Спосіб оцінки рослин конопель на наявність каннабіноїдів

Спосіб оцінки рослин конопель на наявність каннабшоїдів, що включає проведення якісної ре акції та оцінку рослин конопель на наявність каннабшоїдів експрес-методом за зміною забарвлення зони дифузії, який відрізняється тим, що оцінка проводиться на основі порівняльного аналізу інтенсивності забарвлення зони дифузії досліджуваного матеріалу та еталону-свідка з заданим вмістом каннабшоїдів для кожного екотипу конопель Винахід відноситься до рослинництва, а саме до селекції конопель з відсутністю або мінімальним вмістом каннабшоїдів, тобто безнаркотичних конопель ЦІННІСТЬ НОВИХ сортів конопель полягає в тім, що поряд з високими врожаями стебел, волокна та насіння коноплі втрачають свою головцу особливість - наркотичну активність Безнаркотичні сорти конопель створюються завдяки чіткому контролюванню ознаки вмісту каннабшоїдних сполук в процесі селекції Відомий спосіб визначення каннабшоїдів методом тонкошарової хроматографії /ТШХ/ на Сілуфолі /М В Кисин и др Применение хроматографии в тонких слоях при исследовании вещественных доказательств Москва, 1973 с 51 56, ДСВ Відомий спосіб складний, вимагає значних затрат праці, часу та матеріальних засобів Відомий спосіб оцінки рослин конопель на наявність каннабшоїдів по реакції з 0,05% розчином тривного /прочного/ синього Б в 10% розчині карбоната натру або ІН розчину їдкого натру Наважку досліджуваної речовини /1г/ впродовж 1 години екстрагують Юмл 96° етилового спирту Одержаний екстракт відфільтровують Декілька капель фільтрату наносять на фільтрувальний папір, після висушування обприскують свіжеприготовленим розчином тривного /прочного/ синього Б По забарвленню визначають про присутність каннабшоїдів /кн "Исследование гашиша" ВНИИМВД Москва 1970 с 6 ДСВ/ Відомий спосіб тривалий і його можна виконувати тільки в лабораторних умовах тому, що для аналізу необхідний висушений рослинний матеріал, з якого спочатку екстрагують каннабшоїди, а потім наносять екстракт на фільтрувальний папір, а після висушування фарбують Більш простим є відомий спосіб оцінки рослин конопель на наявність каннабшоїдів, який включає проведення якісної реакції та оцінки рослин експрес-методом за зміною забарвлення зони дифузії /А с СРСР № 1188926, А 01 Н 1/04, 1984, ДСВ/ При цьому на фільтрувальний папір, попередньо просочений насиченим розчином карбоната натру в польових умовах розміщують рослинну тканину, на яку по крапельці наносять 0,1 - 0,2% спиртовий розчин барвника тривкого /прочного/ синього Б Відомий спосіб по технічній сутності і результату, що досягається, є найбільш близьким до винаходу і може бути обраний в якості прототипу Але відомий спосіб має недостатню вірогідність одержаних результатів оцінки селекційного матеріалу на наявність каннабшоїдів в залежності від екотипу конопель В основу винаходу поставлене завдання удосконалити спосіб оцінки рослин конопель на наявність каннабіноідів, в якому оцінка буде більш вірогідною за рахунок зміни порядку проведення аналізу зони дифузії Поставлене завдання вирішується тим, що в способі оцінки рослин конопель на наявність каннабшоїдів, який включає проведення якісної реакції та оцінки рослин конопель на наявність каннабшоїдів експрес-методом за зміною забарвлення зони дифузії, згідно винаходу оцінка проводиться на основі порівняльного аналізу інтенсивності забарвлення зони дифузії досліджуваного/ матеріалу та еталону-свідка з заданим вмістом каннабшоїдів ю 52427 для кожного екотипу конопель Від правильного вибору еталона-свідка, використаного для порівняння з досліджуваним зразком, залежить вірогідність результатів