Спосіб прогнозування перебігу панкреатиту за поліморфізмом гена il-4 (c-590т)

Реферат: UA 114383 U UA 114383 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до хірургії, і може бути використана для прогнозування перебігу гострого чи загострення хронічного панкреатиту. Гострий панкреатит (ГП) і загострення хронічного панкреатиту (ЗХП) є актуальною проблемою як для хірургів, так і гастроентерологів, оскільки посідає третє місце серед невідкладної абдомінальної патології. Питання прогнозу перебігу ГП чи ЗХП є завжди нагальним щодо вибору адекватної терапії на початковому етапі чи, тим паче, з позиції хірургічного лікування. Попри велике різноманіття діагностичного супроводу, на сьогоднішній день не існує високоспецифічних методів прогнозування тяжкості перебігу панкреатиту, що зумовлено відмінністю етіологічних чинників, недосконалістю чи відсутністю чітких лабораторних критеріїв, внаслідок взаємного впливу різних органів і систем людського організму. Все це, в сукупності, зумовлює недооцінку тяжкості перебігу панкреатиту, що, у свою чергу, і призводить до неадекватної терапії та гірших результатів лікування хворих. Виходячи зі сказаного вище, даний спосіб спрямований на розробку нового специфічного способу прогнозування перебігу ГП і ЗХП та виникнення ускладнень. Найближчим аналогом є спосіб прогнозування перебігу гострого панкреатиту та розвитку його ускладнень (Патент України № 68121 МПК А61В 5/00. опубл. 12.03.2012, Бюл. № 5.), в якому визначають поліморфізм R122H гена синтезу катіонічного трипсиногена (PRSS1), який знаходиться на третьому екзоні 7-ої хромосоми, для цього проводять вивчення алелів поліморфних ділянок третього екзону гена PRSS1 шляхом виділення геномної ДНК з лейкоцитів периферійної крові, стабілізованої ЕДТА як антикоагулянт ("Merk®", Німеччина), із наступною ампліфікацією поліморфної ділянки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) на програмованому ампліфікаторі "Amply-4L" (Росія), з індивідуальною температурною програмою для специфічних праймерів: sense (5'-GGTCCTGGGTCTCATACCTT-3'), antisense (5'1 GGGTAGGAGGCTTCACACTT-3 ). Для дискримінації мутаційного Н122 алеля гена PRSS1 використовують ендонуклеазу рестрикції AflIII згідно з інструкціями ("Fermentas®", Німеччина). Продукти ПЛР аналізують за допомогою електрофорезу в 3 % агарозному гелі в присутності трисборатного буфера, концентрованого з бромідометидію. Фрагменти візуалізують за допомогою УФ-випромінювача в присутності маркера молекулярних мас 100-1000 bр ("СибЭнзим", Росія). У результаті проведення ПЛР можливе визначення наступних варіантів поліморфізму R122H гена PRSS1: R122R-генотип, R122H-генотип і Н122Н-генотип. Враховуючи аутосомнодомінантний тип успадкування мутації R122H гена PRSS1, наявність R122R- генотипу є сприятливим прогностичним критерієм перебігу гострого панкреатиту, а верифікація R122H- і НІ 22Н-генотипів - прогностично несприятливим маркерами. У патогенезі гострого панкреатиту важливе значення має внутрішньоацинарна активація панкреатичних ензимів з розвитком швидкого поширення деструктивного ураження підшлункової залози. А у носіїв патологічного Н-алеля поліморфізму R122H гена PRSS1 спостерігається більш інтенсивна внутрішньоацинарна активація панкреатичних ферментів та швидше поширення деструктивних процесів підшлункової залози. Це дає авторам підстави оцінювати наявність патологічного Н-алеля (тобто R122H і Н122Н-генотипи), як прогностично несприятливого маркера клінічного перебігу гострого панкреатиту, що потребує застосування більш активної лікувальної тактики у цих хворих. Недоліками способу-аналога є: попри те, що внутрішньоацинарна активація панкреатичних ферментів є однією з основних ланок патогенетичного механізму розвитку гострого панкреатиту, проте вона може