Штам bacillus sp. 01-1 для захисту рослин від патогенних мікроміцетів та підвищення врожайності сільськогосподарських культур, вирощуваних в умовах східного та південного степу україни

Штам Bacillus sp. 01-1 для захисту рослин від патогенних мікроміцетів та підвищення врожайності сільськогосподарських культур, вирощуваних в умовах східного та південного Степу України, № Bacillus sp. ІMB В - 7210 у колекції Інституту мікробіології і вірусології НАНУ та № Bacillus sp. В-165 у колекції Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН. (19) (21) u200909345 (22) 11.09.2009 (24) 26.04.2010 (46) 26.04.2010, Бюл.№ 8, 2010 р. (72) ПАРХОМЕНКО ТЕТЯНА ЮРІЇВНА, МЕЛЬНИЧУК ТЕТЯНА МИКОЛАЇВНА, ТАТАРИН ЛЮДМИЛА МИКОЛАЇВНА, АЛЕКСЕЄНКО НАДІЯ ВОЛОДИМИРІВНА (73) ПІВДЕННА ДОСЛІДНА СТАНЦІЯ ІНСТИТУТУ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКОЇ МІКРОБІОЛОГІЇ УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК 3 49158 фітопатогенів та вивчення особливостей і закономірностей взаємодії їх з рослинами дозволить вирішувати проблеми розробки і ефективного використання нових екологічно безпечних методів захисту рослин. Необхідно зазначити, що різноманітні ґрунтово-кліматичні умови вирощування сільськогосподарських культур вимагають пошуку ефективних штамів саме для специфічних умов різних регіонів України. Технічним результатом корисної моделі є підвищення ефективності захисту рослин від фітопатогенних мікроміцетів і підвищення урожайності сільськогосподарських культур, вирощуваних в умовах східного і південного Степу України. В основу корисної моделі поставлена задача одержання ефективного штаму роду Bacillus для захисту рослин від патогенних мікроміцетів та підвищення врожайності сільськогосподарських культур, вирощуваних в умовах східного та південного Степу України, що є енергозберігаючим засобом і зумовлює відмову або зниження доз хімічних засобів захисту рослин, а також покращення фітосанітарного стану ґрунту та зниження антропогенного навантаження на довкілля. Поставлена задача вирішена шляхом виділення у 2001 році на середовищі сусло-агар мікробіологічним методом з епіфітної мікрофлори насіння помідорів сорту Шанс штаму Bacillus sp. 01-1, який проявляє антагоністичну активність до фітопатогенних мікроміцетів та позитивно впливає на розвиток рослин, вирощуваних в умовах східно 4 го та південного Степу України. Виділений мікробіологічним методом штам Bacillus sp. 01-1 має такі морфологічні, фізіологічні та біохімічні властивості, які переважно співпадають з властивостями штаму Bacillus subtilis D-26. Колонії штаму 01-1 на МПА: форма - округла, профіль - бугристий, край - велико-зубчатий, поверхня - складчаста, розмір - середній (діаметр від 2 до 4мм), оптичні властивості - не прозора, матова, колір - світло-коричневий, структура - зверху утворюється плівка, легко знімається з агару. Мікроскопіювання культур на фазовоконтрастному мікроскопі (збільшення у 600 разів) 3-добової культури мікроорганізмів показало, що багато вільних спор, клітини одиничні, іноді спарені. Спори утворюються з одного з кінців палички, займають приблизно ¼ довжини клітини. При мікроскопіювані на 5 добу розвитку штаму в полі зору мікроскопу знаходиться багато вільних спор і лише 1-2 клітини. Ріст бактерій при посіві штрихом на МПА добре, колір штриху світло-бежевий. В лабораторних дослідах визначено, що штам Bacillus sp. 01-1 не поступається антагоністичною активністю та спектром дії на фітопатогенні гриби штаму Bacillus subtilis D-26. Так, встановлено, що штам Bacillus sp. 01-1 пригнічує розвиток Xanthomonas campestris В-1060, Fusarium oxysporum var. orthoceras F-55800, F. oxysporum 2246, 2271, F. solani, 73, F. avenaceum (штами фітопатогенів отримані з Інституту мікробіології і вірусології НАНУ) (табл. 1, 2). Таблиця 1 Вплив нового штаму Bacillus sp. 01-1 на розвиток фітопатогенів (лабораторний дослід, середовище м'ясо-пептоний агар) Досліджувані штами Bacillus subtilis D-26 Bacillus sp. 01-1 3 доба 5 доба 3 доба 5 доба Зона пригнічення росту мікроорганізмів, що тестуються, мм Fusarium Xanthom onas oxysporum var. F. solani, 73 F. avenaceum campestris В-1060 orthoceras F55800 20,0 5,5 3,5 11,0 19,0 5,0 6,5 10,0 16,0 6,5 7,0 11,0 21,0 6,0 7,5 9,5 Таблиця 2 Вплив штаму Bacillus sp. 01-1 на ріст