оцінки селекційного матеріалу конопель на наявність каннабшоїдів Вірогідність оцінки вмісту каннабшоідїв в коноплях значно підвищує ефективність відбору селекційного матеріалу безнаркотичних сортів При аналізі рослинного матеріалу різного екотипу - середньоросійського та південного - відзначена різниця в забарвленні в кольоровій реакції Зразки середньоросійських конопель давали радужне забарвлення - червоне з розводами жовтого Дослідами було виявлено, що червоне забарвлення дає каннабідюл /КБД/1 тетрапдроканнабшол /ТГК/, а жовте - каннабідюлова кислота /КБДК - 4та пляма на пластинах Сілуфол/, а каннабінол /КБН/ нейтральний /практично безбарвний/ Всі каннабшоїди були виділені окремо з пластин і ідентифіковані на газорідшному хроматографі Таке ж забарвлення має ВІДПОВІДНО еталон-свідок, в якості якого використовується сорт конопель ЮС-9, в якому вміст всіх каннабшоїдів при аналізі методом тонкошарової хроматографії відповідає 3 балам Зразкам південних конопель характерне однотонне малинове забарвлення без розводів, що свідчить про значний вміст каннабшоїдів - більше 10 балів Тому еталон-свідок з сорту конопель ЮС-9 не дозволяє вірогідно оцінити вміст каннабіНОІДІВ Для цих зразків береться інший еталонсвідок - зразок південних конопель, який також дає однотонне малинове забарвлення, але значно меншої інтенсивності /вміст КБД - 6 балів, ТГК 10 балів і КБН - 9 балів/ Тому для зразків конопель з пониженим вмістом каннабшоїдів пропонується еталон-свідок з вмістом всіх компонентів каннабіноідів не більше 3-х балів При цьому в селекційному матеріалі всі зразки, які показують інтенсивність забарвлення вище свідка, вибраковуються до ЦВІТІННЯ З розсадника До моменту початку ЦВІТІННЯ В розсаднику залишаються тільки ті рослини, яким властива повна відсутність забарвлення або дуже слабка Еталон-свідок для зразків південного типу конопель дає можливість проводити аналіз конопель з високим вмістом каннабшоїдів експрес-методом в польових умовах Це важливо для розсадників гібридизації зразків конопель з високим і низьким вмістом каннабшоїдів Наявність еталона-свідка з заданим вмістом каннабшоїдів /ТГК 10 балів/ дає можливість проводити аналізи гібридів уже на ранніх етапах селекції, що значно прискорює процес зниження вмісту каннабшоїдів у новому вихідному матеріалі Еталони-свідки щорічно підтверджуються шляхом порівняльного аналізу попередніх еталонів з новим експрес-методом та тонкошаровою хроматографією Для прикладу на мал 1 зображена пластина, використана при аналізі рослинних зразків конопель експрес-методом В 1-му ряду приведене забарвлення виділених компонентів каннабшоїдів, а саме каннабідюла /КБД/, тетрапдроканнабшола /ТГК/, каннабшола /КБН/ та каннабідюлових кислот /КБДК/, в ІІ-му - забарвлення зразків конопель середньоросійського типу, на ІІІ-му - забарвлення зразків конопель південного типу Порівняльна оцінка зразків конопель середньоросійського типу полягає в виділенні зразків з мінімальним вмістом каннабшоїдів Кольорова реакція /II ряд/ двох досліджуваних зразків по інтенсивності забарвлення значно слабше свідка, що підтверджується результатами тонкошарової хроматографії /ТШХ/, яка показує вміст каннабшоїдів /на пластинах Сілуфол/ не вище сліду і слабкого сліду Серед зразків конопель південного типу /III ряд/ один досліджуваний зразок по інтенсивності забарвлення на рівні свідка з вмістом ТГК 10 балів, а другий значно перевищує свідка більш ніж в 2 рази /по ТШХ вміст ТГК становить 10 балів/ Використання при аналізі експрес-методом еталонівСВІДКІВ з заданим вмістом каннабшоїдів дозволяє проводити порівняльну оцінку вмісту каннабшоїдів за ступенем