Спосіб оцінки рослин конопель на наявність канабіноїдних сполук

Реферат: Спосіб оцінки рослин конопель на наявність канабіноїдних сполук включає підготовку розчину барвника тривкого синього Б в етанолі, підготовку рослинних зразків, проведення якісної реакції і оцінку рослин конопель на наявність канабіноїдів за інтенсивністю забарвлення в зоні дифузії екстракту на фільтрувальному папері. Використовують 0,04 % розчин барвника тривкого синього Б в етанолі, для приготування якого порції барвника заздалегідь готують з використанням аналітичних ваг. Після прояву кольорової реакції виконують порівняння інтенсивності забарвлення в зоні дифузії екстракту зразка з інтенсивністю забарвлення в зоні дифузії еталону-свідка, що являє собою попередньо нанесений екстракт рослин конопель із заданим вмістом канабіноїдних сполук на фільтрувальний папір. UA 107426 U (12) UA 107426 U UA 107426 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до рослинництва, а саме до селекції конопель з відсутністю психотропних властивостей. У зв'язку зі створенням сортів промислових конопель з низьким вмістом або повною відсутністю канабіноїдів актуальним стало питання підвищення точності і достовірності оцінки селекційного матеріалу експрес-методом до цвітіння рослин в польових умовах, що забезпечило б цілеспрямоване перезапилення бажаних генотипів на селекційних розсадниках. Відомим є експрес-метод якісної оцінки рослин конопель за вмістом канабіноїдів (Методические указания по качественной оценке конопли на содержание каннабиноидов, получению тетраплоидных форм и использованию этрела /[М.М. Сажко, В.Г. Вировец, Л.М. Горшкова и др.]. - М., 1985. - 16 с.), в основу якого покладено прояв кольорової реакції канабіноїдів з барвником тривким (міцним) синім Б у насиченому розчині натрій карбонату. Недоліком відомого способу є те, що для його здійснення використовують пластини для тонкошарової хроматографії, вартість яких досить висока. Крім цього, на одній пластині можна розмістити незначну кількість рослинних зразків (16 шт.). У відомому способі кількість барвника тривкого синього Б відмірюється окомірно (на основі досвіду виконавця аналізу), що не дає можливості достовірно оцінювати рослинні зразки за досліджуваною ознакою чи порівнювати їх між собою. Еталон-свідок у відомому способі не використовують. Відомий спосіб оцінки рослин конопель на наявність канабіноїдів (Пат. 52427 UA, А01Η 1/04. Спосіб оцінки рослин конопель на наявність канабіноїдів /І.М. Лайко; заявник і патентовласник Інститут луб'яних культур УААН. - № 2002053930; заявл. 14.05.02; опубл. 16.12.02, Бюл. № 12.), в основу якого покладено порівняльний аналіз інтенсивності забарвлення зони дифузії екстракту досліджуваного матеріалу та еталону-свідка з заданим вмістом канабіноїдів. Недоліком відомого способу є те, що рослинні зразки хоча і порівнюються за інтенсивністю забарвлення, однак маса еталону-свідка і барвника визначаються в польових умовах визначають окомірно (на основі досвіду виконавця аналізу). Внаслідок цього результати будуть мати низьку достовірність, оскільки однакової для всіх зразків концентрації розчину барвника і співвідношення "рослинний зразок: розчинник" не дотримуються. Відомий спосіб оцінки рослин конопель на наявність канабіноїдів (А.с. 1188926 СССР, А01G 7/00, А01Η 1/04. Способ оценки растений конопли на наличие каннабиноидов /М.М. Сажко, В.Г. Вировец, Л.М. Горшкова (СССР). - № 3776785/30-15; заявл. 29.05.84; зарег. 01.07.85.), який включає проведення якісної реакції зі спиртовим розчином барвника тривкого синього Б і оцінку рослин конопель на наявність канабіноїдів за зміною інтенсивності забарвлення в зоні дифузії екстракту. Основним недоліками відомого способу є те, що його не доцільно застосовувати для зразків зі значно зниженим вмістом канабіноїдних сполук чи повною відсутністю, оскільки вибрана досить висока концентрація розчину барвника - 0,1-0,2 %, при якій будуть давати характерне червоне забарвлення (чи червоне з відтінками) не лише канабідіол, тетрагідроканабінол, канабінол, а й інші другорядні фенольні сполуки. Інтенсивність забарвлення не порівнюється з еталоном-свідком. У відомому способі використовують зазвичай 5-10 крапель розчину тривкого синього Б на 1 зразок. Пляма розтікання екстракту становить більше 400 мм, що призводить до невиправдано високих витрат фільтрувального паперу й реактивів. Відомий спосіб за технічною суттю і результатом, що досягається, є найбільш близьким до корисної моделі і може бути вибраний як прототип. У основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб оцінки рослин сучасних промислових конопель на наявність канабіноїдів, за яким зразки аналізували б в однакових експериментальних умовах, використовували оптимальну концентрацію барвника і кількість еталону-свідка для забезпечення однакової дії розчину на зразки, що відрізняються різним вмістом канабіноїдних сполук. Поставлена задача вирішується тим, що в способі оцінки рослин конопель на наявність канабіноїдних сполук, який включає підготовку розчину барвника тривкого синього Б в етанолі, підготовку рослинних зразків, проведення якісної реакції і оцінку рослин конопель на наявність канабіноїдів за інтенсивністю забарвлення в зоні дифузії екстракту на фільтрувальному папері, згідно з корисною моделлю, використовують 0,04 % розчин барвника тривкого синього Б в етанолі, для приготування якого порції барвника заздалегідь готують з використанням аналітичних ваг, а після прояву кольорової реакції виконують порівняння інтенсивності забарвлення в зоні дифузії екстракту зразка з інтенсивністю забарвлення в зоні дифузії еталону-свідка, що являє собою попередньо нанесений екстракт рослин конопель із заданим вмістом канабіноїдних сполук на фільтрувальний папір. Використання 0,04 % розчину барвника тривкого синього Б в етанолі забезпечує оптимальний прояв інтенсивності забарвлення і фарбування основних канабіноїдних сполук. 