Спосіб прогнозування перебігу панкреатиту за поліморфізмом гена cftr (delf508)

Реферат: UA 114303 U UA 114303 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до хірургії, і може бути використана для прогнозування перебігу гострого чи загострення хронічного панкреатиту. Гострий панкреатит (ГП) і загострення хронічного панкреатиту (ЗХП) є серйозною проблемою для лікарів багатьох спеціальностей, оскільки посідає третє місце серед невідкладної абдомінальної патології. Вивченню цієї патології приділялося і приділяється багато уваги, особливо, враховуючи багатофакторність у виникненні і перебігу цієї патології. Питання прогнозу перебігу ГП чи ЗХП є актуальним для вибору адекватної терапії на початковому етапі чи, тим паче, з позиції хірургічного лікування. На сьогоднішній день не існує високоспецифічних методів прогнозування важкості перебігу панкреатиту, що зумовлено відмінністю етіологічних чинників, недосконалістю чи відсутністю чітких лабораторних критеріїв, внаслідок взаємного впливу різних органів і систем людського організму. Неправильна оцінка важкості перебігу панкреатиту зазвичай пов'язана з неадекватним лікуванням і в наступному призводить до гірших результатів лікування хворих з даною патологією. Виходячи зі сказаного вище, даний спосіб спрямований на розробку нового специфічного способу прогнозування перебігу ГП і ЗХП та виникнення ускладнень. Найближчим аналогом до запропонованої корисної моделі є спосіб прогнозування перебігу гострого панкреатиту та розвитку його ускладнень (Патент України № 68121 МПК А61В 5/00. Спосіб прогнозування перебігу гострого панкреатиту та розвитку його ускладнень / Полянський І.Ю., Максим'юк В.В.; Власник Полянський І.Ю., Максим'юк В.В. - заяв. № u201111832 від 07.10.2011; опубл. 12.03.2012, Бюл. № 5.), в якому визначають поліморфізм R122H гена синтезу катіонічного трипсиногену (PRSS1), який знаходиться на третьому екзоні 7-ої хромосоми, для цього проводять вивчення алелів поліморфних ділянок третього екзону гена PRSS1 шляхом виділення геномної ДНК з лейкоцитів периферійної крові, стабілізованої ЕДТА як антикоагулянт ("Merk®", Німеччина), із наступною ампліфікацією поліморфної ділянки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) на програмованому ампліфікаторі "Amply-4L" (Росія), з індивідуальною температурною програмою для специфічних праймерів: sense (5'GGTCCTGGGTCTCATACCTT-3'), antisense (5'-GGGTAGGAGGC TTCACACTT-3'). Для дискримінації мутаційного НІ22 алеля гена PRSS1 використовують ендонуклеазу рестрикції Аf1III, згідно з інструкціями ("Fermentas®", Німеччина). Продукти ПЛР аналізують за допомогою електрофорезу в 3 % агарозному гелі в присутності трисборатного буфера, концентрованого з бромідометидію. Фрагменти візуалізують за допомогою УФ-випромінювача в присутності маркера молекулярних мас 100-1000 bр ("СибЭнзим", Росія). У результаті проведення ПЛР можливе визначення наступних варіантів поліморфізму R122H гена PRSS1: R122R-генотип, К122Н-генотип і Н122Н-генотип. Враховуючи аутосомнодомінантний тип успадкування мутації R122H гена PRSS1, наявність R122R-генотипу є сприятливим прогностичним критерієм перебігу гострого панкреатиту, а верифікація R122H- і НІ 22Н-генотипів - прогностично несприятливим маркерами. Автори вказують на те, що у патогенезі гострого панкреатиту важливе значення має внутрішньоацинарна активація панкреатичних ензимів з розвитком швидкого поширення деструктивного ураження підшлункової залози. А у носіїв патологічного Н-алеля поліморфізму R122H гена PRSS1 спостерігається більш інтенсивна внутрішньоацинарна активація панкреатичних ферментів та швидше поширення деструктивних процесів підшлункової залози. Це дає авторам підстави оцінювати наявність патологічного Н-алеля (тобто R122H і Н122Нгенотипи), як прогностично несприятливого маркера клінічного перебігу гострого панкреатиту, що потребує застосування більш активної лікувальної тактики у цих хворих. Недоліками найближчого аналога є наступні: попри те, що внутрішньоацинарна активація панкреатичних ферментів є однією з основних ланок патогенетичного механізму розвитку гострого панкреатиту, проте вона може бути проконтрольована тільки опосередковано, до того ж один і той же, за важкістю, клінічний стан може проявитися як гіперферментемією, так і гіпоферментамією, та й активності ферментів притаманна певна залежність від функціонального стану інших органів і систем. У найближчому аналозі не враховується стан ліпідного спектра крові хворих на гострий панкреатит. Так, ліпідна тріада: підвищення рівня ліпопротеїдів дуже низької щільності (ЛПДНЩ) або тригліцеридів (ТГ), атерогенних ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ) та зниження ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ), лежить в основі патогенезу багатьох захворювань і оксидативного стресу в цілому. Відомо, що до 40 % хворих на гострий панкреатит мають гіпертригліцеридемію, особливо хіломікронемію. Зростання тригліцеридів за гострого панкреатиту є показником важчого перебігу, до того ж зростання тригліцеридів може саме по собі спровокувати виникнення гострого панкреатиту. Вважається, що вільні жирні кислоти, які вивільняються з тригліцеридів під впливом ліпази, потрапляючи в мікроциркуляторне русло підшлункової залози, уражають дрібні судини і 1 UA 114303 U 5 10 15 20 зумовлюють ішемічне ураження її паренхіми. Тому, імовірним вважається механізм автолізу тканини підшлункової залози внаслідок активації трипсиногену ацидозом, виникнення якого зумовлене пошкодженням вільними жирними кислотами клітинних мембран. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалити спосіб прогнозування перебігу гострого панкреатиту і розвитку його ускладнень шляхом визначення поліморфізму delF508 гена трансмембранного регуляторного білка муковісцидозу CFTR, використання як показника лабораторного контролю клінічного перебігу панкреатиту рівня тригліцеридів крові хворого; наявність NN-генотипу є сприятливим прогностичним критерієм перебігу панкреатиту, а верифікація NM- і ММ-генотипів є прогностично несприятливими маркерами. Поставлена задача вирішується тим, що у cпособі прогнозування перебігу панкреатиту за поліморфізмом гена CFTR (delF508) шляхом визначення поліморфізму певного кандидатного гена з використанням полімеразної ланцюгової реакції, згідно з корисною моделлю, визначають поліморфізм delF508 гена трансмембранного регуляторного білка муковісцидозу CFTR, використовують як показник лабораторного контролю клінічного перебігу панкреатиту рівень тригліцеридів крові хворого; наявність NN-генотипу є сприятливим прогностичним критерієм перебігу панкреатиту, а верифікація NM- і ММ-генотипів є прогностично несприятливими маркерами. Спільними ознаками найближчого аналога і запропонованої корисної моделі є те, що визначають поліморфізм певного кандидатного гена з використанням полімеразної ланцюгової реакції. Відмінні ознаки корисної моделі від прототипу наведені в наступній таблиці. Таблиця Порівняння корисної моделі та найближчого аналога за ознаками Ознака Корисна модель delF508 гена трансмембранного Визначають регуляторного білка муковісцидозу поліморфізм гена CFTR Показник рівень тригліцеридів крові хворого лабораторного (зміни ліпідного спектру крові контролю клінічного рівнонаправлено корелюють зі змінами перебігу панкреатиту зі сторони підшлункової залози) Прогнозування наявність NN-генотипу є сприятливим перебігу гострого прогностичним критерієм, а панкреатиту і верифікація NM- і ММ-генотипів є розвитку його прогностично несприятливими ускладнень маркерами 25 30 35 40 Найближчий аналог R122H гена синтезу катіонного трипсиногена PRSS1 внутрішньоацинарна активація ферментів (ферментемія може як зростати, так і зменшуватися за погіршання перебігу панкреатиту) наявність патологічного Н-алеля (тобто R122H і Н122Н-генотипи) є прогностично несприятливим маркером Визначення термінів, які використовуються при описі корисної моделі: поліморфізм, ген, CFTR (delF508C), тригліцериди крові. Спосіб здійснюють наступним чином. Геномну ДНК виділяють з лейкоцитів периферійної крові за допомогою комерційної тестсистеми "innuPREPBloodDNAMiniKit" (AnalytikJena, Німеччина) та використовують центрифужні фільтри. Поліморфні варіанти гена CFTR (rs 113993960) визначають, керуючись протоколом із олігонуклеотидними праймерами із використанням методу алель-специфічної ПЛР. Ампліфікацію досліджуваних ділянок гена проводять із застосуванням специфічних праймерів ("Metabion", Німеччина) (GGCACCATTAAAGAAAATATCATCTT forward (wild), GGCACCATTAAAGAAAATATCATTGG forward (mutation), CATTCACAGTAGCTTACCCA-reverse (common)); для фрагментів гена CFTR (delF508) використовують комерційний набір MasterMixPCR (фірми "NEOGEN", Україна). Стан ампліфікаційних фрагментів CFTR (delF508) аналізують в агарозному гелі фірми "CleaverScientific" (Великобританія), з додаванням бромистого етидію, маркера молекулярної ваги GeneRuler 50 bpDNALadder ("ThermoScientific", США) та візуалізують в трансілюмінаторі за допомогою комп'ютерної програми Vitran. У результаті проведення ПЛР визначають наступні варіанти поліморфізму delF508 гена CFTR: NN-генотип, NM-генотип і ММ-генотип. Наявність NN-генотипу є сприятливим прогностичним критерієм перебігу панкреатиту, а верифікація NM- і ММ-генотипів є прогностично несприятливими маркерами. 2 UA 114303 U 5 10 15 20 25 Приклад практичного застосування корисної моделі. Спосіб прогнозування перебігу панкреатиту за поліморфізмом гена CFTR (delF508) апробований у клінічних умовах. У дослідженні взяли участь хворі на гострий і загострення хронічного панкреатиту у кількості 101 особа, яким за допомогою полімеразної ланцюгової реакції було проведено генетичний аналіз. За результатами дослідження встановлено, що у хворих на гострий і загострення хронічного панкреатиту за поліморфізму гена CFTR (delF508C) спостерігається відмінність у рівнях тригліцеридів (ТГ) залежно від NN чи NM-генотипу. Так за дикого, сприятливого NN-генотипу середній рівень ТГ склав 1,54±0,12, тоді, як за NM-генотипу - 2,15±0Д8 (pNN