інтенсивності забарвлення зони дифузії досліджуваного зразка з розчином реагентафарбника Приклади конкретного виконання способу приведені на мал 2 - забарвлення зразків конопель середньоросійського типу з пониженим вмістом каннабшоїдів та на мал 3 - забарвлення зразків конопель південного типу з високим вмістом каннабшоїдів Селекційний матеріал, який відноситься до середньоросійського типу /мал 2/ відрізняється пониженим вмістом каннабшоїдів, у ВІДПОВІДНОСТІ З чим в еталоні-свідку, який використовується, вміст всіх компонентів каннабшоїдів складає 3 бала При порівнянні забарвлення еталона-свідка і II зразків відмічається, що тільки в 2-х зразках /№ 2 і № З/ інтенсивність забарвлення злегка перевищувала або була на рівні свідка Кольорова реакція зразків № 1, № 5, № 6, № 7, № 10 відрізняється меншою інтенсивністю, що за тонкошаровою хроматографією оцінюється в 1 - 2бала При селекції конопель на зниження вмісту каннабшоїдів до початку ЦВІТІННЯ конопель проводиться експрес-аналіз усіх рослин на селекційному розсаднику і такі рослини, як № 1, № 2, № 3, № 5, № 6, № 7 і 10 вибраковуються з метою контролювання і створення умов перезапилення між рослинами з мінімальним вмістом каннабшоїдів або їх відсутністю На розсаднику залишаються тільки ті рослини, кольорова реакція яких відповідає забарвленню рослин № 4, № 8, № 9 і №11 Для зразків південних конопель з вмістом каннабшоїдів більше 10 балів пропонується еталонсвідок з цієї ж групи конопель, тобто південного типу, з обмеженим вмістом каннабшоїдів 9-10 балів /мал З/ Аналізуючи експрес-методом II зразків південних конопель, бачимо, що рослини № 2, № 4 і № 9 перевищують еталон-свідок з насищенності їх зон дифузії більше ніж в 2 рази, що підтверджується тонкошаровою хроматографією /вміст ТГК складає > » 10 балів або 25балів/ Рослини під номерами 10 і 11 - на рівні свідка, а № 1, № 3, № 5, № 6, № 7, № 8 відрізняються меншою інтенсивністю /4 - 6 балів/ 52427 На перших етапах селекції при аналізі гібридного матеріалу, одержаного при схрещуванні зразків з високим і низьким вмістом каннабшоїдів, вибраковуються рослини, інтенсивність забарвлення яких на рівні або вище еталона-свідка /вміст ТГК 9 - 1 0 балів/ У наступних поколіннях використовують інший еталон-свідок з більш низьким вмістом каннабшоїдів /на рівні 3-х балів/ Використання еталонів-свідків з заданим вмістом каннабшоїдів для кожного екотипу конопель сприяє прискоренню селекції конопель на зниження вмісту всіх компонентів каннабіноідів Ефективність заявленого способу оцінки рослин конопель на наявність каннабшоїдів підтверджується результатами аналізу елітних рослин методом тонкошарової хроматографії Таблиця Ефективність заходу вибраковування рослин конопель по вмісту каннабшоїдів до початку ЦВІТІННЯ /2001 р / КІЛЬКІСТЬ рослин по роках Вміст ТГК в балах 0 Слабі СЛІДИ-СЛІДИ 1-3 4-6 7-Ю 2000 штук 87 34 4 5 17 2001 % 59,2 23,1 2,7 3,4 11,6 штук 375 17 4 3 6 % 92,92,66 4,2 1,0 0,7 1,5 Примітка 0-відсутні каннабшоїди Із таблиці видно, що в 2000 році рослин конопель сорту ЮСО-31 з відсутністю ТГК налічувалось тільки 59,2% У 2001 році застосування ранньої діагностики та порівняльного аналізу індивідуальних рослин і еталона-свідка з заданим вмістом каннабшоїдів сприяло збільшенню КІЛЬКОСТІ таких рослин до 92,6% Крім того, рослин з наявністю каннабшоїдів від слабких СЛІДІВ до 10 балів скоротилось від 40,8 до 7,4% Приведені результати підтверджують перспективність застосування даного способу селекції однодомних конопель І . Забарвленії ьмд^ленж ібічоїдіь з|;азк'в ЩБД*" UC -І-С8 І f ви IMIiV 52427 О И ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71