Спосіб прогнозування інвазивного та метастатичного потенціалу раку молочної залози

Спосіб прогнозування інвазивної та метастатичної активності раку молочної залози, що включає забір досліджуваного матеріалу, виявлення експресії ключового молекулярного маркеру - білка Е-кадгерину та оцінювання інвазивного та метастатичного потенціалу пухлини, який відрізняється тим, що як досліджуваний матеріал використовують плазму крові, в якій визначають C2 2 (19) 1 3 собою трансмембранний глікопротеїн, що забезпечує кальцій-опосередковану міжклітинну взаємодію, специфічно залучений до міжклітинної адгезії епітеліальних клітин та є важливим регулятором морфогенезу та пухлинним супресором. Аберантна експресія цього білку асоціюється з набуттям інвазивності та більш високою стадією захворювання для злоякісних пухлин багатьох локалізацій, зокрема і молочної залози. Нормальний протоковий епітелій молочної залози інтенсивно експресує білки Е-кадгерини на цитоплазматичних мембранах. Зміни гена Е-кадгерина (мутації, делеції, метилування), що можуть супроводжувати процес канцерогенезу, викликають втрату експресії цього білка чи зміну його локалізації в клітині, що має 2 важливих наслідки: порушуються міжклітинні контакти та морфогенетичні реакції клітини; відбувається накопичення βкатеніну в ядрі та підвищення його транскрипційної активності. В результаті стимулюється розмноження клітин та збільшується їх здатність до інвазії. Оскільки адгезивність та інвазія є важливою ланкою реалізації метастатичного потенціалу злоякісної клітини та характеристикою прогресії пухлинного росту, відсутність чи суттєве зниження експресії Е-кадгерину в тканині пухлини є несприятливою прогностичною ознакою протікання захворювання у хворих на рак молочної залози. Оцінка рівня експресії Е-кадгерину в тканині пухлини на сьогодні проводиться на клінічних зразках (отриманих інвазивним шляхом) трьома основними методами: імуногістохімічним, імуноблотингом та шляхом оцінки за експресією м-РНК. Останній метод [G.Berx, F. V. Roy. The Ecadherin/catenin complex: an important gatekeeper in breast cancer tumorogenesis and malignant progression // Brest Cancer Res., 2001; Vol. 3 (5): P.289-293] є наймолодшим, надзвичайно точним, проте володіє деякими недоліками, пов'язаними з хибно-позитивними результатами (через неспецифічність використовуваних праймерів чи контамінацію (забруднення) проб), нестабільністю власне молекул РНК та вартістю діагностичного обладнання. Досвід використання імуноблотингу [L. Mauro, S. Gatalano, G. Bossi et al. evidences that leptin upregulates E-cadherin expression in breast cancer: effects on tumor growth and progression // Cancer Res., 2007; Vol. 67: P. 3412-3421] в діагностичних лабораторіях теж свідчить про вірогідність хибнопозитивних результатів, які зумовлені більшим чином складнощами інтерпретації результатів. Зокрема, результат може бути розцінений як негативний навіть у разі наявності на стрипі імуноблоту однієї чи навіть кількох смуг. Найбільш близьким до запропонованого є спосіб прогнозування інвазивної та метастатичної активності раку молочної залози, який оснований на проведенні імуногістохімічного дослідження пухлини і виявлення в ній експресії Е-кадгерину, і включає забір досліджуваного матеріалу, виявлення експресії ключового молекулярного маркеру - білку Е-кадгерину та оцінювання інвазивного та метастатичного потенціалу пухлини, причому при рівні експресії нижче 5% вважають, що пухлина 92957 4 має високий інвазивний та метастатичний потенціал, що обумовлює неблагоприємний перебіг захворювання. Цей