1 UA 107426 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Використання аналітичних ваг для вимірювання кількості барвника дозволяє мінімізувати вплив на результати аналізу досвіду виконавця аналізу. Порівняння інтенсивності забарвлення в зоні дифузії екстракту зразка з інтенсивністю забарвлення в зоні дифузії еталону-свідка, який являє собою попередньо нанесений екстракт рослин конопель із заданим вмістом канабіноїдних сполук на фільтрувальний папір, дозволяє більш об'єктивно порівнювати досліджуваний зразок з еталоном-свідком. Це досягається завдяки стабільній концентрації канабіноїдів в еталоні-свідку під час проведення всіх аналізів. Крім цього, використання нанесеного екстракту еталону-свідка зручне в польових умовах. Спосіб реалізується на практиці наступним чином. У лабораторії готують листки з фільтрувального паперу розміром 200×200 мм, які розкреслюють олівцем на 100 клітинок розміром 20×20 мм. У крайні ліві клітинки наносять по одній краплі еталону-свідка з заданим (визначеним) вмістом канабіноїдних сполук. Як правило, використовують спиртовий екстракт рослинного матеріалу сорту ЮС-9. Після нанесення крапель еталону-свідка листки фільтрувального паперу висушують при кімнатній температурі. На аналітичних вагах готують порції барвника тривкого синього Б масою 0,002±0,0001 г, поміщають їх у флакони з темного скла, закривають пробками і ставлять вертикально. При проведенні масових аналізів доцільно готувати більші порції для декількох дослідників, що прискорює процес приготування робочих розчинів і зменшує витрати часу на зважування. Безпосередньо перед аналізом у польових умовах готують робочий розчин барвника. Для цього кожну порцію барвника у флаконі (0,002±0,0001 г) розчиняють 0,18-0,20 мл дистильованої води і додають 5 мл 96 % етанолу, або роблять відповідний перерахунок, якщо порція барвника інша. На еталон-свідок наносять 1 краплю робочого розчину барвника. Із середньої частки листкової пластинки досліджуваної рослини конопель відокремлюють зразок розміром приблизно 5×5 мм і поміщають його в центрі клітинки на листку з фільтрувального паперу. На зразок із піпетки наносять 1 краплю робочого розчину барвника. З моменту нанесення барвника одночасно здійснюється екстракція канабіноїдів в етанолі і якісна реакція з барвником. При наявності у рослинах канабіноїдів у зоні дифузії екстракту проявляється характерне забарвлення – червоне або червоне з відтінками. Інтенсивність забарвлення зразка порівнюють з інтенсивністю забарвлення еталона-свідка і роблять відповідний висновок. Дев'ять зразків порівнюють з одним еталоном-свідком. Достовірність і точність даного способу підтверджено порівнянням його результатів з результатами напівкількісного методу тонкошарової хроматографії, кількісного методу газової хроматографії з мас-селективним детектуванням. У зразках рослин конопель, які дали негативну кольорову реакцію, не виявлено канабіноїдних сполук жодним з перелічених вище методів. Зразки з меншою інтенсивністю забарвлення містили меншу кількість канабіноїдів, а з більшою інтенсивністю забарвлення - більше цих речовин. Спосіб знайшов застосування в селекційному процесі. Завдяки йому створено кілька сортів конопель без психотропних властивостей та збереженням стабільності цієї ознаки в процесі первинного насінництва і подальшого репродукування. Спосіб оцінки рослин на наявність канабіноїдних сполук дозволяє прискорити селекційний процес на зниження вмісту основних канабіноїдних сполук (канабідіолу, тетрагідроканабінолу і канабінолу) завдяки швидкому, більш достовірному і точному аналізу великої кількості рослин конопель з межами варіювання ознаки від відсутності до високого вмісту. 45 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 Спосіб оцінки рослин конопель на наявність канабіноїдних сполук, який включає підготовку розчину барвника тривкого синього Б в етанолі, підготовку рослинних зразків, проведення якісної реакції і оцінку рослин конопель на наявність канабіноїдів за інтенсивністю забарвлення в зоні дифузії екстракту на фільтрувальному папері, який відрізняється тим, що використовують 0,04 % розчин барвника тривкого синього Б в етанолі, для приготування якого порції барвника заздалегідь готують з використанням аналітичних ваг, а після прояву кольорової реакції виконують порівняння інтенсивності забарвлення в зоні дифузії екстракту зразка з інтенсивністю забарвлення в зоні дифузії еталону-свідка, що являє собою попередньо нанесений екстракт рослин конопель із заданим вмістом канабіноїдних сполук на фільтрувальний папір. 2 UA 107426 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3