Спосіб діагностики стеатозу печінки у хворих на хронічний гепатит с

Спосіб діагностики стеатозу печінки у хворих на хронічний гепатит С, що включає оцінку інтенсивності метаболічних зсувів в сироватці крові шляхом лабораторного дослідження сироватки крові, який відрізняється тим, що визначають показники ліпідного обміну та перекисіндукованої хемілюмінесценції сироватки крові за формулами: S1=7,90*А+5,77*В+0,86*С-29,82 S2=10,03*А+3,66*В+0,52*С-29,36, де: А - вміст холестерину сироватки крові, мкмоль/л; В - вміст тригліцеридів сироватки крові, мкмоль/л; С - інтенсивність перекисіндукованої ХЛ сироватки крові, ум.од., причому при перевищенні показника S1 над S2 у хворого на ХГС констатують наявність стеатозу печінки. (19) (21) u200801108 (22) 30.01.2008 (24) 26.05.2008 (46) 26.05.2008, Бюл.№ 10, 2008 р. (72) ПІНСЬКИЙ ЛЕОНІД ЛЕОНІДОВИЧ, UA, ГРОМАШЕВСЬКА ЛЮБОВ ЛЕОНТІЇВНА, U A, ФРОЛОВ ВАЛЕРІЙ МИТРОФАНОВИЧ, U A, ЗІНЧЕНКО ОЛЬГА ВОЛОДИ МИРІВН А, U A, ЖУК СЕРГІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, UA, БОГОМОЛОВА ТАМАРА МИКОЛАЇВНА, U A, МУРАТОВА ЛЮДМИЛА КАС'ЯНІВНА, UA (73) ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA, ДЕРЖАВН А УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ ІМ. Л.В. ГРОМАШЕВСЬКОГО АМН УКРАЇНИ", UA 3 32752 В аналозі [Boyles Т.Н., Johnson S., Garrahan N. et al., A validated method for quantifying macrovesicular hepatic steatosis in chronic hepatitis С // Anal. Quant. Cytol. Histol. - 2007.- Aug;29(4). - P.244 – 250] був запропонований комп’ютерний морфометричний метод верифікації СП. Крім ручного підрахунку жирових везикул в біоптаті авторами був розроблений комп’ютерний алгоритм верифікації площі, кількості жирових крапель в тканині печінки хворих на ХГС. Проте запропонований метод потребує проведення пункційної біопсії у хворих на ХГС, яка дає в окремих випадках ускладнення цієї процедури, визначаються зміни лише в невеликій частині печінки, та запропонований метод не аналізує зміни в різних ланках печінкових часточок. В роботі [Fujie Н., Yotsuyanagi Н., Моrіуа К. et al., Steatosis and intrahepatic hepatitis С virus in chronic hepatitis // J. Med. Virol. - 1999. -Oct; 59(2). P.141 – 145] встановлена залежність відкладень жирових крапель в печінкових часто точках у хворих на ХГС від наявності в тканині печінки HCV позитивного капсидного білка. Проте при верифікації стеатозу в тканині печінки додаткове дослідження HCV позитивного капсидного белка має високу специфічність, але малу чутливість, тому що, крім вірусного фактору у виникненні стеатозу мають суттєве значення метаболічні зміни у хвори х на ХГС, зокрема порушення ліпідного обміну [Zejc-Bajsarowicz М., Ciesla A., Mach Т. et al. Changes of lipid metabolism in patients with chronic viral hepatitis treated with interferon alfa // Przegl. Lek. -2005.- 62(4). - P.214 – 217]. В аналозі [Hepburn M.J., Vos J.A., Fillman E.P. et al. The accuracy of the report of hepatic steatosis on ultrasonography in patients infected with hepatitis С in a clinical setting: a retrospective observational study // BMC Gastroenterol. -2005.- Apr 13; 5(1). P.14] при аналізі результатів ультразвукового дослідження (УЗД) 164 пацієнтів із ХГС було запропоновано використання УЗД для визначення морфологічних змін в тканині печінки. Проте при використанні запропонованого аналога має місце низька специфічність щодо визначення СП, в більшості випадків встановлені УЗД зміни відповідають зростанню гістологічної активності та фіброзу печінки. За даними [Younossi Z.M., McCullough A.J., Ong J.P. et al. Obesity and non-alcoholic fatty liver disease in chronic hepatitis С // J. Clin. Gastroenterol. -2004.