спосіб дозволяє отримати якісні та кількісні характеристики експресії досліджуваних білків (відсутність/наявність експресії, частка клітин з позитивною експресією досліджуваного білку), [В. E.Gould Rothberg, M. В. Bracken. Ecadherin immunohistochemical expression as a prognostic factor in infiltrating ductal carcinoma of the breast: a systematic review and meta-analysis // Breast Cancer Res. and Treatment, 2006; Vol. 100, N 2: P. 139-148]. Проте, як і випадках інших методів оцінки експресії Е-кадгерину, недоліком найближчого аналогу є те, що як матеріал для аналізу використовують тканину пухлини, що отримується шляхом інвазивної діагностики (напр.: трепан-біопсії). Це може негативно позначитися на подальшому перебігу захворювання, або під час операції. В основу винаходу покладене завдання створити такий спосіб прогнозування інвазивного та метастатичного потенціалу пухлини на основі оцінки рівня експресії Е-кадгерину, в якому заміна чинників, які вивчають, дозволить побудувати достовірний прогноз на доопераційному етапі без застосування інвазивних діагностичних методик (інвазивного втручання). Для вирішення завдання запропонований спосіб прогнозування інвазивного та метастатичного потенціалу раку молочної залози, який включає забір матеріалу, що досліджують, виявлення рівня експресії ключового молекулярного маркеру - білку Е-кадгерину та оцінювання інвазивного та метастатичного потенціалу пухлини, за яким, згідно з винаходом, як матеріал, що досліджують використовують плазму крові, в якій визначають рівень гомоцистеїну, після чого встановлюють діапазон рівня експресії Е-кадгерину за формулами: для однієї межі діапазону: 2 2 Е-кадг=k1+k2В+k3Н+k4В +k5ВхН+k6H , де Е-кадг - рівень експресії Е-кадгеринів (відсоток клітин з позитивною експресією досліджуваного білку); k - коефіцієнт пропорційності, %; В - вік хворої, роки; H - рівень гомоцистеїну в плазмі крові, мкМ; причому для І стадії захворювання k1=19,726%; k2=-1,910%; k3=5,946%; k4=0,050%; k5=-0,340%; k6=0,812%; для IIа стадії захворювання k1=-29,630%; k2=3,450%; k3=-6,930%; k4=-0,051%; k5=0,149%; k6=0,141%; для IIб стадії захворювання k1=-77,810%; k2=0,530%; k3=6,698%; k4=0; k5=0; k6=0; для III стадії захворювання k1=25,17%; k2=1,450%; k3=7,160%; k4=0; k5=0; k6=0; для другої межі діапазону: E кадг k7 0,4B 110,46 1,0H 19,5 0,6Cm 200 5 92957 де Cm - стандартизований показник стадії захворювання, що дорівнює 100 для І стадії захворювання, 200 - для На стадії, 250 - для IIб стадії, 300 - для III стадії; k7 - коефіцієнт пропорційності, рівний 1,8% при рівні гомоцистеїну нижче 9,75 та рівний 30,0% в усіх інших випадках; причому, вважають, що пухлина має високий метастатичний та інвазивний потенціал, якщо діапазон рівня експресії Е-кадгеринів є меншим за 5%. Запропонований спосіб заснований на аналізі клініко-морфологічних, лабораторних параметрів пацієнтів та молекулярно-біологічних характеристик пухлин 117 хворих на рак молочної залози І-III стадій (навчальна вибірка), які перебували на лі 6 куванні у відділенні пухлин молочної залози Інституту онкології АМН України та Київської міської онкологічної лікарні протягом 2005-2007 pp. Рівень гомоцистеїну визначався за допомогою комерційного набору "FHCY100 Axis Homocysteine EIA kit" виробництва "Axis-Shield" (Великобританія). Експресія молекулярних маркерів оцінювалася шляхом традиційного імуногістохімічного аналізу з використанням моноклональних антитіл виробництва "DakoCytomation" (Данія). Кількість хворих, що ввійшли в дослідження, з рівнем експресії Е-кадгерина в тканині пухлини 5% та