Спосіб приготування поживного середовища для культивування spirulina platensis (nordst.) geitler.

Спосіб приготування поживного середовища для культивування спіруліни Spirulina platensis C2 1 3 81508 Со(МО3)2x6Н2O 0,044 Однак при використанні класичного середовища Заррука на практиці відбувається випадання осаду при готуванні середовища і культивуванні водоростей, що позначається на економічній ефективності процесу культивування. В основу винаходу Живильне середовище для культивування Spirulina platensis (Nordst.) Geiti поставлена задача шляхом усунення випадання осаду, здійснити підвищення ефективності процесу культивування водоростей. Для рішення цього питання нами був проведений теоретичний хімічний аналіз живильного середовища з метою вивчення складу осаду, що випадає, при його готуванні без додавання комплексутворювача. Розрахунок можливості утворення і складу осаду в середовищі Заррука При готуванні середовища в відомій послідовності встановлюється рН=8,7. Тому що іонна сила розчину достатньо велика [Y=l/2(S0,1999.12+2,87.10-3.2.+12+2,9.10-2.12+5,7.103. . 2 2 1 +1,7.10-2.12+8,1.10-4.22+3,6.10-4.22+3,6.105. 2 2 +2.2,15.10-4+0,1999.12+2,87.10-3.2+2,9.102. 2 1 +5,7.10-3.22+1,7.10-2.12+8,1.10-4.22+3,6.104. 2+3,6.10-5.2)=0,273], при розрахунках хімічних процесів у розчині необхідно враховувати активності іонів. Розчин має слаболужне a OH= 10 -14 = 5,011 × 10 -6 aH+ моль/л. середовище, При аналізі основного складу середовища особливу увагу необхідно приділити карбонатній і фосфатній рівновазі. Карбонатна рівновага: НСОз-+ОН-Û СО32+Н2О a CO 2 Kr 4,8 × 10 -3 3 = = = 4,8 × 10 -3 K r= a HCO - ×a OHKW 10 -14 3 Якщо (0,1999 ×f HCO - 3 ) - x × 10 -5,3 = 4,8 × 10 3 2 ,то -3 х=3,3.10-9 моль/л. a CO 2 a OH3 При =3,3.10-9 =5,011.10-6 моль/л, моль/л. Фосфатна рівновага: НРО42-+ОH-ÛPO43-+H2O a PO 3 K 1,26 × 10 -12 4 Kr= = 3 = = 126 a HPO 2- ×a OH KW 10 -14 4 x =a PO Нехай (0,00287 ×f x HPO2 - 4 4 3 , тоді ) = 126 - x × 5,011 × 10 - 6 = a PO 3 - 4,11 × 10 -7 = x табличні значення коефіцієнтів (R2>0,999'), до зазначеної іонної сили: f HCO 3 f HPO 0,69 4 4 моль/л. Для подальших аналітичних розрахунків були знайдені коефіцієнти активностей основних іонів при іонній силі розчину 0,27 шляхом екстраполяції логарифмічних функцій, що апроксиму10ть активності f Mg2 + 0,23 f Ca2 + f Fe2 + f Fe3 + 0,36 2 0,30 0,30 0,15 Далі були розраховані добутки активностей іонів у середовищі Заррука і зрівняні з табличними добутками розчинності солей, що утворяться, з метою з'ясування складу осаду, що утвориться, (таблиця 1). Розрахунок добутку активностей іонів у даному середовищі здійснювався по формулі: ( a m K + ×a n A - = f K + ×C K + де ) m × an A- , aK+ , a A - активності катіона й аніона, m, n - відповідно число катіонів і аніонів на одну формульну одиницю, f K + , CK + - відповідно коефіцієнт активності і молярна концентрація катіонів. Таблиця 1 Порівняння добутку активностей іонів у середовищі