Спосіб лікування злоякісних пухлин із застосуванням ксеногенних рнк

1. Спосіб виготовлення лікарського засобу для лікування злоякісних пухлин, за винятком злоякісних захворювань шкіри, який відрізняється тим, що для виготовлення лікарського засобу застосовують ксеногенні РНК із тканин тварин, рослин та/або одноклітинних організмів, які еволюційно найбільш віддалені від організму, що підлягатиме лікуванню, в формі, придатній для системного застосування. C2 2 (11) 1 3 вання. Ці результати були додатково підтверджені численними дослідженнями різноманітних антигенів in vitro та in vivo. Проте в літературі немає вказівок, що нуклеїнові кислоти і, зокрема, олігоабо/та полірибонуклеотиди ксеногенного походження можуть бути придатними для лікування злоякісних пухлин. В той же час були виконані, зокрема, в США, експерименти з деякими синтетичними полі- та олігонуклеотидами, особливо з рибонуклеотидами, які, однак, не були продовжені в зв'язку з високою токсичністю цих речовин in vivo. Тому метою цього винаходу було виготовлення лікарського засобу, придатного для лікування злоякісних пухлин. Термін "злоякісні пухлини" у значенні, вживаному стосовно до цього винаходу, не охоплює злоякісні захворювання шкіри. Згадана мета досягається, згідно з цим винаходом, способом виготовлення лікарського засобу, придатного для лікування злоякісних пухлин, який містить як активну речовину ксеногенні олігоабо/та полірибонуклеотиди, у варіанті, якому віддається перевага, у формі їхніх кон'югатів із клітинами пухлини, яка підлягає лікуванню. Стосовно до цього винаходу термін "ксеногенний" означає, що певна рибонуклеїнова кислота походить з іншого організму, ніж організм, який підлягає лікуванню цією рибонуклеїновою кислотою, тобто він стосується таких оліго- або/та полірибонуклеотидів, які не походять із того самого організму, в котрий слід вводити згаданий лікарський засіб. Серед ксеногенних оліго- або/та полірибонуклеотидів, які застосовуються згідно з винаходом, перевага віддається оліго- або/та полірибонуклеотидам із тканин тварин (наприклад, тканин великої рогатої худоби, тканин плода корови), рослин та одноклітинних організмів, у варіанті, якому віддається перевага, із дріжджових клітин (зокрема, Saccharomyces cerevisiae). Перевага віддається застосуванню оліго- або/та полірибонуклеотидів з організмів, які еволюційно найбільш віддалені від організму, котрий підлягає лікуванню. Таким чином, при виготовленні лікарських засобів для людей перевага віддається PHK із тканин тварин, а особлива перевага - PHK із рослин або одноклітинних організмів, таких як, наприклад, дріжжі. Оліго- або/та полірибонуклеотиди, які застосовуються згідно з винаходом, є нетоксичними і самі по собі не є антигенними. Ефективним може бути застосування препаратів сумарної PHK та її солей та сполук. Особлива перевага віддається тРНК (транспортній PHK). Серед способів добування PHK, придатних для застосування згідно з винаходом, особлива перевага віддається екстракції фенолом, зокрема, способам, описаним в цьому документі під назвами способів І та II. Крім того, було виявлено, що ксеногенні рибонуклеїнові кислоти (PHK), зв'язані з пептидами, поліпептидами та протеїнами, підвищують антигенність останніх. На основі цих спостережень тканини пухлин уражених пацієнтів обробляли ксеногенними PHK як in vitro, так і in vivo. Перевага віддавалася обробленню клітин пухлинної тканини 86179 4 пацієнта ксеногенною PHK, у варіанті, якому віддається перевага, тРНК, in vitro. Потім одержану суміш вводили пацієнту системним способом. При поверхневих злоякісних пухлинах згадану PHK можна застосовувати також місцевим способом у відповідній лікарській формі. Окрім людини, лікуванню ксеногенними олігоабо/та полірибонуклеотидами згідно з цим винаходом можна піддавати також теплокровних тварин, наприклад, коней, велику рогату худобу, овець тощо. Винахід пояснюється більш детально поданими нижче прикладами та результатами випробувань. Приклади Приклад 1 Одержання оліго- або/та полірибонуклеотидів, придатних для застосування згідно з винаходом У відповідній літературі описані численні способи одержання нуклеїнових кислот, нуклеотидів та нуклеозидів, відомі кожному фахівцю у відповідній галузі. В цьому винаході перевага віддається двом способам, що ґрунтуються на фенолізації, з