більше наведено в таблиці, що є характеристикою достовірності отриманих результатів Таблиця Встановлення вірогідності розрахунків експресії Е-кадгерину у хворих на рак молочної залози в залежності від стадії захворювання та віку Стадія захворювання І IIа IIб III Разом доля хворих (%) до 45 років 42,9 80 50 61,5 Для підтвердження ефективності запропонованого способу діагностики молекулярнобіологічних характеристик пухлин була здійснена перевірка на контрольній групі хворих на рак молочної залози, котрі перебували на лікуванні в Тернопільському обласному комунальному клінічному диспансері протягом 2007-2008 pp. Конкретні приклади виконання способу: Приклад 1. Хвора Л., 70 років. Госпіталізована у плановому порядку з приводу підозри на рак молочної залози. Після обстеження встановлено діагноз: рак молочної залози III ст. Прогноз перебігу захворювання невідомий, так як невідомий інвазивний та метастатичний потенціал пухлини. Рекомендовано оперативне лікування. З метою визначення прогнозу та метастатичного потенціалу пухлини на доопераційному етапі у хворої був узятий аналіз венозної крові і визначений рівень гомоцистеїну в плазмі крові, що склав 13,2 мкМ. За відповідними формулами був визначений діапазон рівня експресії Е-кадгеринів. Проведені наступні розрахунки: для однієї межі діапазону: Е-кадг=25,17%1,450%*70+7,160%*13,2+0*702+0*70*13,2+0*13,22= 18,18% для другої межі діапазону: Екадг=30,0%*(0,4*70/110,46+1,0*13,2/19,5+0,6*300/2 00)=54,91% Вік хворих 45-55 років 50 66,7 100 0 59,6 понад 55 років 55,6 72,7 20 66,7 59,6 Сума за стадією 52,8 70,6 44,4 50 59,8 Отже, діапазон рівня експресії Е-кадгеринів за проведеними розрахунками прогнозується 18,854,91%. Таким чином, оскільки всі отримані розрахунки перевищують значення 5%, то був зроблений висновок, що перебіг захворювання сприятливий, оскільки низька вірогідність метастазування пухлини, низький інвазивний потенціал. Після проведення оперативного втручання та імуногістохімічного дослідження тканини пухлини встановлено, що рівень експресії Е-кадгеринів в тканині пухлини був приблизно 20%. Таким чином, відзначений збіг прогнозних розрахунків та фактичних даних. Приклад 2. Хвора К., 69 років. Госпіталізована у плановому порядку з приводу підозри на рак молочної залози. Після обстеження встановлено діагноз: рак молочної залози III ст. Прогноз перебігу захворювання невідомий, так як невідомий інвазивний та метастатичний потенціал пухлини. Рекомендованооперативне лікування. З метою визначення прогнозу та метастатичного потенціалу пухлини на доопераційному етапі у хворої був узятий аналіз венозної крові і визначений рівень гомоцистеїну в плазмі крові, що склав 8,03 мкМ. За відповідними формулами був визначений діапазон рівня експресії Е-кадгеринів. Проведені наступні розрахунки: для однієї межі діапазону: Е-кадг=25,17%1,450%*69+7,160%*8,03+0*692+0*69*8,03+0*8,032= -17,38%, але оскільки експресія не може бути негативною, то результат вважаємо 0; 7 92957 для другої межі діапазону: Екадг=1,8%*(0,4*69/110,46+1,0*8,03/19,5+0,6*300/20 0)=2,81% Отже, діапазон рівня експресії Е-кадгеринів за проведеними розрахунками прогнозується 02,81%. Таким чином, оскільки отримані розрахунки не перевищують значення 5%, то був зроблений висновок, що перебіг захворювання несприятливий, оскільки пухлина характеризується підвищеним інвазивним потенціалом та метастатичною активністю. Після проведення оперативного втручання та імуногістохімічного дослідження тканини пухлини встановлено, що експресія Е-кадгеринів в тканині пухлини була майже відсутня (одиничні клітини;