Спосіб моделювання стимуляції регенерації ушкоджених периферичних нервів

Реферат: Спосіб моделювання стимуляції регенерації ушкоджених периферичних нервів включає введення цитокіну - рекомбінантного LIF людини - в дозі 50 мкг/кг інбредним мишам курсом - 1617 щоденних ін'єкцій, починаючи з 3-ї доби травмування з наступною оцінкою змін структури ушкодженого нерва. UA 114550 U (54) СПОСІБ МОДЕЛЮВАННЯ СТИМУЛЯЦІЇ РЕГЕНЕРАЦІЇ УШКОДЖЕНИХ ПЕРИФЕРИЧНИХ НЕРВІВ UA 114550 U UA 114550 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до експериментальної медицини, зокрема регенеративної терапії, неврології, травматології, і може застосовуватись для стимуляції репаративної регенерації травмованих периферичних нервів. Розробка підходів до стимуляції регенерації ушкоджених периферичних нервів є актуальною проблемою сучасної медицини. На сьогодні, широке застосування нових хірургічних технологій, фармакологічних препаратів, а також клітинної терапії стовбуровими клітинами не завжди є достатньо ефективним щодо відновлення структури і функції травмованих нервів. Відомий спосіб стимуляції регенерації ушкоджених периферичних нервів шляхом трансплантації у ділянку травми стовбурових клітин, які синтезують нейротрофічні та ростові фактори [Е. С. Петрова. Применение стволовых клеток для стимуляции регенерации поврежденного нерва / Е.С.Петрова // Цитология. - 2012. - Т. 54, № 7. - С. 525-540]. Недоліком цього способу є необхідність тривалого культивування стовбурових клітин для їх наступного диференціювання у нейральному та гліальному напрямках, що потребує використання високовартісних реактивів. Відомий спосіб прискорення в експерименті відновлення структури і функції ушкоджених периферичних нервів шляхом введення у скелетні м'язи, що ними іннервуються, векторних конструкцій, які локально підвищують продукцію нейротрофічних факторів (мозковий нейроторофічний фактор-BDNF і фактор стромальних клітин-SDF-l) [Патент 2486918С1 RU, Способ стимулирования восстановления периферической иннервации тканей с помощью векторных конструкций. Опубл. 10.07.2013, Бюл. № 19]. Проте, в даному способі неможливо врахувати концентрації нейротрофічних факторів, які синтезуються у ділянці введення векторних конструкцій, та така технологія є високовартісною. Відомий спосіб відновлення структури травмованого сідничного нерва за допомогою локального одноразового введення у ділянку травми ростового фактора (фактор росту нервів NGF) [С.С. Страфун. Ультраструктурна оцінка відновлення травмованого сідничого нерва при аутопластиці його великих дефектів у щурів в експерименті / С.С. Страфун, В.В. Гайович, С.І. Савосько // Український нейрохірургічний журнал. - 2014. - № 4. - С. 50-54]. Недоліками цього способу є: використання ростового фактора на моделях лише великих дефектів сідничного нерва; одноразове локальне введення фактора (в день операції) може бути недостатнім для підтримки його оптимального рівня в динаміці регенерації ушкодженого нерва. Відомий і спосіб відновлення структури ушкоджених нейронів центральної нервової системи, який полягає у введенні інбредним мишам з експериментальною моделлю демієлінізації та нейродегенерації цитокіну - рекомбінантного лейкемія інгібіторного фактора (LIF) людини, внутрішньоочеревинно, у дозі 50 мкг/кг з 7-ї доби прийому нейротоксину купризону, курс - 14 щоденних ін'єкцій [Патент № 104976U UA, Спосіб моделювання регенерації ушкоджених нейронів головного мозку при нейродегенеративних захворюваннях. Опубл. 25.02.2016, Бюл. № 4]. Проте, такий спосіб внутрішньоочеревинного введення цитокіну - рекомбінантного LIF людини - є специфічним для відновлення ушкоджених нейронів центральної нервової системи і малопридатним для ефективної стимуляції регенерації периферичного нерва. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб моделювання стимуляції регенерації ушкоджених периферичних нервів шляхом підшкірного введення в зону травмування цитокіну - рекомбінантного LIF людини, що виявляє стимулюючий ефект на регенерацію ушкодження, є ефективним, малозатратним та дозволить обґрунтувати підходи як до клітинної терапії таких ушкоджень, так і пошуку медикаментозних препаратів. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає введення цитокіну рекомбінантного LIF людини - в дозі 50 мкг/кг інбредним мишам із експериментальною моделлю ушкодження нервової системи, згідно з корисною моделлю, тваринам зі стандартним ушкодженням периферичного нерва, наприклад сідничного, підшкірно, починаючи з 3-ї доби травмування, у ділянку травми вводять LIF курсом - 16-17 щоденних ін'єкцій з наступною оцінкою змін структури ушкодженого нерва і рухової активності. Корисна модель стала можливою у результаті пошуку авторами підходів до прискорення регенерації ушкоджених периферичних нервів на основі дослідження її механізмів, зокрема встановлення значення факторів мікрооточення (ростові та нейротрофічні фактори) для процесу мієлінізації та росту аксонів. Доведено, що LIF виявляє властивості нейротрофічного фактора, попереджує демієлінізацію, є ростовим фактором для нейральних стовбурових клітин, шванівських клітин і аксонів, зменшує їх апоптоз, підвищує тривалість життя мотонейронів. Спосіб здійснюється наступним чином. Інбредним мишам лінії FVB віком 4-6 міс., які знаходяться у стандартних умовах віварію при фіксованому світловому режимі (12:12), моделюють стандартну травму периферичних нервів, 1 UA 114550 U 5 10 15 20 25 30 наприклад сідничного нерва (перетин у середній його третині). Контроль - псевдооперовані тварини. Частині тварин із травмою нерва підшкірно, у зону ушкодження вводять, починаючи з 3-ї доби після травми, рекомбінантний LIF людини у дозі 50 мкг/кг, курсом 16-17 щоденних ін'єкцій. Через добу після завершення експерименту проби біологічного матеріалу (фрагменти регенераційної невроми з відрізками ушкодженого нерва) досліджують за способом, описаним у "Способі оцінки в експерименті ефективності відновлення рухової функції нижньої кінцівки після ушкодження периферичного нерва" Лабунець І.Ф., Демидчук А.С., Шамало С.М. При звичайній світловій мікроскопії на препаратах гістологічних зрізів оцінюють стан невроми та відрізків сідничного нерва. Для морфометрії результатів світлооптичної мікроскопії гістологічних препаратів використовують комп'ютерну програму "UTHSCSA Image Tool for Windows" (Version 2.00). Препарати фотографують за допомогою цифрової фотокамери і визначають щільність розподілу нервових волокон у дистальному відрізку травмованого нерва. Рухову активність оцінюють із використанням поведінкового тесту "відкритого поля" і дослідження "відбитків підошовних поверхонь стопи". Результати морфологічної оцінки структурних змін сідничного нерва з морфометричним аналізом після введення LIF, а також показники рухової функції травмованої кінцівки порівнюють із результатами, отриманими на тваринах тільки з травмою нерва. Виявляють позитивні зміни структури ушкодженого нерва і підвищення щільності нервових волокон у гістопрепараті дистального відділу нерва, а також показників рухової активності щодо мишей тільки із травмою нерва, що свідчить про стимулюючий вплив рекомбінантного LIF людини на регенерацію ушкодженого нерва. Вплив введення рекомбінантного LIF людини на структуру травмованого сідничного нерва наведено на рисунку (мікрофотографія, імпрегнація азотнокислим сріблом; Ок 10, об. 40). Як видно із рисунка, після введення LIF тваринам із травмою нерва спостерігається поліпшення структурної організації ділянки нейротомії (Б), яка набуває більш сприятливої будови для регенерації нервових волокон, ніж у тварин тільки з травмою нерва (А). Це суттєво впливає на активність і особливості регенерації нервових волокон у дистальному відрізку травмованого нерва: у таких мишей, як і у контрольної групи, нервові волокна у більшості випадків розташовані у продольному напрямку (Г), на відміну від тварин тільки із травмою нерва (В). В таблиці наведені результати змін структурної організації ушкодженого нерва та рухової функції нижньої кінцівки після введення рекомбінантного LIF людини мишам із травмою сідничного нерва (М±m) 35 Показник Щільність нервових 2 волокон/мм Експериментальні групи Псевдооперація Травма нерва Травма нерва + введення LIF (контроль) Морфометрія 11024,0±628,1* 8409,5±739,5 12117,6±589,8* Функціональні тести Кількість перетнутих квадратів Відстань між и пальцями стопи, мм 31,8±2,9* 25,0±1,3 40±3,2* 10,1±0,5* 5,6±0,2 7,0±0,4*# # Примітки: * - р