екзогенного Q в дозі 200-500мг на добу протягом 3-6 місяців при різноманітних порушеннях синтезу його в організмі [6]. Корегувати Q-ста тус можливо завдяки споживанню збагачених Q харчови х продуктів і додатків, або за допомогою безпосереднього введення фармацевтичних препаратів Q. Препарати Q знайшли широке практичне використання у високорозвинених країнах (США, Японія, Німеччина, Франція). В Японії Q вже запропонований в якості профілактичного засобу широкого спектру захворювань і для загального оздоровлення населення. На світовому ринку виробляються таблетовані препарати, гранули, водні, ліпосомальні форми, капсули, та ін. Прототип винаходу має ряд недоліків. Після закінчення курсу лікування препаратом Q спостерігають гальмування ендогенного синтезу Q, що у наступному неодмінно викличе потребу в постійному прийомі його препаратів, оскільки їх вживання не веде до відновлення та активації систем його біосинтезу та функціонування в організмі. В Україні Q не виробляється, а ввезення його з-за кордону дуже обмежене внаслідок високої вартості препарату та низької купівельної спроможності населення, що не дозволяє вживати його як лікарський засіб, не кажучи вже про забезпечення повсякденного прийому цього препарату населенням України. Стимуляція ендогенного синтезу Q шляхом підсилення власних біосинтетичних ресурсів організму (на відміну від екзогенних його препаратів) є принципово новим способом та найбільш перспективним і раціональним підходом. Нами було доведено, що вітамін Ε не тільки активує на декількох етапах біосинтез Q в організмі, що підвищує його вміст у тканинах, але й активує процеси, пов'язані з його функціонуванням, що проявляється в інтенсифікації процесів тканинного дихання та окисного фосфорилювання. У порівнянні з прототипом (екзогенним препаратом Q) пропонується спосіб використання інтенсифікації біосинтезу та функціонування Q в організмі комплексним препаратом, до складу якого входить попередник біосинтезу Q - ПОБК та вітамін Е. Спосіб відрізняється тим, що відбувається відновлення та активація ендогенних систем біосинтезу та функціонування Q в організмі. Практично при застосуванні нового комплексного препарату відбувається реконструкція порушених систем біосинтезу та функціонування Q в організмі. Завдання роботи полягає в розробці принципово нового ефективного засобу підвищення ендогенного синтезу Q. Поставлене завдання вирішується за рахунок введення попередника біосинтезу Q пара-оксибензойної кислоти формули: в комплексі з регулятором його біосинтезу - вітаміном Е. Винахід ілюструється прикладами впливу запропонованого комплексного препарату на вміст та функціонування убіхінону у піддослідних тварин за умов різного забезпечення їх вітаміном Е. Приклад 1. В досліді використовували щурів масою 80г, що протягом двох місяців утримувались на вітамін Едефіцитному раціоні. Методом аналогів дослідних тварин було поділено на групи: одну контрольну і три дослідні. За шість діб до експерименту тваринам першої дослідної групи щоденно вводили per os вітамін Ε в дозі 5мг/кг маси тіла разом з ПОБК в дозі 15мг/кг маси тіла. Друга дослідна група тварин отримувала тільки ПОБК в дозі 10мг/кг маси тіла. Третя дослідна група тварин отримувала препарат порівняння - Q в дозі 20мг/кг маси тіла. Використання наркотизуючих речовин безпосередньо перед забоєм було неможливим, оскільки вплив таких речовин на остаточні результати неможливо передбачити та врахувати. Тому згідно з вимогами Міжнародного Комітету із гуманного поводження з тваринами декапітацію проводили максимально швидко та з найменшим болем. Після забою тварин в гомогенатах печінки та міокарду визначався вміст Q, глутатіонпероксидазна, сукцинатубіхінонредуктазна (CQR) та NADH-убі хінонредуктазну (HQR) активності. Для визначення вмісту Q та токоферолу у гомогенаті міокарду та печінки використовували методику [7]. Вміст білку в препараті визначався за методом Лоурі [8]. Ферментативну активність сукцинат- та NADHдегідрогеназних систем, де Q являється кофактром, визначали в мітохондріях клітин печінки та серця за методом Зіглера [9] та Тарасової [10] відповідно. Глутатіонпероксидазну активність визначали за методом [11]. Як видно з представленого в табл.1 матеріалу, найбільший вміст Q в серці тварин яким давали ПОБК разом з вітаміном Е, він достовірно перевищує вміст у контрольній групі та навіть рівень Q у групі, що отримувала Q. В печінці картина майже аналогічна, але більш виражена. При цьому слід зауважити, що сама ПОБК без вітаміну Ε майже не впливає на рівень Q у цьому органі. Введення Q та ПОБК разом з вітаміном Ε приводить до активації глутатіонпероксидази в міокарді в порівнянні з контролем, тоді як сама ПОБК не змінює глутатіонпероксидазну активність в цьому органі. Рівень ендогенної CQR активності в міокарді вищий у гр упі що отримувала ПОБК разом з вітаміном Е, ніж у контрольній та у тій, що отримувала сам Q. Після внесення Q в інкубаційне середовище активність даної ферментної системи є практично однаковою в групах тварин, що отримували Q та ПОБК разом з вітаміном Ε і також значно перевищує контрольний рівень. Таблиця 1 Дослідження вмісту Q, вітаміну Е, інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів в тканинах міокарду та печінки та активності ферментів ланцюгу транспорту електронів (CQR, HQR) мітохондрій клітин міокарду та печінки за умов Е-гіповітамінозу (контроль) та введення вітаміну Ε та ПОБК (А1 - ферментативна активність на ендогенному убі хіноні, А2 - ферментативна активність при додаванні до середовища екзогенного Q1) (М±n, n=6-8) Групи тварин Показники Q (мкг/г тканини) ГП (опт. густина/мг білка за 1хв) CQR А1 (мкмоль/мг білка за 1хв) А2 HQR А1 (мкмоль/мг білка за 1хв) А2 Q (мкг/г тканини) ГП (опт. густина/мг білка за 1хв) CQR А1 (мкмоль/мг білка за 1хв) А2 HQR А1 (мкмоль/мг білка за 1 хв) А2 Додаткове введення ПОБК Вітамін Ε разом з ПОБК Контроль Q Міокард 12,48±0,84 21,38±2,44 0,446±0,029 0,466+0,024 0,128±0,048 0,156±0,031 0,250±0,093 0,354±0,019 110,42±26,24 120,84±4,46 117,23±5,62 127,63±8,06 Печінка 7,35±1,07 10,31±1,57 0,486±0,043 0,546±0,035 0,065±0,009 0,072±0,007 0,120±0,028 0,213±0,007 35,97±6,98 36,75±9,74 46,12±3,17 47,67±9,58 15,14±0,91 0,416±0,023 0,154±0,031 0,272±0,023 112,53±4,80 118,57±7,84 34,37±3,21 0,474+0,012 0,173±0,061 0,341±0,075 146,51±11,70 160,05±9,22 8,94±0,71 0,554±0,041 0,069±0,018 0,137±0,036 46,98±3,11 55,59±1,54 18,21±1,35 0,503±0,031 0,095±0,009 0,186±0,027 47,55±6,56 56,33±6,77 Ферментативна активність CQR в печінці в групах тварин, що отримували ПОБК разом з вітаміном Е, або Q близькою за чисельними значеннями. Однак при введенні дослідним тваринам лише однієї ПОБК без вітаміну Ε в печінці екзогенна активність зростає в порівнянні з контрольною значно менше ніж у гр уп тварин, які отримували ПОБК разом з вітаміном Е. Ендогенна та екзогенна HQR активності в міокарді найвищі в групі тварин, що отримувала ПОБК разом з вітаміном Ε і достовірно перевищують аналогічні активності в контрольній групі та в групі, що отримувала Q. В печінці ці активності майже однакові при введенні ПОБК разом з вітаміном Ε Ta Q. Таким чином, введення ПОБК разом з вітаміном Ε вітамін Е-дефіцитним щурам викликає підвищення вмісту Q та ферментативних активностей ланцюгу транспорту електронів і системи антиоксидантного захисту. Такий ефект є навіть більш значним, ніж при використанні самого Q. Отримані результати свідчать про можливість інтенсифікації ПОБК разом з вітаміном Ε процесів ендогенного синтезу Q в організмі. Використання запропонованих складових є неочевидним, так як сама ПОБК не викликає подібних змін. Приклад 2. Матеріалом для дослідження слугували білі лабораторні щури-самці лінії Вістар вагою 155-190г, які під час досліду отримували стандартний раціон віварію. Тварин було поділено на 4 групи. За три доби до експерименту тваринам щоденно