незначними відмінами: Способу І для добування сумарної PHK [Георгієв та Мантієва - G.P. Georgiev, V.L. Mantieva, Biochim. Biophys. Acta 61, 153 (1962)] та Способу II для одержання тРНК [Бауер та інші - S. Bauer et al., Biotechnology and Bioengineering 15, 1081 (1973)]. Обидва способи придатні для екстрагування порівняно великих кількостей продукту. Спосіб І 15% суспензію пивних дріжджів (Saccharomyces cerevisiae) в буфері (А) [буферний розчин 0,001M. етилендіамінтетраоцтової кислоти, 0,01M Трис-HCl, рН 5-6, 25% сахарози, 0,5% SDS (додецилсульфат натрію), 0,3% дезоксихолату натрію] гомогенізували протягом 3хв при температурі 10°C у змішувальному пристрої Waring Blendor при швидкості обертання 3000об/хв. Гомогенат змішували з таким самим об'ємом розчину (В) [80% перекристалізованого фенолу в буфері (А), 0,1% 8-гідроксихіноліну, 1,2% діетилпірокарбонату) і повільно перемішували при 60°C протягом 30 хв. Усі буферні розчини були виготовлені із застосуванням деіонізованої води, яку попередньо струшували з бентонітом. Потім фенолізований гомогенізат при кімнатній температурі (приблизно 20°C) піддавали центрифугуванню протягом 15хв при 10000gx. Водну фазу відділяли, фенольну та проміжну фази відкидали. До водної фази додавали такий самий об'єм суміші (1:1) розчину (В) та суміші хлороформу з ізоаміловим спиртом (96:4), і виконували екстракцію, як описано вище. Водну фазу тричі струшували з половинним об'ємом діетилового ефіру для видалення залишкового фенолу. Доводили розчин до концентрації ацетату натрію 2%, і осаджували PHK 2,5 об'ємами абсолютного етанолу. Осаджену PHK відділяли центрифугуванням при температурі 0°C та швидкості 5000об/хв і розчиняли в охолодженому льодом розчині 1M ТрисHCl, рН 7,0, та 0,001M MgCl2. Для розкладу ДНК, яка може бути присутньою, до одержаного розчину додавали електрофоретично чисту панкреатичну 5 ДНКазу (4мкг/мл), і інкубували розчин при 22°C протягом 3год. Потім залишкові білки, ДНКазу та РНКази ферментували з проназою (10мкг/мл) при 37°C протягом 3 год. За цей час відбувається також автоліз пронази. Розчин PHK піддавали екстракції розчином (В) при 60°C протягом 20хв при обережному перемішуванні, як описано вище, розділяли фази центрифугуванням, відбирали водну фазу і струшували з діетиловим ефіром. Після додавання ацетату натрію (до кінцевої концентрації 2%) PHK осаджували 2,5 об'ємами етанолу і відділяли центрифугуванням. Осад розчиняли в охолодженому 2% розчині ацетату натрію, осаджували 2,5 об'ємами етанолу і залишали стояти в суміші зі спиртом при -20°C протягом ночі. Потім осад відділяли центрифугуванням, промивали послідовно двічі 75% етанолом, двічі абсолютним етанолом і двічі діетиловим ефіром. Після висушування в сушильній шафі одержано PHK у вигляді сухої пухкої речовини, яку зберігали при кімнатній температурі в посудині з темного скла. Спосіб II Цей спосіб придатний також для екстрагування порівняно великої кількості дріжджів (порядку кілограмів). Відважену кількість дріжджів гомогенізували в чотирикратній кількості буфера (А) (дивись Спосіб І) в холодній камері. До гомогенату додавали 40% (об'ємних) розчину фенолу (В) та 5% (маси на об'єм) подрібненого льоду, одержаного з деіонізованої води, і перемішували протягом 30хв. Надосадову рідину відбирали відсмоктуванням і фенолізували ще двічі, як описано в Способі І. Водні надосадові рідини збирали в один збірник, де знаходилася суспензія DEAE-целюлози (діетиламіноетилцелюлози) (приблизно 10% маси на об'єм, продукт DE-22 фірми Whatman) в кількості, що відповідала половині об'єму зібраної рідини. DEAE-целюлозу підтримували в суспендованому стані шляхом перемішування протягом 30хв. Потім давали DEAE-целюлозі осаджуватися протягом 1год. Надосадову рідину відсмоктували. Одночасно проміжну фазу та фенольну фазу ще двічі перемішували з аліквотними кількостями розчину (C) (83% деіонізованої води, 15% (маси на об'єм) подрібненого льоду, 2% концентрату ацетату магнію (0,5M ацетату магнію в 0,25M меркаптоетанолу)) протягом 30хв і залишали на 70-80хв для розділення. Водні фази переносили в збірник з DEAEцелюлозою, знов суспендували і залишали для відстоювання. Надосадову рідину відсмоктували, і DEAE-целюлозу промивали спочатку, як описано вище, двічі розчином (C), а потім ще раз розчином (D) (2 об'єми концентрату ацетату магнію, 2 