мікроміцетів виду Fusarium oxysporum (лабораторний дослід, 2001, середовище сусло-агар) Досліджувані штами Bacillus subtilis D-26 Bacillus sp. 01-1 Зона пригнічення росту мікроорганізмів, що тестуються, мм Fusarium oxysporum var. Fusarium oxysporum, 2246 Fusarium oxysporum, 2277 orthoceras F-55800 14,0 6,5 16,0 16,0 7,0 13,5 В польовому досліді з кукурудзою гібриду сорту Луганський 287MB показано зниження поширення пухирчастої сажки під впливом біопрепарату та досліджуваних штамів (табл. 3). Поширення хвороби у контрольному варіанті складало 3,3%, при використанні біополіциду 2,2%, при використанні штаму Bacillus subtilis D26 - 1,1%. Не зареєстровано хвороби у варіанті з використанням штаму Bacillus sp. 01-1. 5 49158 6 Таблиця 3 Поширення пухирчастої сажки кукурудзи гібриду Луганський 287 MB у фазі повної стиглості (польовий дослід,2005 рік, чорнозем звичайний, Луганський Інститут селекції і технологій) Варіант Контроль Біополіцид Bacillus sp. 01-1 Bacillus subtilis D-26 HIP05 I 3,3 0 0 0 Зазначена вище сукупність суттєвих ознак штаму Bacillus sp. 01-1 підтверджує можливість одержання очікуваного результату. Характеристика штаму бактерій Bacillus sp. 01-1. Номенклатурні дані: рід - Bacillus; вид - не визначений, депонований у колекції Інституту мікробіології і вірусології НАНУ під номером Bacillus sp. ІMB В - 7210, у колекції ІСГМ УААН під № Bacillus sp. В-165. Походження штаму. Штам Bacillus sp. 01-1 було отримано у Південному філіалі Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН з епіфітної мікрофлори насіння помідорів сорту Шанс, насіння було відібрано з плодів помідорів контрольного варіанта польового досліду у Кримській дослідній станції овочівництва і баштанництва Інституту південного овочівництва і баштанництва УААН у 2001 році. Спосіб виділення. Штам виділений методом посіву граничних розведень з епіфітної мікрофлори насіння помідорів Пархоменко Т.Ю. Штам ідентифікований Пархоменко Т.Ю, Мельничук Т.М., Татарин Л.М., Алєксєєнко Н.В. по методичних рекомендаціях з первинної ідентифікації перспективних спорових штамів мікроорганізмівантагоністів Інституту мікробіології та вірусології НАНУ [Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных. / Смирнов В.В., Резник С.Р., Сороулова И.Б., 1983] та визначником Берджи [Определитель бактерий Берджи. В 2-х томах. Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хорста, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. - М.: Мир, 1997] і, згідно сучасній систематиці, визначений як вид Bacillus sp., порівняний із типовим штамом бактерій Bacillus subtilis D-26, який депоновано у колекції в Державній науковій установі Всеросійський науково-дослідний Інститут сільськогосподарської мікробіології РАСГН під номером 158. Біотехнологічна характеристика. Штам Bacillus sp. 01-1 знижує ураження кореневими гнилями пшениці, кукурудзи, помідорів, сприяє зниженню ураження рослин кукурудзи пухирчастою сажкою, пригнічує розвиток мікроміцетів на насінні пшениці, нуту і помідорів, що сприяє оздоровленню насіннєвого матеріалу, підвищенню якості насіння, кращому розвитку розсади і підвищенню урожайності рослин. Культурально-морфологічні ознаки. Колонії штаму 01-1 на МПА: форма - округла, профіль Поширення хвороби, % II IІІ 3,3 3,3 6,6 0 0 0 3,3 0 середнє 3,3 2,2 0 1,1 2,50 бугристий, край - велико-зубчатий, поверхня складчаста, розмір - середній (діаметр колонії від 2 до 4мм), оптичні властивості - не прозора, матова, колір - світло-коричневий, структура колонії - зверху утворюється плівка, легко знімається з агару. Фізіолого-біохімічні властивості. Мікроскопіювання культур на фазово-контрастному мікроскопі (збільшення у 600 разів) 3-добової культури мікроорганізмів показало, що багато вільних спор, клітини одиничні, іноді спарені. Спори утворюються з одного з кінців палички, займають приблизно ¼ довжини клітини. При мікроскопіювані на 5 добу розвитку штаму в полі зору мікроскопу знаходиться багато вільних спор и лише 1-2 клітини. Ріст бактерій при посіві штрихом на МПА добрий, колір штриху світло-бежевий. Штам 01-1 засвоює глюкозу, сахарозу, манніт, слабко засвоює крохмаль, етанол, рафінозу, не засвоює цитрати. При культивуванні на МПБ утворює плівку на поверхні середовища, може утворюватись невеликий осад, утворює