вводили per os 10мг/кг маси вітаміну Ε разом з 50мг/кг маси ПОБК. Контрольна група препаратів не одержувала. Досліджувались вміст Q та вітаміну Ε в печінці та міокарді і CQR та HQR активності в мітохондріях печінки. Вміст білку, Q та токоферолу в гомогенаті та мітохондріях, а також активність ферментних комплексів визначали за методиками, поданими в Прикладі 1 [7, 8, 9, 10]. Розрахунок відсотку дефіциту Q в тканинах організму і коефіцієнту активації Q-залежних ферментних систем проводили за методом Фолкерса [12]. ПОБК разом з вітаміном Е підвищує рівень Q в міокарді вдвічі порівняно з групою тварин, що отримувала лише вітамін Ε (табл.2). Це свідчить про пріоритетну забезпеченість міокарду Q при отриманні досліджуваного препарату. Що стосується вмісту Q у печінці дослідних груп, то в група х, які отримували ПОБК з вітаміном Ε він також найвищий. Активність CQR та HQR у мітохондріях печінки щурів найбільша в групах, які отримували ПОБК з вітаміном Е. Таблиця 2 Вміст Q в міокарді та печінці щурів (мкг/г тканини) та активність ферментів ланцюгу транспорту електронів в мітохондріях печінки щурів (мкм/мг білку за хв) (M±m, n=5-7) Групи Контроль Отримували вітамін Ε Отримували ПОБК з вітаміном Ε Показники Вміст Q в міокарді Вміст Q в печінці CQR HQR 20,27±0,22 28,69±3,28 14,48±1,64 0,67±0,08 30,57±3,84 29,32±2,76 16,02±1,85 0,75±0,09 74,21±15,51 33,67±2,94 22,49±2,21 0,88±0,06 Підбиваючи підсумки можна сказати, що отримання тваринами ПОБК разом з вітаміном Ε приводить до значного підвищення рівня Q в печінці щурів 17,4%, що може свідчити про посилення його біосинтезу. Крім того, підвищується ефективність його функціонування в якості коферменту в обо х досліджених нами ферментних комплексах, що свідчить про значну активацію біосинтезу Q та його функціонування в ланцюгу транспорту електронів внутрішньої мембрани мітохондрій та процесів тканинного дихання. Таким чином, введення ПОБК з вітаміном Ε тваринам, які утримувались на стандартному раціоні віварію, є ефективним в плані підвищення рівня та функціонування Q шляхом підсилення його біосинтезу та функціонування як коферменту у CQR та HQR ферментних комплексах. ПОБК разом з вітаміном Ε може бути рекомендовані для інтенсифікації біосинтезу Q у організмі людини з достатнім харчуванням з метою підвищення його забезпеченості Q та функціонування ферментних комплексів. Приклад 3. Досліди виконані на кролях породи шиншилла з вихідною масою 600-800г, яких утримували на раціоні, збідненому за вітаміном Е. Тварин було поділено на 4 групи. Кролів контрольної групи (з Е-гіповітамінозом) утримували на основному раціоні протягом 21-23 доби до розвитку чітких ознак м'язової дистрофії. Тваринам трьох піддослідних груп додатково до основного раціону через добу перорально вводили в розрахунку на 1кг маси тіла: першій - фізіологічну дозу вітаміну Ε (10мг фармакопейного препарату aтокоферилацетата), другій - еквімолярну кількість (16,4мг) Q, третій - 15мг ПОБК. Тварин декапітували на 21-23 добу досліду. Виділяли мітохондрії з міокарду та м'язів стегна. Визначали вміст Q та вітаміну Ε [7], активність NADH-цитохром с-редуктази, CQR та HQR [9, 10], які виражали в мкмоль на 1мг білка за 1хв. Розраховували відсоток дефіциту Q та коефіцієнт активації ферментних систем [12]. Як видно з даних табл.3, вітамін Ε та ПОБК при введенні окремо стимулюють зростання вмісту Q в тканині печінки та в мітохондріях міоцитів і кардіоміоцитів достовірно в порівнянні з контрольною групою. Ефект ПОБК пов'язаний із нормалізацією порушеного в умовах Е-гіповітамінозу біосинтезу Q. Таблиця 3 Вміст Q в мітохондріях та тканинах кролів за умов м'язової дистрофії (мкг/г білку) (М±m, n=5-9) Показники Групи Е-гіповітаміноз Вітамін Ε Q9 ПОБК Тканина Печінка 232,2±11,3 290,7±38,7 393,2±7,0 275,0±13,4 М'язи 76,9±3,0 97,5±7,1 78,7±5,1 69,6±6,2 Міто хондрії М'язів Серця 630,2±34,0 1189,3±132,1 706,4±39,4 1631,4±89,3 887,3±79,5 1429,6±110,3 