Спосіб біохімічної ідентифікації збудників карантинних хвороб рослин: бурої бактеріальної гнилі картоплі ralstonia solanacearum (smith), бактеріального опіку плодових erwinia amylovora (burrill) winslow el., фомопсису соняшнику phomopsis helianthi cvet. et al.

Спосіб біохімічної ідентифікації збудників карантинних хвороб рослин бурої бактеріальної гнилі картоплі Ralstoma solanacearum (Smith), бактеріального опіку плодових Erwima amylovora (Burnll) Wmslow et al , фомопсису соняшнику Phomopsis hehanthi Cvet et al , що включає виділення білків з фітопатогенних бактерій, їх аналіз, який відрізняється тим, що ідентифікацію проводять через 3 доби біохімічним методом ізоелектрофокусування білків збудників хвороб у поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10, ідентифікацію карантинних фітопатогенних бактерій проводять за отриманими білковими спектрами, які є специфічними для кожної хвороби Винахід відноситься до галузі сільського господарства, зокрема до виявлення структурних елементів мікроорганізмів, а також для їх ідентифікації Відомий спосіб ідентифікації збудників бурої бактеріальної гнилі картоплі і бактеріального опіку плодових за вивченням морфологічних і культуральних властивостей ІЗОЛЯТІВ [1, 2] з визначенням патогенності на тест-чутливих рослинах (Прототип) Також ВІДОМІ способи ідентифікації патогенів за допомогою імуно-флуоресцентного забарвлення колоній (IFCS), фермент-залежного імуносорбційного аналізу (ELISA-тест), полімеразної ланцюгової реакції (PCR), за серологічними властивостями (реакція аглютинації, кільцепреципітацм, дифузної преципітації в агарі), методом імуноферментного аналізу [3] Згадані способи мають такі недоліки 1 Вони є трудомісткими Дослідження морфокультуральних властивостей бактерій передбачає приготування складних багатокомпонентних поживних середовищ, що вимагає значних трудових затрат та виграти матеріальних ресурсів Використання пов'язане з затратою часу на виділення ІЗОЛЯТІВ, відбір патогенних штамів і проведення низки аналізів для їх ідентифікації 2 БІЛЬШІСТЬ реакцій, що застосовуються, є довготривалими - від 7 до 21-28 діб Крім того, виро щування тест-чутливих рослин для визначення патогенності також вимагає тривалого часу (1 місяць при використанні тютюну) Застосування методу Уайта для визначення збудника бактеріального опіку плодових можливе тільки в обмежений період часу, оскільки для цього необхідні СВІЖІ недостиглі груші 3 Для їх проведення необхідне високо специфічне обладнання і реактиви 4 Для ідентифікації даних карантинних об'єктів необхідне проведення додаткових досліджень, щоб виключити присутність в досліджуваних зразках бактерій інших родів, що викликають хвороби із схожими ознаками В основу винаходу поставлено завдання розробити спосіб біохімічної ідентифікації збудників бурої бактеріальної гнилі картоплі Ralstoma solanacearum, бактеріального опіку плодових Erwima amylovora і фомопсису соняшнику Phomopsis hehanthi, які можуть бути використані карантинною службою для виявлення та ідентифікації патогенів у вогнищах хвороб Поставлене завдання досягається тим, що у запропонованому способі ідентифікацію збудників хвороб проводять лабораторним способом шляхом виділення карантинних фітопатогенів, їх аналіз проводять через 3 доби, виділяючи білки з фітопатогенних бактерій, аналізують методом ізоелектрофокусування білків збудників хвороб у о (О 62091 поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10 Таким чином, збудники карантинних фітопатогенних організмів ідентифікуються за їх білковими спектрами Результати, що досягаються внаслідок цього, є більш точним, ніж при проведенні інших способів та способів-прототипу 1 Запропонований спосіб дозволяє визначити збудників бурої бактеріальної гнилі картоплі, бактеріального опіку плодових та фомопсису соняшнику за значно коротший термін часу (3 доби) 2 Для його проведення застосовуються сполуки, які не є коштовними 3 Даний спосіб не вимагає високо специфічного обладнання 4 Суттєвою ВІДМІННІСТЮ нового способу є те, що ізоелектрофокусуванням білків збудників хвороб