бути проконтрольована тільки опосередковано, до того ж один і той же, за тяжкістю, клінічний стан може проявитися як гіперферментемією, так і гіпоферментамією зі сторони підшлункової залози, та й активності ферментів притаманна певна залежність від функціонального стану інших органів і систем. Важливим органом, що першочергово реагує на тяжкий перебіг панкреатиту, прояв інтоксикації та викид біологічно активних речовин, є печінка. Тому, здійснюючи контроль функціонального стану печінки можна оцінити тяжкість панкреатичної агресії та ураження підшлункової залози і спрогнозувати ризики подальшого перебігу панкреатиту. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалити спосіб прогнозування перебігу гострого панкреатиту і розвитку його ускладнень шляхом визначення поліморфізму С-590Т гена інтерлейкіну 4 IL-4, використання як показника лабораторного контролю клінічного перебігу панкреатиту рівня активності печінкових ферментів аланінамінотранферази (АлАТ) та аспартатамінотрансферази (АсСТ) і значення коефіцієнта де Рітіса, як одного із додаткових портальних чинників панкреатичної агресії; наявність СС-генотипу є сприятливим прогностичним критерієм перебігу панкреатиту, а верифікація СТ- і ТТ-генотипів є прогностично несприятливими маркерами. 1 UA 114383 U Спільними ознаками аналога і корисної моделі є те, що визначають поліморфізм певного кандидатного гена з використанням полімеразної ланцюгової реакції. Відмінні ознаки корисної моделі від аналога наведені в таблиці. Таблиця Порівняння корисної моделі та прототипу за ознаками Ознака Визначають поліморфізм гена Корисна модель С-590Т гена інтерлейкіни 4 IL-4 Аналог R122H гена синтезу катіонічного трипсиногена PRSS1 Внутрішньоацинарна активація Показник лабораторного активність ферментів АсАТ та ферментів (ферментемія може як контролю клінічного перебігу АлАТ, які корелюють зі змінами зростати, так і зменшуватися за панкреатиту значень коефіцієнта де Рітіса погіршання перебігу панкреатиту) наявність СС-генотипу є наявність патологічного Н-алеля Прогнозування перебігу сприятливим прогностичним (тобто R122H і Н122Н-генотипи) гострого панкреатиту і критерієм, а верифікація СТ- і є прогностично несприятливим розвитку його ускладнень ТТ-генотипів є прогностично маркером несприятливими маркерами 5 10 15 20 25 30 35 40 Визначення термінів, які використовуються при описі корисної моделі: поліморфізм, ген, IL-4 (C-590T), АлАТ, АсАТ, коефіцієнт де Рітіса. Спосіб здійснюють наступним чином. Геномну ДНК виділяють з лейкоцитів периферійної крові за допомогою комерційної тестсистеми "innuPREPBloodDNAMiniKit" (AnalytikJena, Німеччина) та використовують центрифужні фільтри. Поліморфні варіанти гена гена IL-4 (rs 2243250) визначають, керуючись протоколом із олігонуклеотидними праймерами із застосуванням методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та наступним аналізом поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ). Ампліфікацію досліджуваних ділянок гена проводять із використанням специфічних праймерів ("Metabion", Німеччина): TAAACTTGGGAGAACATGGT-forward, TGGGGAAAGATAGAGTAATAreverse); для фрагментів гена IL-4 (C-590T) використовують комерційний набір MasterMixPCR (фірми "NEOGEN", Україна). Продукти ампліфікації фрагментів ДНК гена IL-4 підлягають гідролітичному розщепленню за допомогою ендонуклеаз рестрикції Avail ("Thermo Scientific", США). Стан ампліфікаційних фрагментів IL-4 (C-590T) аналізують в 4 % агарозному гелі фірми "CleaverScientific" (Великобританія), з додаванням бромистого етидію, маркера молекулярної ваги GeneRuler 50 bpDNALadder ("ThermoScientific", США) та візуалізують в трансілюмінаторі за допомогою комп'ютерної програми Vitran. У результаті проведення ПЛР визначають наступні варіанти поліморфізму С-590Т гена