Заррука без комплексоутворювача з табличними величинами ДР для визначення складу осаду Хімічна формула СаСО3 СаНРO4 Са(ОН)2 Добуток активностей іонів у середовищі Заррука 3,56.10-13 7,04.10-8 2,71.10-15 Утворення ДР осаду таблична 4,8.10-9 2,7.10-7 5,5.10-6 Са3(РO4)2 7,88.10-24 2.10-29 FеСО3 Fe(OH)2 3,56.10-14 2,71.10"16 3,47.10-11 10-15 Fе(ОН)3 x = a CO x 4 1,36.10-21 3,2.10-38 FePO4 Mg(OH)2 MgCO3 Mg3(PO4)2 CaSO4 1,48.10-11 7,32.10-15 9,62.10-13 4,19.10-24 7,07.10-7 1,3.10-22 1,8.10-11 4.10-5 10-13 2,5.10-5 Неможливо Можливо Неможливо Осад утвориться Неможливо Можливо Осад утвориться Можливо Неможливо Неможливо Неможливо Неможливо Дані табл. 1 показують, що при виготовлені середовища без комплексоутворювача (ЕДТА) випадає осад, до складу якого можуть входити Са3(РO4)2, СаНРO4, Fе(ОН)2, Fе(ОН)3, FePO4. Додавання ж у середовище 0,08 г/л (2,15.10-4 моль/л) ЕДТА недостатньо, щоб зв'язати іони Fe2+ (3,6.10-5 моль/л) і Са2+ (3,6.10-4 моль/л), що реагують з ЕДТА в співвідношенні 1:1, у розчинні комплекси і тим самим перешкоджати випаданню осаду. Утворення всієї маси осаду відбувається, однак, не відразу. Поява Fe (III) зв'язана з процесом окислювання іонів Fe2+ у лужному середовищі, лімітуючей стадією якого є транспорт кисню в розчині. Тому випадання буруватого осаду 5 81508 (Fе(ОН)3) відбувається, як правило, на наступну добу чи ще пізніше: Fe+2+O2+H2OÛFе(ОН)3. Окисний і відновний процеси цієї реакції характеризуються потенціалами Е2 і E1 ì p O2 RT o ln ïO 2 +2H2 O + 4e Û 4OH , E 1 = E O2 / OH- + 4F a 4 ï OH í a ДР Fe(OH )3 ïFe 2 + + 3OH - Û Fe( OH) +1e - , E = E o 3 + 2 + + RT ln Fe3 + = E o 3 + 2+ + RT ln 3 2 Fe / Fe 2+ Fe / Fe 2+ ï F F a Fe a Fe a 3 OH î Оскільки парціальний тиск кисню в повітрі p O2 = 0,21 атм, те 8,314 × 293 0,21 E1 = 0,401 + = 0,699B, ln 4 4 × 96500 5,011 × 10 - 6 ( ) 8,314 × 293 3,2 × 10 -38 E 2 = 0,771 + ln 96500 0,3 × 3,6 × 10 -5 × 5,011 × 10 -6 ( ) -3 6 Для запобігання утворення осадів солей заліза і кальцію необхідне утворення розчинних комплексів з даними катіонами. Комплексоутворювач (у даному випадку Na2H2Edta) варто вводити в середовище перед додаванням солей заліза і кальцію (краще змішувати і розчиняти їх в окремому посуді, а потім додавати в середовище, що готується,), щоб не допустити утворення осаду. Розрахунок кількості ЕДТА для зв'язування кальцію і заліза При додаванні ЕДТА в середовищі спостерігаються наступні рівноваги: H2Edta2-+Са2++2ОН-ÛCaEdta2-+2Н2О, = -0,196B. H2 Edta ×(5,011 × 10 -6 ) 3 OH = 0,401 + 8,314 × 293 0,21 ln 4 × 96500 (5,011 × 10 -6 ) 4 знаходимо a Fe2+ = 4,4 × 10 -21 моль/л, отже, при досяганні хімічної рівноваги під час відсутності комплексоутворювача залізо осаджується практично цілком. K2 w K 3 K 4 = 2,34 × 10 21; Ca 2 Edta 2 a 2 OH a Fe2+ = K FeEdta2K2 w K 3 K 4 = 9,55 × 10 24 ; H2Edta-+Fe2++OH-ÛFeHEdta2-+Н2О, a FeHEdta K '' K2 = = FeHEdta K 3 = 3,86 × 10 14 , 2 Kw a a a 2+ 2OH Fe K CaEdta 2 - = 3,89 × 10 10 , K