Препарат для захисту рослин від збудників хвороб “фруктоспорин філд”

1. Препарат для захисту рослин від збудників хвороб, що містить штам бактерії Bacillus subtilis, 3 логічно безпечний, з широким спектром антифунгальної та антибактеріальної дії, діючою речовиною якого є активний штам бактерії Bacillus subtilis ІMB В-7099 з одним із наповнювачів: лактоза - 5 мас.%; молоко в кількості 6 мас.%; сироватка крові великої рогатої худоби - 2...8 мас.%. Для препарату властива комплексна антимікробна дія по відношенню до комплексу збудників хвороб бактеріальної та грибної природи, котрі уражують культурні рослини. Штам цієї бактерії, відібраний в результаті попереднього скринінгу значної колекції мікроорганізмів, зокрема представників роду Bacillus, з тестовою оцінкою на антагоністичну активність відносно фітопатогенних бактерій та грибів, котрі уражують культурні, переважно зернові та зернобобові культури. Штам бактерії - основний інгредієнт препарату Фруктоспорин Філд, характеризується продукуванням комплексу біологічно активних речовин [Рева О.Н. Поиск продуцентов новых полипептидных антибиотиков среди штаммов Bacillus методом генетического типирования // Микробиол. журн. 2005. Т. 67. - №6. - С. 25-27]. Штам Bacillus subtilis депоновано в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером ІМВ В-7100. В процесі експериментального обґрунтування придатності препарату Фруктоспорин Філд для захисту рослин від збудників хвороб, було проведено дослідження, що штам Bacillus subtilis ІMB В7099 - грампозитивні аеробні спороутворюючі палички, які продукують каталазу. На МПА, сусло-агарі, середовищі Громико, картопляному агарі відмічено значний ріст. На МПА утворює складчасті колонії в'язкої консистенції, бежевого кольору, краї неправильної форми. В мазках з колоній, які виросли на МПА через 18 годин можна побачити прямі паличкоподібні клітини 2,3х1,0мкм, які розташовані поодиноко, зрідка ланцюгом. Клітина при спороутворенні не роздувається, після росту на глюкозному агарі в протоплазмі вакуолі не утворюються. При культивуванні штаму Bacillus subtilis ІMB В-7099 на агаризованому картопляному агарі утворюються колонії світло-бежевого кольору, блискучі, в'язкої консистенції, краї рівні. На середовищі Громико - колонії бежевого кольору, складчасті, з підвищеним центром, краї зрізані, консистенція в'язка. На м'ясо-пептонному бульйоні культура утворює плівку. Ферментує глюкозу, арабінозу, манніт, ксилозу з утворенням кислоти, дає позитивну реакцію Фогес-Проскауера, гідролізує крохмаль, желатину, росте на поживному середовищі з вмістом 7% NaCl, утилізує цитрат, не використовує пропіонат. Культура не росте в анаеробних умовах і при 10% NaCl, не утворює газ з NO3 в анаеробних умовах. Приклад 1. Технологічний процес виготовлення дослідних серій препарату Фруктоспорин Філд складається з наступних етапів: Допоміжна робота: - підготовка посуду (миття, стерилізація); - підготовка розчину для технології (0,85% хлориду натрію, наповнювача); - стерилізація посуду і матеріалів; - приготування поживних середовищ (агаризо 13772 4 ване сусло, м'ясо-пептонний агар, середовище Громико, середовище Гаузе) і дезинфікуючих розчинів (перекис водню в суміші з миючими засобами, хлорамін 4% розчин з активатором - 10% розчином нашатирного спирту, 70% етиловий спирт); - стерилізація поживних середовищ; - підготовка приміщень для асептичних робіт. Підготовка штаму бактерії: - розчинення ампули ліофілізованої культури бацили 0,85% NaCl; - посів мікроба на поживне