- Sep; 38(8). - P.705 – 709] ожиріння є надійним предиктором, який супроводжує СП у хворих на ХГС. Проте цей метод має велику специфічність лише щодо визначення СП у хворих на ХГС із великим індексом маси тіла, але низьку чутливість в групі пацієнтів із нормальною або зниженою масою тіла, та при наявності у хворих на ХГС третього генотипу вір усу HCV. Одним з варіантів оцінки СП у хворих на ХГС було визначення рівня сироваткового адіпонектину [Petit J.M., Minello A., Jooste V. Decreased plasma adiponectin concentrations are closely related to steatosis in hepatitis С virus-infected patients // J. Clin. Endocrino.l Metab. - 2005 Apr; 90(4).- P.2240-2243]. 4 За твердженням авторів зниження цього показника супроводжується збільшенням відкладень жирових краплин в тканині печінки. Проте запропонований спосіб трудомісткий, потребує висококоштовних реагентів, та суттєвим недоліком цього методу є залежність показника сироваткового адипонектину від індексу маси тіла пацієнтів. За даними аналога [Ellidokuz E., Comlekci A., Ellidokuz Н. et al. The role of serum leptin levels in chronic hepatitis С with steatosis // Hepatogastroenterology. - 2003.- Dec; 50 Suppl 2.- P.1419 – 1422] при обстеженні 31 пацієнта хворого на ХГС дігностичним маркером щодо наявності СП при ХГС є вміст лептину в сироватці крові. Проте визначення цього показника в крові хворих на ХГС потребує висококоштовного лабораторного обладнання, коштовних реактивів, а зростання концентрації лептину при ХГС не є специфічним для СП, а супроводжує також метаболічний синдром в цій групі пацієнтів. Крім того в інших дослідженнях [Giannini Е., Серра P., Botta F. et al. Leptin has no role in determining severity of steatosis and fibrosis in patients with chronic hepatitis С // Am. J. Gastroenterol. - 2000. - Nov; 95(l 1). P.3211-3217] встановлено, що сироватковий рівень лептину немає кореляційних зв'язків із СП у хворих на ХГС. За даними аналога [Gordon F.D., Pomfret E.A., Pomposelli J.J. et al. Severe steatosis as the initial histologic manifestation of recurrent hepatitis С genotype 3 // Hum. Pathol. - 2004.- May; 35(5).- P. 636 – 638] наявність СП у хворих на ХГС можна веріфіковувати за наявності генотипу 3 вір усу HCV. Проте генотипування вірусу HCV довготривалий, висококоштовний метод, а відсутність 3 генотипу вір усу не виключає наявності СП при ХГС, зокрема у хворих на ХГС із порушеннями ліпідного обміну. В способі-найближчого аналога [Liu C.J., Jeng Y.M., Chen P.J. et al. Influence of metabolic syndrome, viral genotype and antiviral therapy on superimposed fatty liver disease in chronic hepatitis С // Anti vir. Ther. - 2005.- 10 (3).- P.405-415] встановлена залежність відкладень жирових крапель в тканині печінки від рівню гіпертригліцеридемії. Цей метод за сутністю найбільш схожий із запропонованим, тому обраний в якості найближчого аналога. Основним недоліком найближчого аналога є те, що використання лише вмісту тригліцеридів в сироватці крові для визначення СП, має низьку специфічність, що призведе то хибнопозитивних результатів обстеження у хвори х на ХГС, що може стати причиною невиправденого призначення лікування СП при його відсутності. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі покладено задачу підвищення точності лабораторної діагностики наявності СП у хворих на ХГС шляхом встановлення зв'язку між наявністю відкладень жирових крапель в тканині печінки та сироватковими показниками ліпідного обміну і перекисіндукованої хемілюмінесценції сироватки крові, що дозволить суттєво скоротити численність 5 32752 пацієнтів, які потребують проведення пункційної біопсії печінки. Поставлена задача вирішується в способі діагностики СП у хворих на ХГС за допомогою додаткового включення до лабораторного обстеження хворих на ХГС таких методів, як визначення концентрації холестерину, тригліцеридів та інтенсивності перекисіндукованої хемілюмінесценції сироватки крові з подальшим математичним обчисленням запропонованих рівнянь: S1=7,90*А+5,77*В+0,86*С-29,82 S2=10,03*А+3,66*В+0,52*С-29,36 де: А - вміст холестерину (мкмоль/л); В - вміст тригліцеридів (мкмоль/л); С - інтенсивність перкисіндукованої ХЛ сироватки крові (ум.од.), причому при перевищенні показника S1 над S2 у хворого на ХГС констатують наявність СП. Підставою для цієї пропозиції була вперше встановлена закономірність, яка полягає в тому, що при наявності СП на відміну від хворих на ХГС без СП відбувається суттєве зниження концентрації холестерину сироватки крові і зростання вмісту тригліцеридів та збільшення інтенсивності перекисіндукованої хемілюмінесценції сироватки крові. Під час численних досліджень встановлено, що вказаний спосіб є вірогідним методом діагностики СП у хворих на ХГС, незалежно від віку, статі хворого та відзначається тільки наявністю жирових крапель в тканині печінки. Спосіб здійснюється таким чином: після визначення лабораторних показників у хворих на ХГС проводять обчислення двох рівнянь: S1=7,90*А+5,77*В+0,86*С-29,82 S2=10,03*А+3,66*В+0,52*С-29,36 де: А - вміст холестерину (мкмоль/л); В - вміст тригліцеридів (мкмоль/л); С - інтенсивність перкисіндукованої ХЛ сироватки крові (ум.од.), причому при перевищенні показника S1 над S2 у хворого на ХГС констатують наявність СП. При розробці заявленого способу для його клінічного і патогенетичного обґрунтування було обстежено 44 хворих на ХГС у віці від 19 до 66 років, з яких 34 - чоловіки та 10 - жінок. Діагноз ХГС встановлений на підставі комплексу клінікобіохімічних показників, підтверджувався визначенням антитіл-анти-HCV і полімеразною ланцюговою реакцією - HCV-RNA, проведенням УЗД органів черевної порожнини з визначенням розмірів печінки, її ультразвукової щільності, стану судин, жовчовивідних шля хів. Для виключення вірусних гепатитів іншої етіології проводилось дослідження HbsAg, HbeAg, анти - HbeAg, анти - Hbclg М, анти Нbс сумарні, анти - Hbs, анти - HDV. Біопсія печінки проводилась під контролем УЗД під місцевою анестезією. Для фарбування гістологічних зразків нами були використані методи фарбування: гематоксиліном і еозином, пікрофуксином за Ван Гізон, визначення СП печінки та його ступеней за методикою [Hornboll P., Olsen T.S. Fatty changes in the liver: the relation to age, overweight and diabetes mellitus // Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. 1982. - May; 90(3). - P. 199 – 205], де 1 ступінь СП коли жирові вакуолі визначаються в 1/3 гепатоци 6 тів, 2 ступінь - жирові вакуолі визначаються більш ніж в 1/3 гепатоцитів і 3 ступінь - жирові вакуолі мають місце більш ніж в 2/3 гепатоцитів. Стадія фіброзу визначалась за METAVIR [The French METAVIR Cooperative Study Group. Intraobserver and interobserver variations in liver biopsy interpretation in patients with chronic hepatitis С // Hepatology. - 1994. - N 20. - P. 15 – 20], індекс гістологічної активності за Knodell R.G. et al. [Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C. et al. Formulation and application of a numeral scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis // Hepatology. - 1981. - №1. - P. 431 -435]. Група хворих на ХГС була розподілена на 2 групи за ознаками активності процесу. До групи із малою активністю ХГС (ІГА за Knodell 1-8 балів) увійшло 27 (61,4%) чоловік, з помірною активністю (ІГА за Knodell 9-15 балів) - 17 (38,6%). Серед 44 обстежених до групи із стадією фіброзу F0 - 4 хворих (9,1%), F1 - 12 (27,3%), F2 - 11 (25,0%), F3 - 10 (22,7%), F4 - 7 (15,9%) хворих на ХГС. Нами також для оцінки вираженості стеатозу у хворих на ХГС був використаний спеціалізований пакет прикладних програм "Morpholog" (Овчаренко В.