CaHEdta - = 3236, K FeEdta 2 - = 1,585 × 10 14 , K FeHEdta - = 7,24 × 10 6 3 рівняння 3,2 × 10 -38 K CaEdta2 де ДР Fe( OH)3 pO RT RT ln ln 4 2 = E o O / OH- + 2+ 3 2 F 4F a a Fe a Fe 2 + aH H2 Edta Порівняння двох окислювально-відновних потенціалів Е2 зазначених процесів утворення Fе(ОН)3 і FePO4 приводить до висновку, що в термодинамічному відношенні в середовищі вірогіднєє буде протікати відновна напівреакція з меншим потенціалом, тобто, що веде до утворення Fе(ОН)3. Якщо, однак, фосфат заліза (III) у деякій кількості й утвориться, то термодинамічне він буде хитливий, оскільки легко переходить у гідроксид заліза (III) по реакції FePO4+3OH-ÛFe(OH)3+PO43-, ПР FePO 4 = 10 16. K= ПР Fe(OH )3 Константа рівноваги цієї реакції дуже велика і рівновага, таким чином, зрушено вправо. При досяганні рівноваги в процесі утворення гідроксиду заліза (III) має місце рівність окислювально-відновних потенціалів: OH a FeEdta2 ' K2 = 13 × 10-22 × 10 -14 , 8,314 × 293 ln E2 = 0,771 + = 0,158B 96500 0,3 × 3,6 × 10 -5 × 0,227 × 10 -3 × 5,011× 10- 6 × 1,3 × 10 -12 8,314 × 293 ln 96500 a = H2Edta2-+Fe2++2ОН-ÛFeEdta2-+2H2О, E1=0,699B, 0,771 + a 2 OH- a Ca 2+ Edta 2 H2Edta-+Са2++ОН-ÛCaHEdta2-+Н2О, a CaHEdta K '' , K1 = = CaHEdta K 3 = 172 × 10 11 ; 2 Kw a 2- a 2+ - a pO2 ì RT o ln ïO 2 +2H2 O + 4e Û 4OH ,E1 = E O 2 / OH- + 4F a 4 ï OH ï 22+ íOH + Fe + HPO 4 Û FePO 4 +H 2 O + 1e , ï a Fe3 + a PO 3 - ×K W ДРFePO 4 K W RT 4 ï E = E o 3 + 2 + + RT ln = E o Fe 3 + / Fe2 + + ln 2+ 2+ Fe / Fe ï 2 F F a Fe a HPO 2 - a OH- K 3 a Fe a HPO 2 - a OH- K 3 4 4 î OH aH 2 Паралельно даному процесу теоретично може відбуватися й окислювання Fe2+ у FePO4: 4Fe+2+4HPO4-2+O2Û4FePO4+2H2O. Потенціали окислювально-відновних процесів у цьому випадку будуть E o Fe3 + / Fe2+ + a CaEdta2 ' K1 = - константи стійкості відповідних комплексних іонів; К3=533.10-7, К4=1,13.10-11 - константи іонізації етилендіамінтетрауксусної кислоти по третій і четвертій ступіні. Порівняння констант рівноваги дозволяє зробити висновок про те, що спочатку в комплекс переходять іони Fe2+ і, лише коли практично все залізо (II) буде зв'язано в комплексний іон, ЕДТА почне реагувати з іонами Са2+. Щоб осад солі кальцію не утворювався, активність іонів Са2+ повинна бути менше критичної, котру можна визначити з добутку розчинності найменш розчинного в даному середовищі з'єднання кальцію (середнього фосфату), тобто менше 4,91.10-6 моль/л. Підставляючи замість концентрацій відносини активностей до коефіцієнтів активності, що розраховується по рівнянню Дзвис для комплексів кальцію, ми можемо рішити систему рівнянь, складених з рівноваг комплексоутворення з іонами Са2+ і матеріального балансу кальцію в середовищі: 7 81508 a CaEdta2 ì = 2,34 × 10 21, ï -6 2 -6 ï a H Edta 2 - (5,011 × 10 ) × 4,91 × 10 ï 2 a CaHEdta ï = 1,72 × 10 11, í 2a H2 Edta 5,011 × 10 - 6 × 4,91 × 10 - 6 ï ï a -6 a 2ï CaEdta + CaHEdta + 4,91 × 10 = 3,6 × 10 - 4. ï 0,417 0,807 0,3 î