середовище Громико в пробірки зі скошеним агаром; - пересів на середовище Громико в чашки Петрі через 18-22 год; - відбір типових колоній через 18-20 год; - красіння по Граму; - відсів культури на поживне середовище в пробірки зі скошеним агаром на 18-22 год. Приготування маточної суміші мікроба: - змив мікроба з пробірок зі скошеним агаризованим поживним середовищем і визначення концентрації (титру); - розведення змиву мікроба 0,85% NaCl до 13млрд/мл. Отримання біомаси: - засівання мікробіологічних матраців "маточною" сумішшю мікроба; - розміщення матраців в термальну кімнату (Т 37°С на 7 діб для вирощування спор); - контроль на мікробну чистоту; - змивання бактеріальної маси. Приготування препарату: - визначення концентрації (титру) мікроба в 1 мл біомаси; - розчинення біомаси фізіологічним розчином (у разі якщо вміст мікроорганізмів в 1мл перевищує 100млрд. кл. за оптичним стандартом мутності); - додавання наповнювача; - розливання біомаси в лабораторний посуд. Ліофілізація препарату: - заморожування; - ліофільне сушіння; - закупорювання посуду з препаратом. Контроль виготовленого препарату здійснюють за: - зовнішнім виглядом, кольором і запахом; - бактеріальною чистотою, яку проводили методом розсіву розведеного в фізіологічному розчині ліофілізованого препарату на агаризовані живильні середовища: МПА - для росту бацил; Ендо - для росту бактерій кишкової групи; середовище Сабуро - для росту грибів; середовище з сечовиною - для росту бактерій роду Proteus; жовтково-сольовий агар Чистовича - для росту стафілококів. Як показали результати бактеріологічних посівів, приготовані дослідні серії біопрепарату відповідали вимогам та не були забруднені сторонньою мікрофлорою; - безпечністю для теплокровних; - специфічною активністю. Технологічний процес виробництва завершується фасуванням препарату. На основі штаму Bacillus subtilis ІМВ B-7099 з типовими морфологічними, культуральними, біо 5 хімічними властивостями приготували п'ять варіантів препарату Фруктоспорин Філд з різним вмістом мікробних клітин та наповнювача у складі препарату. Варіант 1. Препарат Фруктоспорин Філд, який містить, мас %: Біомаса Bacillus subtilis ІMB B-7099 з титром 5,0х109 КУО/мл - 95%; Наповнювач (лактоза) - 5%. Варіант 2. Препарат Фруктоспорин Філд, який містить, мас %: Біомаса Bacillus subtilis ІMB B-7099 з титром 1,0х109 КУО/мл - 94%; Наповнювач (молоко) - 6%. Варіант 3. Препарат Фруктоспорин Філд, який містить, мас %: Біомаса Bacillus subtilis ІMB B-7099 з титром 0,5х108 КУО/мл - 92%; Наповнювач (сироватка крові ВРХ) - 8%. Варіант 4. Препарат Фруктоспорин Філд, який містить, мас %: Біомаса Bacillus subtilis ІMB B-7099 з титром 1,0х109 КУО/мл - 97%; Наповнювач (сироватка крові ВРХ) 3%. Варіант 5. Препарат Фруктоспорин Філд, який містить, мас %: Біомаса Bacillus subtilis ІМВ B-7099 з титром 5,0х1010 КУО/мл - 98%; Наповнювач (сироватка крові ВРХ) - 2%. Приклад 2. Експериментально в лабораторних умовах визначали позитивний результат впливу препарату Фруктоспорин Філд щодо тест-культур збудників хвороб сільськогосподарських культур. Дослідження проводили методом відстроченого антагонізму за методом Єгорова [Егоров B.C. Основы учения об антибиотиках. - М.: Высш. шк., 1986. - 448 с.]