Інсектофунгіцидний біопрепарат для боротьби із шкідниками і хворобами сільськогосподарських культур

Винахід відноситься до біотехнології, а саме до одержання комплексного біопрепарату для захисту рослин від шкідників і збудників захворювань. Біологічні засоби захисту рослин, які посідають все значніше місце на ринку продуктів біотехнології, є як правило моновалентними і спрямовані тільки проти комах-шкідників або мікроорганізмів - патогенів рослин. В той же час досить привабливим є створення на основі мікроорганізмів комплексних біопрепаратів, які мають кілька видів корисної активності. До перспективних з цієї точки зору мікроорганізмів відносяться штами Pseudomonas aureofaciens, антифунгальним властивостям яких присвячено чимало повідомлень [Смирнов, Киприанова, 1990; Becker et al., 1990, Thomashow et al., 1990]. Нами було показано, що поряд з високою антибактеріальною та антифунгальною активністю деякі штами цього виду мають виражені ентомопатогенні властивості. Задачею винаходу є створення на основі активних штамів Pseudomonas aureofaciens біопрепарата з комплексною антимікробною, антифунгальною, ентомопатогенною і рістстимулюючою дією для захисту сільськогосподарських культур від хвороб і шкідників. Як прототип запропонованого препарату може розглядатися препарат Агат 25К для підвищення врожаю рослин [Патент Російської Федерації №2111196 від 20.05.98], який містить інактивовані бактерії Pseudomonas aureofaciens штам Н16 у вигляді пасти. Препарат використовується для обробки насіння і обприскування посівів ячменю, пшениці, цукрових буряків. Він гальмує розвиток кореневих гнилей, септоріозу, фузаріозу, бурої іржі, підвищуючи тим самим врожай сільськогосподарських культур. Проте цей препарат містить лише один штам бактерій з обмеженим спектром антифунгальної активності, спрямованим проти кількох видів грибних патогенів. Як аналог препарату може розглядатися штам бактерій Pseudomonas aureofaciens 51 [Патент Російської Федерації №2203945 від 10.05.2001], використовуваний для передпосівної обробки насіння пшениці. Препарат, одержаний на основі штама, ізольованого з орних грунтів Башкортостану, гальмує розвиток захворювань пшениці, які спричиняються твердою сажкою та кореневими гнилями. Проте це є моновалентний препарат, що складається з одного штама бактерій, він не має ентомопатогенної активності і не діє на шкідливі комахи, а пігмент, з яким пов’язаний антимікробний і рістстимулюючий ефект препарату, має досить помірну антимікробну активність. Тому спектр дії препарату обмежений і його застосування дає позитивні результати тільки при захворюваннях пшениці, які спричиняються грибними патогенами. В основу винаходу було поставлено завдання створення екологічно безпечного комплексного інсектофунгіцидного препарату на основі штамів Pseudomonas aureofaciens, яке б забезпечило його широке використання для захисту овочеви х, злакових, плодових культур, виноградних насаджень, лісових масивів від комах-шкідників і грибних і бактеріальних хвороб і стимулювання розвитку рослин. Поставлене завдання вирішується тим, що біопрепарат містить клітинну біомасу в суміші з середовищем вирощування двох штамів: Pseudomonas aureofaciens УКМ В-111 та Pseudomonas aureofaciens УКМ В-306. Названі штами відібрані в результаті широкомасштабного дослідження значної колекції мікроорганізмів, зокрема представників виду Pseudomonas aureofaciens, на антагоністичну активність щодо фітопатогенних грибів і бактерій. Вони характеризувалися значною антибіотичною активністю, зумовленою синтезом антибіотиків - похідних феназину (табл.1). Ентомоцидна активність різних штамів Pseudomonas aureofaciens щодо гусені яблуневої плодожерки 5-го віку коливалась у широких межах, досягаючи у окремих штамів і в різних дослідах 90% (табл.2). Як видно з наведених в таблицях даних, найбільш значні антифунгальні властивості виявив штам В-111, а найвищий процент загибелі яблуневої плодожерки і колорадського жука спричиняв штам В-306. Виявлено значну ентомоцидну активність названих штамів відносно ряду шкідників, причому в більшій мірі вона проявлялася у штаму В-306. (табл.3). Жоден з штамів не виявляв антагоністичної дії щодо іншого; вони добре росли у змішаній культурі. На основі