Спосіб діагностики шарки сливи

Реферат: Спосіб діагностики шарки належить до області дослідження матеріалів шляхом визначення їх фізичних властивостей, зокрема визначення флуоресценції нативного хлорофілу інтактного листка рослини. Спосіб орієнтовано на застосування у сільському господарстві, рослинництві, садівництві та селекційній роботі і, зокрема, призначений для ранньої експресної діагностики ураженості рослин вірусною шаркою. Спосіб полягає у побудові та порівнянні індукційних кривих, побудові різницевої кривої дослідної та контрольної рослин, виділенні на ній інтервалу 50-150 мсек на швидкій фазі і визначенні наявності в цьому інтервалі мінімуму кривої індукції флуоресценції. При наявності такого мінімуму рослину вважають ураженою шаркою. UA 114239 C2 (12) UA 114239 C2 UA 114239 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спосіб належить до області дослідження матеріалів шляхом визначення їх фізичних властивостей, зокрема визначення флуоресценції нативного хлорофілу інтактного листка рослини, шляхом запису і аналізу кривої індукції флуоресценції хлорофілу (індукційна крива, крива Каутського) рослинних об'єктів. Спосіб орієнтовано на застосування у сільському господарстві, рослинництві, садівництві та селекційній роботі. Зовнішні ознаки ураженості листя шаркою, вірусною строкатістю, карбонатним, хлорозом, хлоротичною плямистістю тощо, схожі і розрізнити їх складно, навіть при явних ознаках, а окомірні визначення суб'єктивні. Відомий "Способ обнаружения вирусных инфекций растений" SU 1507253; A01G 67/00, GO1N 21/35, який полягає у реєстрації інфрачервоного поглинання листа рослини у -1 спектральній області 8501750 нм із швидкістю 160400 см /хв. Ураженим вважають зразок з максимальною інтенсивністю інфрачервоного поглинання в порівняні із здоровою рослиною. Спільними рисами аналога і запропонованого способу є опромінення рослини, прийом та вимірювання оптичного сигналу, що взаємодіє з опроміненою областю листа. Причиною, що заважає одержанню очікуваного технічного результату є те, що спосіб-аналог не дозволяє діагностувати шарку сливи. Відомо спосіб запису, інтерпретації та використання індукції флуоресценції нативного хлорофілу представлений у роботі Корнєв Д.Ю. Информационные возможности индукции флуоресценции хлорофилла. - Киев: Альтерпрес, 2002 г. Спосіб-аналог запису кривої індукції флуоресценції хлорофілу полягає в опроміненні листа рослини в діапазоні хвиль 400650 нм після його темнової адаптації, прийому та вимірювані сигналів флуоресценції в діапазоні хвиль 670770 нм та побудові індукційної кривої з поточних значень флуоресценції. Спільними рисами аналога та запропонованого способу є вимірювання і реєстрація поточних значень флуоресценції, з яких будують індукційну криву флуоресценції нативного хлорофілу. Причиною, що заважає одержанню очікуваного технічного результату є те, що у способі аналога не визначені показники, які дозволяють ідентифікувати шарку сливи. Найближчим по суті до запропонованого способу є "Спосіб ідентифікації вірусної строкатості рослин" (патент України № 83679 від 11.08.2008). Спосіб прототип ґрунтується на опроміненні листка рослини після темнової фази світлом в діапазоні довжин хвиль 400650 нм, прийому, вимірювані і реєстрації сигналів флуоресценції в діапазоні довжин хвиль 670770 нм, із значень яких будують індукційну криву, а також тим, що в ньому визначають значення стаціонарної флуоресценції в області судини листка F ТС і а між судинами листка F TM і порівнюють ці значення, а по величині FТС1,5 FTM рослину вважають ураженою вірусною строкатістю. Спільними рисами прототипу і запропонованого способу є опромінені листка рослини після темпової фази світлом з довжиною хвилі 400650 нм, прийому, вимірювані і реєстрації сигналів флуоресценції з довжиною хвилі 670770 нм, із значень яких будують криву індукції флуоресценції хлорофілу. Причиною, що заважає одержанню очікуваного технічного результату є те, що у способі прототипі не визначені ознаки за якими діагностують шарку сливи. Задачею винаходу є вибір таких характерних ознак індукції флуоресценції хлорофілу, способу їх визначення та інтерпретації, які дозволяють діагностувати шарку сливи. Позитивний ефект досягається тим, що запропонований спосіб діагностики шарки сливи, включає опромінення листків дослідної рослини після темпової фази, світлом в діапазоні хвиль 400650 нм, прийом, вимірювання та реєстрацію сигналів наведеної флуоресценції в діапазоні хвиль 670770 нм, із значень яких будують індукційну криву флуоресценції хлорофілу та будують аналогічну криву для контрольної рослини і порівнюють індукційні криві дослідної та контрольної рослин шляхом побудови кривої їх різниці (різницевої, різницевої кривої) і якщо в діапазоні часу від 50 до 150 мс на швидкій фазі спостерігається збільшення значення різниці, то дослідну рослину вважають інфікованою вірусом шарки. Відмінними ознаками запропонованого способу є те, що в ньому будують аналогічну криву для контрольної рослини і порівнюють індукційні криві дослідної та контрольної рослин шляхом побудови кривої їх різниці (рівничної, різницевої кривої) і, якщо в діапазоні часу від 50 до 150 мс на швидкій фазі спостерігається збільшення значення різниці, то дослідну рослину вважають інфікованою вірусом шарки. Введення у відомий спосіб операцій побудови індукційної кривої контрольної рослини, побудова різницевої кривої контрольної і дослідної рослин та виділення мінімального значення різниці, у вибраному інтервалі швидкої фази інтерпретують як ураженість рослини шаркою 1 UA 114239 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 На кресленні зображено загальний вигляд різницевої індукційної кривої (крива різниць індукцій флуоресценції хлорофілу) де значення флуоресценції представлено у відносних одиницях: Відомо, що певні ділянки кривої індукції флуоресценції хлорофілу є індикаторами відповідних фізіологічних процесів у ланцюгу фотосинтезу. Тому порушення окремих ланок фотосинтезу, викликані екзо- та ендогенними чинниками, проявляються у характерних змінах відповідних ділянок індукційної кривої. Таким показником в результаті експериментальних досліджень вибрано різницю відповідних в часі значень флуоресценції контрольної та дослідної рослин. Запропонований спосіб реалізує наступний порядок визначень: за допомогою флуорометра вимірюють та описують індукційні криві для дослідної та контрольної рослин. Для цього листя рослини опромінюють світлом, яке збуджує флуоресценцію хлорофілу. Частіше довжину хвилі опромінення вибирають у діапазоні поглинання хлорофілу 400650 нм, який охоплює головні λ=450 нм, λ=650 нм та проміжні λ=500 нм, λ=550 нм максимуми поглинання нативного хлорофілу. Інтенсивність опромінення актинічним світлом здійснюють у діапазоні 1002000 -2 -1 мкмоль фотонів м с , яка підтримує фотосинтез. Одночасно з освітленням здійснюють прийом, виділення, вимірювання і реєстрацію сигналів флуоресценції з освітленої плями листка в діапазоні довжин хвиль 670770 нм. Цей діапазон охоплює обидва максимуми флуоресценції нативного хлорофілу на λ=680 нм та λ=735 нм. Із поточних значень флуоресценції будують індукційну криву флуоресценції дослідної рослини. Аналогічно будують індукційну криву флуоресценції хлорофілу з поточних значень флуоресценції для контрольної рослини. Далі будують криву різниці дослідної та контрольної росли (фіг. 1) і на ній виділяють інтервал 50-150 мс (точки відліку 17-21). Якщо в цьому інтервалі спостерігається збільшення значення різниці то дослідну рослину вважають інфікованою шаркою. Запропонований спосіб діагностики ураження рослини шаркою, як видно з його опису, може бути реалізований у виробних умовах, так як для його реалізації використовують серійні хронофлуорометри, які дозволяють записувати індукційну криву. При реалізації способу був застосований переносний флуорометр "Флоратест" виробництва Інституту кібернетики НАН України, але можна використати інші прилади, наприклад, портативний хлорофіл-флуорометр РАМ - 2100 німецької фірми Heinz Walz GmbH, або хлорофіл-флуорометр OS-30р фірми OPTISciences, USA. Спосіб реалізовано при тестуванні. Листок контрольної сливи розміщували між пластинами сенсора і витримували без світла 10 хв. Для опромінення листка рослини було використано 2 синіх світлодіоди NSPB500S (Nicbia) з довжиною хвилі випромінювання 460±10 нм. Діоди розміщені попарно на протилежних сторонах каркаса, симетрично відносно фотоприймача і в межах плями освітлення діаметром 5 мм створюють рівномірне освітлення. -2 -1 При інтенсивності освітлення 450 мкмоль м с і більше сигнал індукованої флуоресценції надійно фіксується. Для виділення сигналу флуоресценції нами застосовано червоний світлофільтр ОС-14 з каталогу кольорового скла ГОСТ 9411-81, який забезпечує надійне відсікання випромінення світлодіодів і пропускання сигналів флуоресценції. Як фотоприймач використано монолітний з підсилювачем світлодіод ОРТ301М (Burr Brown), у якого максимум чутливості в діапазоні хвиль 650800 нм. Для вимірювання і реєстрації сигналів використано мікроконтролер ADuC 842 (Analog Devices. Запропонований спосіб дозволяє діагностувати шарку сливи на ранніх стадіях ураження при масових експресних визначеннях. Запропонований спосіб діагностики шарки сливи буде використано при вирощувані саджанців сливи, абрикосу та персика на дослідних ділянках Інституту садівництва УАААН. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 55 Спосіб діагностики шарки сливи, який включає опромінення листків дослідної рослини, після темної фази, світлом в діапазоні хвиль 400650 нм, прийом, вимірювання та реєстрацію сигналів флуоресценції в діапазоні хвиль 670770 нм, із значень яких будують індукційну криву флуоресценції хлорофілу, який відрізняється тим, що додатково опромінюють листки контрольної рослини, будують для неї індукційну криву та порівнюють її з індукційною кривою дослідної рослини шляхом побудови кривої їх різниці і, якщо в діапазоні часу від 50 до 150 мс на швидкій фазі флуоресценції хлорофілу спостерігається збільшення значення різниці показників, то дослідну рослину вважають інфікованою вірусом шарки. 2 UA 114239 C2 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3