. Для цього вміст однієї ампули розчиняли в 1мл фізіологічного розчину. Отриману суміш висівали петлею в центр чашки Петрі з агаризованим середовищем Гаузе №2 (для вивчення активності щодо бактеріальних тест-культур) і на картопляний агар (для дослідження антагоністичної активності щодо тест-культур грибів). Посіви інкубували в термостаті при 28°С протягом 72 год. До культури, яка виросла, підсівали штрихом тестмікроорганізми (500 млн. суспензії добових культур бактерій і суспензії грибних спор в фізіологічному розчині). Чашки з тест-культурами бактерій інкубували в термостаті при 37°С протягом 18 год., з грибними тест-культурами при 28°С протягом 5 діб. Облік результатів проводили за величиною зон затримки росту тест-культур. Контролем росту тест-культур слугувало паралельне вирощування їх на чашках з агаризованим середовищем Гаузе №2 і картопляним без культури-антагоніста. Отримані результати досліджень представлені в табл. 1, 2, 3. Як показали досліди, оптимальна кількість мікробних клітин Bacillus subtilis ІMB В-7099 в 1мл фізіологічного розчину складає 1х109-1х1010 КУО/мл (об'ємний вміст 92-98%). Застосування кількості мікробних клітин Bacillus subtilis ІМВ В7099 в 1мл фізіологічного розчину 1х107-1х108 КУО/мл (об’ємний вміст 92-98%) значно знижувало ефективність дії проти основних фітопатогенних 13772 6 організмів в польових дослідах, а кількість мікробних клітин Bacillus subtilis ІMB В-7099 в 1мл фізіологічного розчину 1х1011-1х1012 КУО/мл (об'ємний вміст 92-98%), суттєво не підвищували ефективність дії робочої рідини. Таким чином, отримані результати свідчать про те, штам Bacillus subtilis ІМВ В-7099 характеризується специфічною антагоністичною активністю щодо культур фітопатогенних мікроорганізмів, збудників хвороб сільськогосподарських рослин, зокрема до фітопатогенних грибів p.Alternaria, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Colletotrichum та бактерій: Erwinia, Pseudomonas, Xantomonas. Приклад 3. Для встановлення ефективності застосування препарату Фруктоспорин Філд в польових умовах дослідження проводили на дослідному полі Інституту садівництва УААН в 20032005 pp. Сорти суниці Зенга-Зенгана та Коралова 100. Повторність досліду 4-х кратна. Обприскували рослини суниці до цвітіння та фазу дозрівання плодів суспензією препарату Фруктоспорин Філд з титром 5 млрд.кл/мл з нормою витрати робочої рідини 500-600л/га. Результати представлено в табл. 1. Отримані результати порівнювали з прототипом - фунгіцидом Еупарен М, 50% з.п. Обприскували рослини препаратом з нормою витрати 2,0кг/га. Приклад 4. Експериментально обґрунтовували дієвість та позитивний вплив препарату Фруктоспорин Філд на розвиток сірої гнилі винограду в умовах Агрофірми "Білозерський", Білозерського району, Херсонської області. Сорт Молдова. Для отримання статистично вірогідних показників, дослід проводили в 4-х кратній повторності. Результати експертної оцінки засобу наведено у таблиці 2. Встановлено, що біологічний препарат Фруктоспорин Філд застосовується шляхом обприскування рослин (1х109 клітин та спор у 1мл води). Очевидні його переваги перед існуючими препаратами, зокрема прототипом. За тестовими показниками запропонований препарат Фруктоспорин Філд перевищував прототип. Відзначається він і технологічністю виконання та екологічністю усіх операцій, що вигідно виділяє його від відомих препаратів Приклад 5. Експериментально в лабораторних умовах визначали токсикологічні характеристики (вірулентність, токсичність, токсигенність) препарату Фруктоспорин Філд відносно теплокровних тварин (миші). В результаті досліджень встановлено, що препарат не вірулентний, не токсичний, не токсигенний для тварин та не виявляє негативної дії на корисні організми біоценозу. Приклад 6. Обґрунтування дієвості препарату