Знаходимо: a CaEdta 2- = 1,432 × 10 -4 моль / л, a CaHEdta - = 2,1 × 10 -9 моль / л, aH 2 Edta 2 = 4,96 × 10 -10 моль / л. Помітно, що практично весь ЕДТА перейшов у найбільш стійкий комплекс. Очевидно, загальна концентрація усіх форм і комплексів ЕДТА в розчині буде дорівнювати сумі концентрацій a CaEdta2 +C Fe2= 3,8 × 10 -4 + 22+ 0,417 CaEdta і FeEdta : . -4 моль/л, таким чином, 3,8 10 моль/л, чи 0,143г/л, дигідрата динатриєвої солі ЕДТА необхідно вносити в середовище для запобігання осадження малорозчинних з'єднань. На практиці розчин містив 15%-ний надлишок ЕДТА (0,16г/л) у порівнянні зі стехіометричною кількістю, необхідною для зв'язування в комплекс заліза і кальцію. Надлишок ЕДТА вводили щоб уникнути утворення осаду внаслідок неточностей при узятті навішень солей і вивітрювання кристалогідратів. У 2000 році в лабораторних умовах був проведений експеримент, метою якого було: з'ясування впливу різних концентрацій ЕДТА в середовищі Заррука на ростові характеристики Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. При готуванні середовища Заррука були використані наступні початкові концентрації ЕДТА (у г/л): а) - 0,00008, б) - 0,08 (контроль), в) - 0,16, г) - 0,2, д) - 0,24. Варіант (в) містив 15%-ний надлишок ЕДТА (0,16г/л) у порівнянні зі стехіометрічною кількістю, необхідною для зв'язування в комплекс заліза і кальцію. Надлишок ЕДТА вводили щоб уникнути утворення осаду внаслідок неточностей при узятті навішень солей і вивітрювання кристалогідратів. На Фіг. 1 показані ростові характеристики (0750) спіруліни, вирощеної на середовищі Заррука з різним вихідним вмістом ЕДТА. Готування середовищ у перших двох випадках супроводжувалось випаданням осаду. У наступних варіантах осад не спостерігався, однак показники ростових характеристик мають розходження в усіх варіантах. Необхідно відзначити, що продуктивність контрольного варіанта (б) була на 10,2% нижче варіанта (в, д) і на 20% нижче варіанта (г). Таким чином, оптимум концентрацій ЕДТА, маючи на увазі результати, яки отримані в експерименті, знаходиться в межах від 0,16 до 0,2г/л ЕДТА, що підтверджує наші теоретичні розрахунки. При розрахункових концентраціях ЕДТА розчин виявляється кінетичне стійким і утворення осаду не спостерігається, усі необхідні для харчування клітки елементи знаходяться в розчиненій формі. Подальше збільшення ЕДТА призводить до зниження продуктивності мікроводорості, що може бути зв'язане з токсичністю даного з'єднання. 8 Біохімічні показники не погіршуються при загальному підвищенні ефективності способу культивування. Перевагою пропонованого середовища є: 1. Економічне використання з'єднань, що утримують залізо, кальцій і фосфор, у зв'язку з усуненням випадання осаду, до складу, якого входять ці елементи. 2. Підвищення продуктивності ціанобактерії Spirulina platensis від 10,2 до 20% відносно контролю (середовища Заррука), при збільшенні внесення ЕДТА в живильне від середовище 0,16 до 0,2г/л.