об'єми концентрату NaCl (3,75M NaCl у воді), 0,2 об'єми концентрату Трис-НСІ (2,5M Трис-НСІ, рН 7,5, у воді, 96 об'ємів води)). Потім DEAE-целюлозу завантажували в колонку, закриту знизу. Усі подальші стадії виконували в холодній камері при 4°С. Вміст колонки промивали 12-кратною кількістю розчину (D) при швидкості потоку рідини 1,4л/год (протікання тільки під впливом сили тяжіння). Потім елюювали тРНК розчином E (2 об'єми концентрату ацетату магнію, 0,2 об'єми концентрату Трис-НСІ, 14 об'ємів кон 86179 6 центрату NaCl, 84 об'єми води, кінцева концентрація NaCl 0,525M) при витраті 3л/год. Фракції із вмістом понад 35 А260нм, об'єднували і осаджували 1,5 об'ємами етанолу. Подальшу обробку виконували, як описано в Способі І. За альтернативним варіантом, останній осад розчиняли у воді і ліофілізували. Варіантом цього способу є звичайна фенолізація вихідного матеріалу: з верхньої фази осаджують неочищену тРНК ізопропанолом. Осад після центрифугування екстрагують натрійацетатним буфером і хроматографують на DEAEцелюлозі. Елюювання виконують у градієнтному режимі розчинами ацетату натрію та хлориду натрію за методикою, відомою біохімікам, що працюють у відповідній галузі. Придатні фракції (дивись вище) визначають вимірюванням відносного показника поглинання і об'єднують. Осаджують тРНК етанолом, осад відділяють, як описано вище, і у варіанті, якому віддається перевага, ліофілізують. Для визначення чистоти та ідентифікації сумарної PHK та тРНК застосовували перелічені нижче методи випробувань: Білки визначали за Лоурі [O.H.Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)] та за значенням А260/А280@2; ДНК за Діше [Dische, Mikrochemie 8, 4 (1930)]; сумарну PHK за Мейбаумом [Mejbaum, Physiol. Chem. 258, 117 (1939)]; кількісне визначення тРНК та вбудовування амінокислот за Шпринцлем та Штернбахом [Sprinzl, Sternbach, Methods in Enzymology 59, 182 (1979)]; токсичність за М. Нельднером [M. Noeldner, приватне повідомлення]; апірогенність in vitro за Фармакопеєю Німеччини (DAB 1997, випробування LAL), a in vivo - за Європейською Фармакопеєю та DAB 1997. Результати випробувань: (властивості сумарної PHK та тРНК, середні результати 10 вимірювань): Поглинання А260/А280@1,94-2,0 Елементний аналіз на C, H, N C 32,67 32,42 H 5,22 5,20 N 2,29 2,00 з відповідними значеннями для різних видів сумарної та тРНК. УФ та ІЧ спектри УФ та ІЧ спектри варіюють, вони є майже однаковими, але не ідентичними, залежно від біологічних речовин. Молекулярна маса Середнє значення для сумарної PHK та тРНК із дріжджів @22000-27000Да, варіює для різних препаратів. ПротеїДНК ни (загальний вміст) 2,3% яким нехтуємо Сумарна PHK з Saccharomyces cerevisiae 1,9% яким нехтуємо тРНК з Saccharomyces cerevisiae 0,9% яким нехтуємо Сумарна PHK з тканини великої рогатої худоби Продукти мають в середньому звичайний ступінь чистоти. Підвищена чистота при непропорцій 7 86179 но збільшених витратах не дала істотного покращення терапевтичного ефекту. Вбудовування амінокислот у тРНК. середнє значення для 10 випробувань Лізин 69-85пмоль на одиницю А260 Фенілаланін 41-55 Серин 39-50 Валін 77-90 Ці середні значення варіюють для дріжджів різних партій у вказаних межах. Токсичність Випробування на гостру токсичність для мишей: Тварини: миші лінії NMRI, самці, фірми Janvier, Франція Введення: внутрішньовенно, в хвостову вену Тривалість спостереження: 24год Кількість n=10 при найвищій концентвипадкових проб: рації Випробувана a) сумарна PHK з тканин речовина: великої рогатої худоби b) т-РНК з пивних дріжджів (Saccharomyces cerevisiae) Розчинник: 0,9% NaCl у воді для ін'єкцій Результат: У піддослідних тварин не спостерігалося жодних підозрілих явищ протягом періоду спостереження (24год) до максимальних доз 1г/кг в 10мл внутрішньовенно. Апірогенність А. Вміст пірогенів у сумарній PHK та в тРНК, що мають вищевказані характеристики, визначали за методикою випробування на ендотоксини in vitro згідно з DAB 1997 (випробування LAL), а також на кролях за Європейською Фармакопеєю та DAB 1997. 1. Сумарна PHK Стандарт - ендотоксин EC 5 Лізат амебоцитів: - номінальна чутливість 0,06EU/мл - визначена чутливість 0,06EU/мл Випробувальний розчин: 100мг PHK, розчинені в 20мл води з LAL (0,5%). Результат: Вміст ендотоксинів у випробувальному розчині 0,5%, розбавленому водою з LAL (1:5)