Фруктоспорин Філд та величини отриманого позитивного результату внаслідок його використання для захисту посівів гречки від сірої гнилі. Дослідження проводились на двох сортах: Крупинка та Українка, у польовому експерименті впродовж 2003-2004 років. У загальному масиві посівів формувались варіанти дослідів площею не менше 0,5га у трьохкратній повторності. Проведено одне обприскування рослин препаратом в період початку прояву збудника сірої гнилі, з розрахунку 1х109 7 13772 клітин та спор основного інгредієнту препарату штаму Bacillus subtilis ІМВ B-7099 у 1мл води. Вміст наповнювача лактози в кількості 5 мас.%. Погодні умови сприяли появі збудника сірої гнилі. Результати дослідів наведені в таблиці показують, що на рівні статистичної вірогідності запропонований препарат Фруктоспорин Філд перевищує результат прототипу (табл. 4). Приклад 7. Посіви насіннєвого люпину, сорт Кастричник. Умови досліджень аналогічні тим, що 8 описані у прикладі 6. Встановлено виражений показник позитивного результату внаслідок використання препарату Фруктоспорин Філд у порівнянні з прототипом. Таким чином, препарат Фруктоспорин Філд, у запропонованому способі, суттєво переважає за величиною позитивного результату по відношенню до збудника сірої гнилі на багатьох сільськогосподарських культурах. Таблиця 1 Експертна оцінка антагоністичної активності препарату Фруктоспорин Філд для захисту суниці від сірої гнилі (Дослідне поле Інституту садівництва УААН, 2004-2005 pp.) Способи, що оцінюються Середнє за 2 роки Біологічна ефективність, % 2,4 4,7 75,8 11,9 7,8 5,4 4,0 15,7 30,1 2,6 3,5 Сорт Коралова 100 9,9 4,7 22,9 2,4 49,2 76,0 Уражено ягід, 2004 р.,% Уражено ягід, 2005 p.,% Сорт Зенга-Зенгана Фруктоспорин Філд (спосіб, що пропонується) Спосіб - прототип Еупарен, 50% з.п., 2кг/га Контроль НІР05 Фруктоспорин Філд (спосіб, що пропонується) Спосіб - прототип Еупарен, 50% з.п., 2кг/га Контроль НІР05 7,0 3,7 3,6 3,7 82,3 2.9 3,3 25,2 2,4 4,8 3,4 17,2 1,6 3,9 3,3 21,2 2,6 80,3 84,5 Таблиця 2 Експертна оцінка величин позитивного результату внаслідок використання препарату Фруктоспорин Філд для захисту винограду від сірої гнилі (Агрофірма "Білозерський", Білозерський р-н., Херсонської обл., 2004-2005 pp.) Способи, що оцінюються Фруктоспорин Філд (спосіб, що пропонується) Спосіб-прототип Еупарен, 50% з.п., 2кг/га Контроль НІР05 Уражено сірою гниллю, % 9,2 19,2 18,8 68,7 Розвиток хворо- Біологічна активби, % ність, % 8,2 80,6 16,3 62,7 53,2 74,4 2,6 Таблиця 3 Експертна оцінка величин позитивного результату внаслідок використання препарату Фруктоспорин Філд для захисту гречки від сірої гнилі та супутніх збудників хвороб Способи, що оцінюються Фруктоспорин Філд (спосіб, що пропонується) Спосіб-прототип Контроль НІР05 Сорт "Крупинка" ураження хворозвиток робами, % хвороб, % урожай, ц/га Сорт "Українка" ураження хворозвиток робами, % хвороб, % урожай, ц/га 4,7 3,9 24,1 4,1 2,8 25,2 8,9 28,6 7,2 22,9 21,6 17,1 2,4 12,8 30,5 11,2 28,2 23,4 18,2 1,9 9 13772 10 Таблиця 4 Експертна оцінка величин позитивного результату внаслідок використання препарату Фруктоспорин Філд для захисту люпину жовтого від сірої гнилі та супутніх збудників хвороб Способи, що оцінюються Фруктоспорин Філд (спосіб, що пропонується) Спосіб-прототип Контроль НІР05 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Ураження хворобами при зберіганні врожаю, % Ураження Розвиток хвороби Урожай, ц/га 7,3 4,9 11,6 1,2 6,4 9,7 28,5 12,2 8,9 1,2 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601