аміак, не утворює індол. Росте при 37°С. Тип засвоєння глюкози за бродильно-окисним тестом Хью-Лейфсона - бродильного типу. Продукує каталазу. На лакмусовому молоці зміщує рН в кислу сторону - лакмусове молоко червоніє. Штам здатен гідролізувати казеїн - на молочному агарі під його дією виникала прозора зона гідролізу і складала 6 мм. Позитивно фарбується по Граму. Ознаки штаму стійкі. Культура Bacillus sp. 011, згідно висновку, який видано для депонування культури Інститутом мікробіології і вірусології НАНУ, належить до авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи досліджених теплокровних тварин. Згідно даних щодо відсутності вірулентності штам є непатогенним і по ступені небезпеки мікроорганізмів відноситься до 4-го класу малонебезпечних, практично без алергенної та загально токсичної дії мікроорганізмів. Культуру зберігають на гороховому агарі з сахарозою при температурі 4-5°С. Пересівають один раз у 3 місяці. Штам використовують для передпосівної інокуляції насіння сільськогосподарських культур у вигляді водної суспензії, яку отримують шляхом змиву біомаси штаму з агарового поживного середовища 5-10мл води. 7 49158 Передпосівна обробка насіння помідорів сорту Шанс штамом Bacillus sp. 01-1 сприяє підвищенню біомаси проростків, не знижуючи при 8 цьому енергію проростання та схожість насіння (табл. 4). Таблиця 4 Вплив обробки штамами Bacillus subtilis D-26 і Bacillus sp. 01-1 на посівні властивості насіння помідорів сорту Шанс (лабораторний дослід) Варіант досліду Контроль сухий Контроль (вода) Bacillus subtilis D-26 Bacillus sp. 01-1 HCP05 Енергія проростання, % середня до контролю 92,5 100 90,00 97 89,00 96 88,50 96 5,98 6,64 Біомаса проростка середня, мг % до контролю 12,54 100 12,06 96 11,26 90 14,19 113 1,23 9,54 Передпосівна інокуляція штамом Bacillus sp. 01-1 насіння кукурудзи гібриду Луганський 287 MB сприяє розвитку рослин. Так, у вегетаційному досліді під впливом штаму Bacillus sp. 01-1 істотно зростає висота рослин - на 5,3см; сира маса Схожість, % середня до контролю 98,3 100 98,5 100 97,3 99 97,0 99 2,56 2,62 на 29%; суха маса надземної частини - на 19% та суха маса кореневої системи - на 35% в порівнянні до контролю і перевищує показники штаму В. subtilis D-26 (табл. 5). Таблиця 5 Вплив передпосівної інокуляції штамами мікроорганізмів-антагоністів на розвиток рослин кукурудзи гібриду Луганський 287 MB (вегетаційний дослід, вермікуліт, повне поживне середовище Прянішнікова, теплиця, 2005 р., ПДС ІСГМ УААН) Варіант досліду Контроль (вода) В. subtilis D-26 Bacillus sp. 01-1 HCP05 Висота рослин, см 28,30 32,01 33,59 3,38 Маса надземної частини, г Сира 1,28 1,57 1,63 0,30 Можливе використання штаму для завчасної обробки насіння сільськогосподарських культур з метою зменшення чисельності мікроміцетів в епіфітній мікрофлорі насіння, яка є основним резервуаром мікроорганізмів для формування як епіфітної мікрофлори проростку, так і ризосфери. Отже, зменшення чисельності мікроміцетів в епіфітній мікрофлорі є шляхом до збереження якості насіння та його оздоровлення. Встановлено пригнічення розвитку мікроміцетів на поверхні насіння нуту сорту Александрит шляхом його обробки штамом Bacillus sp. 01-1 в Суха Суха маса кореневої системи, г 0,14 0,17 0,17 0,03 0,15 0,19 0,20 0,03 порівнянні з хімічним фунгіцидом Вітаваксом-200 ФФ і референтним штамом. Зміни чисельності мікроміцетів та бактерій на насінні перевіряли через добу, місяць та півроку збереження інокульованого насіння (табл. 6). У варіанті з Bacillus sp. 01-1 виявлено найбільш активний антагонізм до мікроміцетів. За 6 місяців їх чисельність зменшилась в порівнянні з контролем на 92,5%. Обробка насіння Вітаваксом-200 ФФ знижувала кількість мікроміцетів в порівнянні з контролем на 73,6%. Таблиця 6 Вплив мікроорганізмів-антагоністів фітопатогенів на чисельність мікроміцетів в епіфітній мікрофлорі насіння нуту сорту Александрит при зберіганні, тис. КУО/г насіння Варіант досліду Контроль Вітавакс-200 ФФ Bacillus subtilis D-26 Bacillus sp. 01-1 1 доба 6,0±0,51 2,2±0,70 2,1±0,44 0,5±0,10 1 місяць 6,6±0,47 2,3±0,52 2,3±0,18 0,8±0,10 6 місяців 5,3±0,27 1,4±0,22 1,7±0,38 0,4±0,35 9 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 49158 Підписне 10 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601