обох цих культур і було створено комплексний препарат, названий гаупсином. Обидва штами депоновані в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під номерами 1MB В-7096 та 1MB В-7097. Спосіб одержання гаупсина включає спільне вирощування обох штамів в глибинній культурі на органомінеральному середовищі з вмістом загального азоту 1,8-2,5% (в тому числі амінного азоту 0,15-0,30%), редукуючи х речовин 1,8-2,5%, сполук фосфору 0,04-0,07%, калію 0,05-0,07%, магнію 0,005-0,01%. Джерелом органічних сполук є побічні продукти харчової промисловості. Як посівний матеріал використовуються бульйонні культури штамів В-111 і В-306, одержані вирощуванням на качалці, з титром 5x109 - 1x1010 клітин/мл. Посівний матеріал в кількості 5% від загального об’єму середовища вносили в 100-литровий ферментер з 70л середовища наведеного вище складу. Температура вирощування - 25-27°, аерація - 1 об’єм повітря на 1об. середовища / хв., перемішування - 250об./хв., тривалість ферментації - 24год. Спільний ріст бактерій в умовах аерації супроводжується інтенсивним синтезом антибіотично активних феназинових пігментов, про що свідчить оранжово-червоне забарвлення культуральної рідини. Препарат, одержаний в ферментері, містить 1.0-1.2x1011 клітин в мл і не поступається за продуктивністю препаратам, одержаним при роздільному вирощуванні штамів В-311 та В-306 (табл.4) Гаупсин не вірулентний і не токсичний для лабораторних тварин і людини, не виявляє негативної дії на корисні організми біоценозу, може використовуватися в будь-яку фазу розвитку рослин (цвітіння, збір врожаю). Рідка форма гаупсина - нативна культуральна рідина з клітинами, одержана вирощуванням в балонах на качалці або культуральна рідина з клітинами з ферментера, розведена водним розчином стабілізатора до титру 1 x1010 кл./мл, характеризується високим рівнем активності на протязі трьох місяців зберігання при кімнатній температурі. З використанням рифампіцин-стійких мутантів Pseudomonas aureofaciens встановлено, що при обприскуванні листя рослин гаупсин в високих титрах зберігався протягом 7 днів. Результати польових випробувань рідкої форми гаупсину наведені в табл.5. Препарат в нормі витрати 2-3л/га ефективно знижував враженість плодів яблуневою плодожеркою (9293%) і грибними захворюваннями (94-96%). В цілому за показниками ефективності щодо плодожерки, гальмування грибних захворювань, врожайності та рентабельності гаупсин не поступався хімічним пестицидам. Встановлено, що поряд з інсекто-фунгіцидними властивостями, гаупсин проявляв стимулюючу дію на рослини (табл..6). Передпосівна обробка насіння гаупсином не лише знижувала ураженість рослин кореневими гнилями, але й підвищувала протягом вегетації їх стійкість до борошнистої роси на зернових, фіто фторозу на картоплі, фітофторозу і макроспоріозу на томатах, що сприяло підвищенню врожайності цих культур на 14-70%. На протязі останніх років гаупсин також зарекомендував себе проти таких хвороб і шкідників як оідиум, мільдью, чорна плямистість, сіра гниль, борошниста роса, аскохітоз, вертицильоз, септоріоз, фузаріоз, пероноспороз, тверда сажка, багато видів листокруток, попелиць, п’ядунів, вогнівок, плодожерок та ін. Гаупсин не тільки захищає рослини, гальмує розвиток і поширення хвороби, але й позитивно впливає на саму рослину, "лікує" її. Гаупсин з успіхом використовується для передпосівної обробки насіння, замочування розсади, обробки виноградних насаджень та лісових масивів від шкідників. Встановлено, що штами Pseudomonas aureofaciens стійкі до засобів хімічного захисту рослин, тому гаупсин сумісний з більшістю фунгіцидів і може використовуватися у вигляді бакових сумішей. Таблиця 1 Феназинсинтетуюча і антагоністична активність штамів Pseudomonas aureofaciens Активність і речовини, які її обумовлюють NN штаммов В-108 В-109 В-110 В-111 В-112 В-113 В-114 В-306 В-360 В-361 Феназин-1 карбонова сл** Синтез феназинів, мг/л кислота культурального 2-оксифеназин-1 середовища сл -карбонова кислота 2-оксифеназин Fusarium 0 oxysporum Trichothecium 0 Антагонізм щодо roseum фітопатогенних грибів* Verticillium 2 dahliae Helminthosporium 8 gramineum Mucor plumbeum 7 Agrobacterium 6 tumefaciens Erwinia 0 carotovora Erwinia aroidea 0 Clavibacter 8 