IL-4: СС-генотип, СТ-генотип і ТТ-генотип. Наявність СС-генотипу є сприятливим прогностичним критерієм перебігу панкреатиту, а верифікація СТ- і ТТ-генотипів є прогностично несприятливими маркерами. Приклад практичного застосування корисної моделі Спосіб прогнозування перебігу панкреатиту за поліморфізмом гена IL-4 (C-590T) апробований у клінічних умовах. У дослідженні взяли участь хворі на ГП і ЗХП у кількості 101 особа, яким за допомогою полімеразної ланцюгової реакції було проведено генетичний аналіз. За результатами дослідження встановлено, що у хворих на гострий і загострення хронічного панкреатиту за поліморфізму гена IL-4 (C-590T) спостерігається відмінність в активності печінкових ферментів АсАТ та АлАТ і значеннях коефіцієнта де Рітіса залежно від СС, СТ- чи ТТ-генотипу. Так за дикого, сприятливого СС-генотипу середнє значення активності ферменту АсАТ склало 40,65±2,96, тоді, як за СТ-генотипу - 82,45±10,21 (Рсс=0,005), і за ТТ-генотипу 112,80±22.30 (рсс=0,011). Подібні зміни спостерігалися і щодо активності ферменту АлАТ: за сприятливого СС-генотипу середнє значення активності ферменту АлАТ склало 27,38±1,93, за СТ-генотипу - 48,35±5,87 (рсс=0,009) і за ТТ-генотипу - 63,8±13,1З (рсс=0,008). Вказана відмінність узгоджувалася з динамікою зміни значень коефіцієнта де Рітіса залежно від поліморфізму С-590Т гена IL-4. Так, за сприятливого СС-генотипу середнє значення коефіцієнта де Рітіса склало 1,58±0,07, за СТ-генотипу - 1,70±0,10 і за ТТ-генотипу - 1,77±0,08. Тяжчий перебіг за СТ- і ТТ-генотипів гена IL-4 підтверджувався клінічно (частіше виникнення ускладнень, триваліший період лікування) та лабораторно, за вираженою активацією клітинної і 2 UA 114383 U 5 10 15 гуморальної ланок імунітету. А от щодо рівнів ферментів, що відображають стан ураження тканини підшлункової залози, то вони у носіїв СТ- і ТТ-генотипів гена IL-4 не завжди реагували відповідно до сонографічних змін підшлункової залози. Тобто, заявлений спосіб дає вірогідніший прогноз перебігу панкреатиту, у порівнянні з прототипом, оскільки підтверджується рівнем тригліцеридів крові, які більш чутливо і однозначно реагують на зміни зі сторони підшлункової залози і, відповідно, тісно пов'язані з динамікою запального процесу. Порівняльний аналіз аналога і заявленого способу виявив високу прогностичну цінність останнього, що ґрунтується на поліморфізмі гена IL-4 (С-590Т) і підтверджується активністю ферментів аланінамінотрансферази (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсСТ) та значенням коефіцієнта де Рітіса. Технічний результат Запропонований спосіб дозволяє ефективно прогнозувати перебіг панкреатиту за поліморфізмом гена IL-4 (C-590T), виявити серед загальної когорти хворих тих, у кого захворювання матиме тяжчий перебіг і з вищим ризиком розвитку ускладнень; впровадження запропонованого способу забезпечить внесення відповідних змін в комплекс лікувальних заходів і поліпшить результати лікування хворих на гострий і загострення хронічного панкреатиту. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб прогнозування перебігу панкреатиту за поліморфізмом гена IL-4 (С-590Т) шляхом визначення поліморфізму певного кандидатного гена з використанням полімеразної ланцюгової реакції, який відрізняється тим, що визначають поліморфізм С-590Т гена інтерлейкіну 4 IL-4, використовують як показник лабораторного контролю клінічного перебігу панкреатиту рівень активності печінкових ферментів аланінамінотрансферази та аспартатамінотрансферази та значення коефіцієнта де Рітіса; наявність СС-генотипу є сприятливим прогностичним критерієм перебігу панкреатиту, а верифікація СТ- і ТТ-генотипів є прогностично несприятливими маркерами. 30 Комп’ютерна верстка Т. Вахричева Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3