791,7±171,0 1579,0±130,2 З даних Фіг. можна зробити висновок, що за умов м'язової дистрофії маса тіла кролів контрольної групи різко знижується починаючи з чотирнадцятої доби експерименту. Введення вітаміну Ε per os з профілактичною метою попереджає розвиток захворювання, і тварини продовжують рости. ПОБК має навіть більший ефект на зростання маси тіла, ніж вітамін Е, в той час, як введення Q9 не нормалізує масу тіла тварин. Наведені в прикладах 1-3 експериментальні дані підтверджують переваги препарату, що заявляється, порівняно з екзогенним Q у інтенсифікації ендогенного синтезу Q та посиленні його функціонування в якості коферменту ферментів ланцюгу транспорту електронів мітохондрій. Запропонований спосіб підвищення вмісту Q в організмі за рахунок введення комплексного препарату попереднику Q - ПОБК разом з медіатором синтезу вітаміном Ε виявився найбільш ефективним порівняно із досліджуваними препаратами за різних умов утримання піддослідних тварин. Після проведення клінічних випробувань запропонованого препарату він може бути використаним в медицині та експериментальній біології як препарат, що активує біосинтез Q та його функціонування в складі оксидо-редуктазних ферментних систем ланцюгу транспорту електронів внутрішньої мембрани мітохондрій, для відновлення та стимуляції біоенергетичного обміну клітин, порушення якого лежить в основі розвитку широкого спектру патологій. Список посилань 1. Lane RH, Flozak AS, Ogata ES, Bell GI, Simmons RA. Altered hepatic gene expression of enzymes involved in energy metabolism in the growth-retarded fetal rat Pediatric research. 1996 Mar;39(3):390-4. 2. Kucharska J, Gvo zdjakova A, Snircova M, Mi zera S, Schramekova E, Schreinerova Z, Pechan I, Fabian J. Determination of coenzyme Q10 and alpha-tocopherol levels in patients with cardiopathies of unknown origin: perspectives in diagnosis Bratislavske lekarske listy. 1996 Jun;97(6):351-4. 3. Muller-Hocker J, Aust D, Napiwotzky J, Munscher C, Link ТА, Seibel P, Schneeweiss SG, Kadenbach В Defects of the respiratory chain in oxyphil and chief cells of flie normal parathyroid and in hyperftmction. Human pathology 1996 Jun;27(6):532-41. 4. Karlsson J, Sylven C, Jansson E, Book K, Muratsu K, Folkers K.Coenzyme Q10 and key enzyme activities in papillary muscle related to left ventricle function in mitral valve disease. Molecular and cellular biochemistry. 1988 Nov;84(l):59-64. 5. Yamagami T, Iwamoto Y, Folkers K. Deficiency of acti vity of succinate dehydrogenase-coenzyme Q10 reductase in leucoytes from patiens with essential hypertension. International journal for vitamin and nutrition research. 1974;44(3):404-14. 6. Донченко Г.В. Биохимия убихинона (Q). - К.: На укова думка, 1980. - 240с. 7. Донченко Г.В., Коваленко В.Н., Забарная Е.Н., Маковецкий В.П., Басалкевич Е.Д., Яременко В.В., Сви щук А.А., Халмурадов А.Г. Действие производных a-токоферола на содержание природных хинонов в тканях витамин Ε-недостаточных крыс // Биохимия. - 1979. - Т.44. №5. - С.923-930. 8. Lowry O.N., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurment with the folin phenol reagent // Journal of Biological Chemistry. - 1951. - Vol.193. - N1. - P.265-275. 9. Ziegler D., Doeg K.A. Preparation and properties of succinate dehydrogenase-coenzyme Q reductase (complex ll): Methods in Enzymology. - New York, 1967. - 10. - P.231-235 10. Тарасова Н.В., Иванова Г.И., Гололобов А.Д. Участие уби хинона в цепи переноса электронов у Candida quilliermondii // Микробиология. - 1976. - Т.45 №3. - С.400-405. 11. Власова С.Н., Шабунина Е.И., Переслягина И.А. Активность глутатионзависимых ферментов эритроцитов при хронических заболеваниях печени у детей. // Лаб. дело 1990, №8, - С.19-22. 12. Nakamura R., Litarru G.P., Folkers К. A new enzymic assay for human deficiencies of coenzyme Q10 // International Journal of Vitamin and Nutritional Research. - 1973. - Vol.43. - N4. - P.526-536.