вдається точніше і швидше визначити видову приналежність виділених ІЗОЛЯТІВ Отже, спосіб, що заявляється, відповідає критерію винаходу "новизна" та "суттєві ВІДМІНИ" Приклади здійснення способу Приклад 1 Серед виділених ізолятів-збудників бактеріальних хвороб картоплі виявляли такі, що за морфологічними ознаками (ріст на селективних середовищах (наприклад, середовище Кельмана), колонії гладкі, СВІТЛІ, опалесцентні, маслянистої консистенції, які з часом набувають коричневого забарвлення) відповідали збуднику бурої бактеріальної гнилі картоплі - Ralstoma solanacearum [1, 2] (фиг 1, додаток 1, де зображена бульба картоплі, уражена бурою бактеріальною гниллю Ralstoma solanacearum (Smith) Приклад 2 Для лабораторного дослідження збудника бактеріального опіку плодових Erwima amylovora відбирають зразки рослинного матеріалу з явними проявами хвороби, з яких за загальноприйнятою методикою виділяють бактеріальні культури З виділеними ізолятами проводять такі досліди - вивчення морфології колоній на картопляному агарі та спеціальних поживних середовищах (середовище Кінга В, середовище Кадо і Гаскет, середовище Кросса і Гудмана) [3], - визначення патогенності бактерій на тестрослинах (реакція надчутливості на листках тютюну, тест Уайта на недостиглих плодах груші) [2], - мікроскопічне дослідження препаратів бактерій, фарбованих за Грамом та з фарбуванням джгутиків [1, 4], - дослідження обміну речовин та продуктів ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ бактерій (реакція ФогесПроскауера, визначення сірководню, аміаку та індолу, вивчення сахаролітичних та редукуючих властивостей бактерій та ш ) Висновок про видову приналежність бактерій робиться на основі узагальнення одержаних даних та порівняння з властивостями типових штамів (фіг 2, додаток 2), де зображено ріст збудника бактеріального опіку плодових Ervima amylovora (Burnll) Wmslowet al в ряду 1 Приклад З Виділення збудника фомопсису соняшнику Phomopsis hehanthi проводять за допомогою тонких зрізів некротизованої тканини в місцях найбільшого скупчення ПІКНІД [5, 6] Зрізи готують брит вою чи скальпелем і препарувальною голкою переносять на предметне скельце у краплю дистильованої води, тонкою піпеткою вводять краплю барвника і накривають покривним скельцем Дозрілі ПІКНІДИ теж можна легко ВІДДІЛИТИ ВІД рослинної тканини і, аналогічним чином перенести на предметне скельце, для того, щоб спори вийшли з ПІКНІД, потрібно декілька разів злегка натиснути препарувальною голкою на покривне скельце, спостерігаючи емісію стилоспор у вигляді шлейфу (фіг 3, додаток 3, ряд 1) Для кращого візуального виявлення пікноспор гриба застосовували метод прижиттєвого забарвлення патогена з використанням 2,5н розчину йоду в кали йодистому, (фіг 3, додаток 3, ряд 2) одного з класичних барвників, що використовуються в ГІСТОЛОГІЧНІЙ практиці для різноманітних тестів Він забарвлює амілоїд, целюлозу, хітин, крохмаль, каротин, сахариди, глікоген, його використовують як окислюючий агент та усунення артефактів, що виникають при фіксації тканин деякими солями, тощо Йод забарвлює пікноспори в інтенсивний коричневий колір впродовж 5-і 0 секунд, надлишок рідини з-під покривного скельця видаляють смужкою фільтрувального паперу, препарат проглядають під мікроскопом фіг 3, додаток 3, де зображено збудника фомопсису соняшнику Phomopsis hehanti Cvet et al незабарвленого - ряд 1 і забарвленого 2,5н розчином калію йодистого - ряд 2) Приклад 4 Для біохімічної ідентифікації даних карантинних об'єктів з зразків виділяли білки шляхом розтирання на холоді у фарфоровій ступці, центрифугували протягом 10 хвилин при 8000об/хв [7, 8] При цьому білки виділяються в супернатант, а суміші випадають в осад, який видаляють Супернатант використовували для ізоелектрофокусування білків у поліакриламідному гелі (Т - 5%, С - 3%) з амфолітом діапазону рН 3,5-10 [7] БІЛКОВІ спектри виявляли за допомогою барвника Кумассі блю G 250 Для цього спочатку відмивали амфоліти сумішшю трихлороцтова кислота етанол вода (10 25 65) і забарвлювали 0,05% Кумассі блю G 250 в суміші трихлороцтова