В., Маврич В.В., 2003; свідоцтво про реєстрацію авторського права №9604), який був створений на кафедрі нормальної анатомії людини ЛДМУ (завідувач - професор В.Г. Ковешніков). Отримані в результаті роботи програми дані морфометричного дослідження експортувалися до програми Excel для подальшої статистичної обробки. В кожному отриманому зображенні гістологічного препарату визначались такі параметри: питома площа відкладення ліпідних гранул (ЛГ) в гістологічних зрізах печінки хворих на ХГС (ППЛГ), кількість гепатоцитів в обстеженій ланці часточок, середня площа ліпідних гранул на 1 гепатоцит (СПЛГ). ППЛГ була отримана діленням площі відкладень ЛГ в досліджуваній ланці тканини печінки на загальну площу цієї ланки. СПЛГ була обчислена шляхом діленням площі ЛГ на кількість гепатоцитів в цієї ж ланки печінки. Всі морфометричні дослідження проводились в 3 зонах часточок: центролобулярній, периферійній і портальній. Стан ліпідного обміну оцінювали визначенням вмісту холестерину уніфікованим методом Ілька та тригліцеридів, які визначалися уніфікованим методом по реакції з ацетилацетоном [Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / Под ред. проф. В.В. Меньшикова. -М.: Медицина, 1987.- 368с.]. Баланс «перекисне окислення ліпідів - антиоксидантна система» в сироватці крові у хворих на ХГС оцінювали за показниками перекисіндукованої хемілюмінесценції сироватки крові [Сидорик Е.П., Баглей Е.А., Данко М.И. Био хемилюминесценция клеток при опухолевом процессе. - К.: На ук. Думка, 1989.-219с.]. Контроль лабораторних показників ліпідного обміну і перекисної ХЛ проводився за результатами обстеження 32 практично здорових осіб (донорів крові). Віковий і статевий склад груп співставлення суттєво не відрізнявся. Статистичну обробку отриманих матеріалів проводили на комп'ютері Athlon ХР 2500+ за допомогою програми Statistica 6. 7 32752 В результаті проведених досліджень нами було встановлено, що в загальній групі хворих на ХГС СП був верифікований у 26 з 44 пацієнтів (59,1%). За стадіями стеатозу за Hornboll група хворих на ХГС була розподілена таким чином: 1 ступінь стеатозу - 6 хворих (2,6%), 2 ступінь - 11 (25,0%), 3 ступінь - 9 (20,5%), відсутність стеатозу - 18 хворих (40,9%). В гр упі з мінімальною гістологічною активністю (1-8 балів за Knodell) стеатоз був у 14 з 27 хворих (51,9%), в гр упі з помірною активністю - у 12 з 17 (70,6%). Для створення діагностичного алгоритму лабораторної верифікації наявності СП у хворих на ХҐС нами проведені морфобіохімічні дослідження і запропоновані дискриминантні рівняння: S1=7,90*А+5,77*В+0,86*С-29,82 S2=10,03*А+3,66*В+0,52*С-29,36 де: А - вміст холестерину (мкмоль/л); В - вміст тригліцеридів (мкмоль/л); С - інтенсивність перекисіндукованої ХЛ сироватки крові (ум.од.), причому при перевищенні показника S1 над S2 у хворого на ХГС констатують наявність СП. Поряд з використанням запропонованого способу і проведенням визначення показників ліпідного обміну і перекисіндукованої хемілюмінесценції сироватки крові у хворих на ХГС паралельно, згідно способу-найближчого аналога, визначався в сироватці крові вміст тригліцеридів. Було встановлено, що в гр упі пацієнтів із СП концентрація тригліцеридів сироватки крові складала 3,44±0,18мкмоль/л, при відсутності СП у хворих на ХГС - 1,98±0,13мкмоль/л відповідно (р