michiganensis Антагонізм щодо фітопатогенних Xanthomonas 6 бактерій* ve zicatoria Pseudomonas syringae 0 pv.pisi 2 pv.vignae 4 pv.lachrymans 353 329 520 160 382 354 386 405 250 70 55 128 16 90 60 75 76 38 сл 19 10 11 35 >30 0 27 >30 10 >30 20 >30 16 >30 21 >30 10 >30 4 13 18 12 13 8 16 8 >30 0 16 18 16 0 7 >30 >30 >30 5 >30 >30 >30 >30 14 19 19 >30 6 >30 >30 >30 13 8 20 >30 >30 5 14 >30 20 >30 10 0 0 0 0 0 0 0 L0 0 12 10 22 0 7 12 10 8 8 >30 >30 >30 10 >30 >30 >30 19 >30 >30 >30 >30 11 >30 18 16 >30 >30 18 14 19 15 0 12 16 20 18 8 0 7 10 18 9 15 14 18 13 17 12 17 10 12 6 0 10 * зона затримки росту тест-к ультур в мм; ** речовина присутня на хроматограмі в слідових кількостях Таблиця 2 Ентомоцидна активність штамів Pseudomonas aureofaciens щодо гусені яблуневої плодожерки та личинок колорадського жука N штама Гусениці яблуневої плодожерки (L5) Личинки колорадського жука (L4) Загальна смертність, % 31 80** 30 70** 35 40 62* 85** 26 62* 25 12,2 22,4 В-108 В-109 В-110 В-111 В-112 В-113 В-114 В-306 В-360 В-361 Контроль (без обробки) НСР 0,95 НСР 0,99 Вихід імаго, % 69 20 70 30 65 60 38 15 74 38 75 Загальна смертність, % 45 30 30 55** 25 30 50* 60** 30 40 25 22,0 40,4 Вихід імаго, % 55 70 70 45 75 70 50 40 70 60 74 * Дані, достовірність яких порівняно з контролем доказана на 95%-ному рівні ** Дані, достовірність яких порівняно з контролем доказана на 99%-ному рівні Таблиця 3 Ентомоцидна активність штамів Pseudomonas aureofaciens Вид комах Стадія розвитку Свинцево-смугаста листокрутка Сітчаста листокрутка Смородинова криво вуса листокрутка Гронова листокрутка Яблунева плодожерка Сливова плодожерка Яблунева міль Агр усова вогнівка Сливовий п’ядун Колорадський жук L2 L2 L3 L2 L5 L5 L3 L4 L4 L4 CK50* для штамів №№ В-306 В-111 1,2 8,7 0,6 11,7 1,1 16,7 0,9 2,0 0,2 1,7 0,4 1,4 0,4 1,3 0,6 10,7 0,3 38,3 4,2 14,7 *СК50 - кількість клітин в млн./мл, яка зумовлює 50%-ну загибель комах Таблиця 4 Продуктивність і біологічна активність штамів Pseudomonas aureofaciens УКМ В-111 і УКМ В-306 при роздільному і сумісному культивуванні в умовах аерації N штамма В-111 В-306 В-111+В-306 Продуктивність (млрд.клітин в мл) після 24год. росту на кукур узно-мелясному середовищі в балонах на в ферментері качалці 11,5±1,78 121,8±8,8 13,2±0,89 114.7±10.2 12,9±1,11 119,0± 7,8 Діаметр зони затримки Смертність гусениць росту Fusarium яблуневої плодожерки з oxysporum поправкою на в мм смертність у контролі 48,0 73,3±8,8 20,8 96,7±3,3 32,8 91,2±5,7 Таблиця 5 Використання гаупсину для захисту плодового саду від яблуневої плодожерки, парші и плодових гнилей Год Варіант 1992* Контроль Гаупсин Еталон 1993**Контроль Гаупсин Еталон Норма Кратність витрат л/га обробок 0 3 *** 0 2 *** 0 3 3 0 4 4 Врожайність, ц/га 86,3 123,6 120,8 71,8 97,9 98,7 Ураженість плодів зйомного врожаю, %плодожеркою хворобами 6,30 27,9 0,48 1,7 0,50 1,2 14,70 33,1 1,21 1,3 1,04 1,1 Біологічна ефективність % 93,6 95,0 94,8 95,5 1994* Контроль Гаупсин Еталон 1996**Контроль Гаупсин Еталон 1997**Контроль Гаупсин Еталон 0 2 *** 0 3 **** 0 3 **** 0 3 3 0 4 4 0 4 4 89,6 107,8 107,4 48,4 141,4 169,7 29,7 106,7 181,9 8,70 0,65 0,60 6,90 0,18 0,16 11,10 0,64 0,52 12,2 0,6 0,6 97,6 8,8 4,7 90,7 9,1 4,2 94,0 94,3 91,4 95,3 90,4 95,4 * одне повне покоління яблуневої плодожерки ** два покоління яблуневої плодожерки *** обробки інсектофунгіцидами в рекомендованих нормах витрат: золон, шерпа, полікарбацин, поліхом **** обробка інсектофунгіцидами в рекомендованих нормах витрат: золон, карате, шерпа, полікарбацин, скор Таблиця 6 Захисна та стимулююча ріст дія гаупсину на сільськогосподарчі культури Культура Озима пшениця Ярий ячмінь Огірки Схожість насіння, % до контролю 2001, + 25,0 2002 + 31,0 Зниження ураженості рослин, % до контролю кореневими іншими гнилями хворобами 52,0 56,5* 89,5 70,0* Прибавка урожаю %до контролю Спосіб застосування Норма витрати обробка насіння 0,5л/т обробка насіння 0,5л/т 2002 + 6,6 33,3 70,6 обробка насіння 4-5 мл/кг 2001 2002 +16,0 +28,0 85,7 50,0 64,0 57,0 64,0** 60,6 47,0*** 37,8 25,0** 15,7 Рік внесення в лунки 0,01% -на 2002, при висадці суспензія, 50мл 2003 розсади на рослину Картопля обробка бульб 0,35л/т 2002 Томати * - борошниста роса ** - фіто фтороз *** - макроспоріоз • 14,3 33,7