кислота етанол вода (10 25 65) Відмивку від надлишку барвника проводили цією ж сумішшю БІЛКОВІ компоненти розраховували за допомогою комп'ютерної програми, розробленої Російським Інститутом фітопатологи і вдосконаленої на УкрНДСКР В результаті проведених досліджень білковий спектр збудника бурої бактеріальної гнилі картоплі - Ralstoma solanacearum (Smith) складається з 28 білкових компонентів (фіг 4, додаток 4) Білковий спектр кільцевої гнилі картоплі (збудник Clavibacter michiganensis subsp sepedomcus) складається з 37 білкових компонентів (фіг 5, додаток 5) У випадку збудника бурої бактеріальної гнилі картоплі спостерігається збільшення КІЛЬКОСТІ білкових компонентів у інтервалі рН 4-6 в порівнянні з кільцевою гниллю картоплі У кислих білків (рН 3,5-6,0) величина екстинкції досягає 0,85-1,0 у збудника бурої гнилі, у збудника кільцевої гнилі - 0,35-1,0 Для збудника бурої бактеріальної гнилі картоплі характерні лужні білкові компоненти з інтервалом рН 8,8-9,7, які відсутні в білковому спектрі збудни 62091 ка кільцевої гнилі Для збудника кільцевої гнилі картоплі характерні нейтральні білкові компоненти, розташовані в інтервалі рН 6,4-6,7, які відсутні у Ralstonia solanacearum Тобто, ці компоненти є маркерами для даних хвороб картоплі Білковий спектр збудника бактеріального опіку плодових Erwima amylovora представлений 37 компонентами, (фіг 6, додаток 6) Величина екстинкції досягає 0,655 КІЛЬКІСТЬ КИСЛИХ білкових компонентів складає 11 Для кислих білків (рН 3,5-6) величина екстинкції досягає Е=0,655, КІЛЬКІСТЬ білка складає 4,8144% Для нейтральних білків (рН 67,5) КІЛЬКІСТЬ компонентів досягає 10 Величина екстинкції досягає 0,59, КІЛЬКІСТЬ білка - 4,8442% Для лужних білків (рН 7,5-10) КІЛЬКІСТЬ компонентів - 16, величина екстинкції Е=0,573, КІЛЬКІСТЬ білка 9,125% Білковий спектр збудника фомопсису соняшнику Phomopsis hehanthi представлений 39 компонентами (фіг 7, додаток 7) Екстинкція досягає Е=0,900 КІЛЬКІСТЬ КИСЛИХ білкових компонентів (рН 3,5-6) складає 14 Величина екстинкції для кислих білків (рН 3,5-6) 0,900 КІЛЬКІСТЬ білка складає 9,3538% Нейтральні білки представлені 14 білковими фракціями Для них характерна величина екстинкції Е=0,450 і КІЛЬКІСТЬ білка - 4,23% Лужні білки (рН 7,5-10) представлені 15 компонентами, максимальне значения екстинкції досягає Е=0,320, КІЛЬКІСТЬ білка складає 2,4328% Таким чином, для кожного збудника карантинних хвороб даним методом був отриманий свій специфічний білковий спектр Запропонований біохімічний спосіб ідентифікації збудників карантинних хвороб рослин бурої бактеріальної гнилі картоплі Ralstonia solanacearum (Smith), бактеріального опіку плодових Erwima amylovora (Burnll) Wmslow et al, фомопсису соняшнику Phomopsis hehanthi підтверджує експериментальна перевірка, яка здійснювалась при ізоелектрофокусуванні білків зразків даних хвороб сільськогосподарських рослин Літературні джерела 1 Руководство для изучения бактериальных болезней растений / под ред Израильского В П — М Колос, 1968 — С 252-310 2 Кирай 3 , Клемент 3 , Шоймоши Ф , Верещ Й Методы фитопатологии — М Колос, 1974 — С 97-111 3 Виявлення, діагностика та локалізація бактеріального опіку плодових Erwima amylovora Тимчасові методичні вказівки / Садляк A M та ш — К, 2000 — 1 1 с 4 Бельтюкова К И , Матышевская М С , Куликовская М Д , Сидоренко С С Методы исследования возбудителей бактериальных болезней раст е н и й — К Наукова думка, 1968 — С 164-172 5 Якуткин В И , Якуткина Т А , Симон А Н Идентификация возбудителя фомопсиса подсолнечника и методы его учета (методические реком е н д а ц и и ) — Санкт-Петербург, 1991 — 1 9 с 6 Деревенко О С , Андрійчук Т О Виявлення збудника фомопсису в агроценозах та вантажах — Чернівці, 2000 — 1 2 с 7 Ригетти Т Изоэлектрическое фокусирование Теория, методы, применение — М Мир, 1986 — 3 6 0 с 8 Троицкий И Г Изоэлектрическое фокусирование белков в самоорганизующихся и искусственных рН градиентах — К Наукова думка, 1984 — 280 с 62091 62091 Комп'ютерна верстка А Крулевський 10 Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119